分離自土壤Paraboeremia屬真菌一新記錄種

王坤英 姜于蘭

摘 要：采集貴州貴陽花溪濕地公園山林土壤，分離得到Paraboeremia屬真菌一新記錄種，對該種結(jié)合形態(tài)特征及分子系統(tǒng)學(xué)分析基于ITS，LSU，rpb2和tub四個基因片段，在系統(tǒng)進化樹上，該標本HGUP1801與采自荷蘭卷柏葉片上的Paraboeremia selaginellae聚集在一起，并且形成很高的支持率，將該種定名為Paraboeremia selaginellae。研究標本保存在貴州大學(xué)植物病理學(xué)實驗室（HGUP）。

關(guān)鍵詞：亞隔孢殼科;形態(tài)學(xué);分子系統(tǒng)學(xué);分類

中圖分類號：S432.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）01-0006-04 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.01.002

Paraboeremia Q.Chen & L.Cai屬于Ascomycota子囊菌門，座囊菌綱Dothideomycetes，格孢腔菌目Pleosporales，亞隔孢殼科Didymellaceae。截止目前，該屬已報道6種，包括3個新組合種，新組合種是由莖點霉屬Phoma Fr.和莖點霉屬的有性屬亞隔孢殼屬Didymella Sacc.移入該屬[1]。Chen等[1]以Paraboeremia selaginellae為模式種建立該屬，其中包括Paraboeremia adianticola和Paraboeremia putaminum兩個結(jié)合新種。 Jiang等[2]報道了Paraboeremia屬的三個新種，Paraboeremia camelliae、P.litseae和P.oligotrophica。

莖點霉屬由Fries（1821）建立，該屬真菌是一類重要的植物病原菌，分布廣泛且具有豐富的多樣性，主要引起植物葉片及莖桿上的病斑，可導(dǎo)致作物產(chǎn)量嚴重損失，其中一些物種還被列為檢疫性真菌，對該屬真菌進行準確的分類鑒定非常重要[3]。但傳統(tǒng)上區(qū)分該屬的形態(tài)特征相當有限，主要包括分生孢子器、產(chǎn)孢細胞和分生孢子的形狀和大小，而這些相對簡單的無性形態(tài)特征不足以對相似的不同物種進行辨別。至2004年，在MycoBank中已記錄有3000多個莖點霉屬的物種名稱。究其原因，除了形態(tài)特征在物種區(qū)分的局限性外，使用傳統(tǒng)的寄主相關(guān)命名法也是產(chǎn)生如此大量名稱的重要原因。

近些年來，分子系統(tǒng)學(xué)技術(shù)融入莖點霉屬Phoma、種以及近似屬、種的分類鑒定中[1，3-5]。De Gruyter等[6]根據(jù)對莖點霉屬和相關(guān)無性屬分子系統(tǒng)學(xué)的研究結(jié)果，對莖點霉屬復(fù)合群進行了重新劃分，根據(jù)模式屬Didymella建立亞隔孢殼科Didymellaceae，包括了廣義莖點霉和其他相關(guān)屬。Aveskamp等[3]研究同樣發(fā)現(xiàn)，莖點霉屬是一個多系類群，傳統(tǒng)分類上歸于該屬的物種在系統(tǒng)發(fā)育研究中分散在至少6個科中，他們通過進一步研究建議，以莖點霉屬模式種草莖點霉Phoma herbarum Westend.所在的單系分支作為狹義莖點霉屬，歸屬于亞隔孢殼科，包含莖點霉屬、殼二孢屬Ascochyta Libert、亞隔孢殼屬 Didymella等重要病原真菌類群。De Gruyter等和Aveskamp等[7-8]通過系統(tǒng)學(xué)分析對莖點霉屬內(nèi)物種的分類地位做了部分修訂，在澄清亞隔孢殼科內(nèi)屬間關(guān)系上已有重要進展，但仍有較多物種的分類情況尚未解決。Chen等根據(jù)形態(tài)特征的觀察以及基于LSU，ITS，tub2和rpb2四個序列位點的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，將亞隔孢殼科劃分為17個有較高支持率的單系屬，包括Paraboeremia等9個新屬。Paraboeremia屬真菌分布廣泛，可生存于腐生的葉片、土壤、巖石塊、發(fā)病葉片、果樹的根際周圍等[2，9]。該屬的形態(tài)特征是產(chǎn)孢細胞球形或翁形，分生孢子無隔，具油滴，橢球形，直或彎曲，無色透明至淺綠。作者在土壤真菌調(diào)查中，分離獲得一株疑似莖點霉屬真菌，依據(jù)其他研究者對于該屬及相似屬研究中采用的基因條形碼[10]，選擇ITS、LSU、tub、rpb2四個基因片段，利用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)合形態(tài)分類方法對該菌株進行系統(tǒng)分類研究。

1 材料與方法

1.1 土壤采集

實驗材料采自貴陽花溪濕地公園山林土，未被破壞松樹林土壤將采集的研究標本置于塑料袋或牛皮紙袋，貼標簽（注明采集地、采集時間、植被、土壤類型、海拔、經(jīng)緯度等信息）后密封。

1.2 土壤真菌的分離純化、保存

每份土樣稱取10 g，稀釋100倍后涂抹于孟加拉紅培養(yǎng)基上，每份土樣3個重復(fù)分別于常溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～7 d后，挑取單菌落于含有青霉素的PDA平板上，獲得純菌種，無菌操作。無菌水冷存管保存：將經(jīng)適宜培養(yǎng)的菌種塊（3～4塊）置于盛有滅菌水的冷存管中，密封后置于4℃～10℃的冰箱中，每一菌種4個備份，無菌操作。分離菌株保存在貴州大學(xué)植物病理學(xué)實驗室（HGUP），菌株號為HGUP1801。

1.3 形態(tài)鑒定

將保存的菌株活化，接種到產(chǎn)孢培養(yǎng)基上（OA），待菌株產(chǎn)孢。然后使用OLYMPUSBH體視鏡制片，使用OLYMPUSBH照相顯微鏡進行拍照。

1.4 DNA提取和PCR反應(yīng)

菌株總DNA提取自純培養(yǎng)物：用滅菌的手術(shù)刀刮取2～3 w的純培養(yǎng)物菌絲體50 mg，按真菌DNA試劑盒Fungal gDNA Kit GD2416（Biomiga 公司生產(chǎn)）說明書提取，獲得的DNA溶液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。選擇引物ITS4/ITS5[11]，LROR/LR5[12]，RPB2-5F/RPB2-7cR[13]和TUB2Fd/TUB4Rd[6]。本研究使用25 μL PCR反應(yīng)體系，包括：正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，2xPCR Master Mix 12.5 μL。將該種所獲得的DNA序列上傳至GenBank（表1）。

1.5 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

將用于建樹的Fasta文件（14個序列），經(jīng)Bioedit進行序列比對及手工校正后，保存為Fasta格式。將Fasta格式文件在網(wǎng)絡(luò)軟件ALTER（Alignment Transformation EnviRonment，http：//sing.ei.uvigo.es/ALTER/）中轉(zhuǎn)換為PHY格式;基于CIPRES SCIENCE GATEWAY （http：//www.phylo.org/）網(wǎng)絡(luò)平臺，使用RAxML-HPC BlackBox（8.2.10）軟件，構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Treeview軟件查看tree格式文件，在AI（Adobe Illustrator CS5）軟件編輯菌株號和自舉支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

以Vacuiphoma bulgarica（CBS 357.84）為外群的加合基因樹中，Paraboeremia屬以100%的支持率分成兩支，分子系統(tǒng)學(xué)研究表明Paraboeremia selaginellae HGUP1801以94%的支持率與P.selaginellae CBS122.93聚集形成一支。

2.2 形態(tài)描述

在燕麥（OA）培養(yǎng)基上，菌落生長較快，圓形，具大量透明、絮狀氣生菌絲，分生孢子器埋生或半埋生在靠近邊緣的同心環(huán)上，灰橄欖色，背面同色，27℃培養(yǎng)2 w，直徑達4 cm。分生孢子器黑棕色，單生，球形，近球形或翁形，埋生或半埋生，具有單個孔口，100～270 μm× 100～240 μm，分生孢子器壁擬薄壁組織狀，壁厚，由透明棕色細胞構(gòu)成，3～4層細胞，外1～2層呈棕色，厚度達13.4～16.3 μm。分生孢子單胞，圓柱形至橢圓形，平滑，綠色，偶爾輕微彎曲，2.5～4 × 1 ～2 μm，具1～2個油滴。

采自貴陽花溪濕地公園山林土，106°E，26°N，海拔1140 m。采集時間：2017年8月，采集人：王坤英，菌株號：HGUP1801。

3 結(jié)論與討論

目前全世界報道Paraboeremia屬6個種，由于原始標本的丟失，在荷蘭卷柏（Selaginella sp.）葉片上分離得到新的模式標本[14]。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，采自我國貴州貴陽花溪山林土的Paraboeremia與采自荷蘭卷柏葉片上的Paraboeremia selaginellae聚集在一起，且二者具有相同的形態(tài)特征，分生孢子大小相似（2.5～4 × 1～2 μm ?VS 2.5～5 × 1～2 μm），但采自荷蘭卷柏葉片上的Paraboeremia selaginellae具有較大的分生孢子器（130～360×120～320 μm ?VS 100～270×100～240 μm）。

本文菌株采自貴州貴陽花溪濕地公園山地土，花溪濕地公園是典型的城市濕地，具有河流、農(nóng)田和庫塘等多類型濕地，生物多樣，生態(tài)良好，屬于亞熱帶濕潤氣候。土壤微生物生物量的多少是土壤活性大小的標志[15]，研究土壤微生物具有重要的意義。

綜上所述，該研究中采自中國貴州的Paraboeremia的標本在形態(tài)上和系統(tǒng)發(fā)育上均與Paraboeremia selaginellae相同，因此，鑒定該標本的分類地位為Paraboeremia selaginellae （Sacc.）Q.Chen & L.Cai。

參 考 文 獻：

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