牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評價體系的建立

張肖建 張巖巖 高晗 孫福仁 李軍山 李振江

摘要：為了提高牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，制備了15批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，通過對牛蒡苷含量及指紋圖譜的研究，建立了牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評價體系。第一煎加入8倍水，浸泡30 min，煎煮20 min;第二煎加入6倍水，煎煮15 min，經(jīng)濃縮、干燥后制得標(biāo)準(zhǔn)湯劑，應(yīng)用HPLC法測定牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中牛蒡苷的含量及指紋圖譜。結(jié)果顯示：15 批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中牛蒡苷的轉(zhuǎn)移率為21.3%～33.3%，平均轉(zhuǎn)移率為27.3%，出膏率為7.1%～11.3%，平均出膏率為9.4%;通過中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，確定了11 個共有峰，通過對照品指認(rèn)出了5個色譜峰，分別為綠原酸、咖啡酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、牛蒡苷、牛蒡苷元。所建立的評價體系，牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備規(guī)范，樣品質(zhì)量穩(wěn)定，指紋圖譜相似度大于0.94，對提高牛蒡子配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有一定的參考價值。

關(guān)鍵詞：醫(yī)藥工程;牛蒡子;標(biāo)準(zhǔn)湯劑;牛蒡苷;出膏率;指紋圖譜

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A doi： 10.7535/hbgykj.2019yx01009

ZHANG Xiaojian，ZHANG Yanyan，GAO Han，et al.Establishment of quality evaluation system for standard decoction of Arctii fructus[J].Hebei Journal of Industrial Science and Technology，2019，36（1）：47-52.Establishment of quality evaluation system for

standard decoction of Arctii fructus

ZHANG Xiaojian1， ZHANG Yanyan1， GAO Han1， SUN Furen1， LI Junshan1，2， LI Zhenjiang1

（1.Shineway Pharmaceutical Group Limited，Shijiazhuang， Hebei 051430， China;2.TCM Formula Granule Engineering Technology Research Center of Hebei， Shijiazhuang， Hebei 050091， China）

Abstract：In order to improve the quality standard of standard decoction of Arctii fructus， 15 batches of Arctii fructus standard decoction is prepared. The quality evaluation system of Arctii fructus standard decoction is established by studying the content of Arctii fructus glycoside and its fingerprint. Firstly， 8 times of water is added， then soaking for 30 minutes and frying for 20 minutes. Secondly， 6 times of water is added， then frying for 15 minutes. The standard decoction of Arctii fructus is prepared by using standardization method of concentration and drying， and the content of Arctiin and the fingerprint in the standard decoction are determined by HPLC. The results show that the transfer rate of Arctiin in the 15 batches of standard decoction is 21.3%～33.3%，and the average transfer rate is 27.3%. The extractum is 7.1%～11.3%， and the average ointment rate is 9.4%. The fingerprints are determined by similarity evaluation system of Chinese herbal medicine fingerprints. Five of the 11 common peaks representing chlorogenic acid， caffeic acid， 3，5-O-dicaffeoylquinic acid， arctiin and arctigenin are identified. In this study， preparation of Arctii fructus standard decoction meets the specifications， sample quality is stable， and fingerprint similarity is greater than 0.94. It has certain reference value for improving the quality standard of Arctii fructus formula granules.

Keywords：pharmaceutical engineering; Arctii fructus; standard decoction; arctiin; ointment rate; fingerprint

牛蒡子始載于《本草圖經(jīng)》，為菊科牛蒡Arctium lappa L.的干燥成熟果實(shí)[1]，性寒，味苦，歸肺、胃經(jīng)，具有疏風(fēng)散熱、利咽解毒、宣肺透疹的功效。其在中國廣泛分布，主產(chǎn)于東北、華北、西南地區(qū)，目前在重慶的潼南、西陽、江津等地均有大面積的種植基地。甘肅是牛蒡子的主產(chǎn)地，產(chǎn)量占全國的50%～60%[2-3]。近年來，科研人員關(guān)于牛蒡子化學(xué)活性成分方面的研究取得了重要進(jìn)展，許多重要的藥理和生理活性被發(fā)現(xiàn)，如抗衰老活性、抗腫瘤活性、降血壓、降血糖，以及對急慢性腎炎等方面的作用。

第1期張肖建，等：牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評價體系的建立河北工業(yè)科技第36卷中藥配方顆粒是由現(xiàn)代工藝制備的供臨床配伍使用的顆粒，近幾年產(chǎn)量增長迅速。目前，牛蒡子配方顆粒沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)報(bào)道也較少。筆者依照《中藥配方顆粒管理辦法》（征求意見稿）和《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定要求》（征求意見稿），收集了幾個不同產(chǎn)地的牛蒡子藥材，通過制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑及建立檢測方法，測定了牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中牛蒡苷的含量并計(jì)算了轉(zhuǎn)移率，同時，對15批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行了HPLC指紋圖譜的研究，以期為牛蒡子配方顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)[4-6]。

1材料

1.1主要儀器

Shunliu-12N型冷凍干燥機(jī)，南京順流儀器有限公司提供;DHG-9140A型熱風(fēng)循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司、太倉精宏儀器設(shè)備有限公司提供;LC-20A高效液相色譜儀，島津儀器設(shè)備有限公司提供;Agilent Zorbax Eclipes C18色譜柱（250 mm×4.6 mm 5 μm）;AE 240 型電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司提供;KH-3200 E超聲波清洗器，江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供。

1.2試藥

牛蒡苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號為110819-201812），綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號為110753-201716），3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號為111782-201706），咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品（批號為110885-201703），均購自中國食品藥品檢定研究院;牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品（批號為HA010075198），購自寶雞市辰光生物科技有限公司;甲醇、乙腈，色譜純;其他試劑均為分析純。

1.3樣品

采集了5個產(chǎn)地的15批牛蒡子藥材，按2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定制成飲片，具體來源見表1。

2方法與結(jié)果

2.1牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

稱取飲片100 g，加水煎煮2次。第一煎加水800 mL，浸泡30 min，沸騰后煎煮20 min;第二煎加水600 mL，沸騰后煎煮15 min。合并煎液，用48 μm（300目）篩網(wǎng)趁熱過濾。將濾液迅速冷卻，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（65 ℃，-0. 09 MPa）濃縮至適當(dāng)相對密度的流浸膏，經(jīng)冷凍干燥，制備成標(biāo)準(zhǔn)湯劑干燥粉末[7-10]。

2.2牛蒡子及標(biāo)準(zhǔn)湯劑中牛蒡苷含量的測定

2.2.1色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipes C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（二者體積比為40∶60），檢測波長為280 nm。按牛蒡苷峰計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于1 500。

2.2.2參照物溶液的制備

取牛蒡苷參照物，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL含0.5 mg的參照物溶液，即得。

2.2.3供試品溶液的制備

1）牛蒡子飲片供試品溶液取牛蒡子飲片粉末（過3號篩），精密稱定0.5 g，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇約45 mL，超聲（功率150 W，頻率20 kHz）20 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2）牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液取牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑干膏粉，研細(xì)，精密稱定0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，稱重，超聲提取20 min（功率為150 W，頻率為20 kHz）后，室溫放置，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得[11-14]。

2.2.4線性關(guān)系考察

精密稱取牛蒡苷參照物62.51 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，作為牛蒡苷參照物儲備液。分別精密量取儲備液0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL，置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容。分別精密吸取10 μL不同質(zhì)量濃度的參照物溶液，注入高效液相色譜儀，測定相應(yīng)峰面積。以參照物質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，測定的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：在0.048～2.393 μg/mL范圍內(nèi)，牛蒡苷線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=420 783X+15 251，r=0.999 9。

2.2.5精密度實(shí)驗(yàn)

取牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定牛蒡苷的峰面積，計(jì)算藥材中牛蒡苷的含量，測得樣品中牛蒡苷峰面積的RSD值為0.30%，說明儀器精密、準(zhǔn)確。

2.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

另取相同供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10 h時注入高效液相色譜儀中測定含量，計(jì)算藥材中牛蒡苷色譜峰面積的RSD值為0.44%，說明供試品溶液在10 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉樣品，依照2.2.3方法制備6份，按上述色譜條件測定，計(jì)算樣品中牛蒡苷含量。結(jié)果表明，6份樣品中牛蒡苷含量的RSD值為0.79%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收實(shí)驗(yàn)

分別稱取含量已知的牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉6份，每份精密稱定0.1 g。按樣品含量的100%加入牛蒡苷參照物，按供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，依照2.2.1項(xiàng)色譜條件測定，計(jì)算各樣品的加樣回收率，結(jié)果見表2。6份樣品的加樣回收率均在95%以上，RSD值為0.81%，表明供試品制備方法的回收率良好。

按照上述含量測定方法，測定15批牛蒡子飲片、牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量，結(jié)果見表3。

2.3出膏率及牛蒡苷含量轉(zhuǎn)移率計(jì)算

根據(jù)凍干得到干膏粉量，計(jì)算各批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率;根據(jù)膏粉和飲片中牛蒡苷含量，計(jì)算各批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的含量轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示，15 批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率范圍為7.1%～11.3%，出膏率平均值為9.4%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為14.2%;牛蒡苷轉(zhuǎn)移率為21.3%～33.3%，平均轉(zhuǎn)移率為27.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為14.3%。

3牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的測定

3.1色譜條件

色譜柱為Agilent C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.2%（體積分?jǐn)?shù)）磷酸水溶液（B）為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為250 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量10 μL[14-16]，流動相洗脫梯度條件見表4。

精密稱定牛蒡苷、牛蒡苷元、綠原酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、咖啡酸對照品，加甲醇制成每1 mL含0.50 mg牛蒡苷、0.10 mg牛蒡苷元、0.30 mg綠原酸、0.03 mg咖啡酸、0.07 mg 3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬幕旌蠈φ掌啡芤?，即得。

3.3供試品溶液的制備

取牛蒡子凍干粉研細(xì)，精密稱定0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取甲醇25 mL，加入錐形瓶中，稱重，超聲處理30 min（250 W，40 kHz）。取出，室溫放置，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾（過0.45 μm膜），取續(xù)濾液，即得。色譜圖見圖1。

3.4方法學(xué)考察

3.4.1精密度考察

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，以牛蒡苷峰為參比峰，計(jì)算其他主要色譜峰的相對保留時間（RRT）及相對峰面積（RPA）。結(jié)果顯示，RRT的RSD值為0.41%，RPA的RSD值為1.3%，相似度為l.00，說明儀器的精密度良好。

3.4.2穩(wěn)定性考察

精密吸取同一供試品溶液，按3.1項(xiàng)色譜條件，分別在0，2，4，6，8，10 h時進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以牛蒡苷為參比峰，計(jì)算其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，RRT的RSD值為0.21%，RPA的RSD值為3.1%，相似度為1.00。說明在10 h內(nèi)，供試品溶液穩(wěn)定。

3.4.3重復(fù)性考察

取標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉樣品，制備6份，按3.1項(xiàng)色譜條件測定，記錄色譜圖。以牛蒡苷為參比峰，計(jì)算其他各主要色譜峰的RRT及RPA。結(jié)果顯示，RRT的RSD值為0.42%，RPA的RSD值為1.9%，相似度為1.00，說明該方法的重復(fù)性良好。

3.5樣品檢測與分析

取15批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑粉末，根據(jù)3.3項(xiàng)所述方法制備供試品溶液，依照3.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，記錄樣品色譜圖。將得到的15批供試品色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）中，通過對各樣品中色譜峰的匹配，生成15批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對照圖譜，確定牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑11個共有峰，見圖2。其中，以牛蒡苷峰為參照峰，計(jì)算11個共有色譜峰的相對峰面積及相對保留時間，見表5和表6。經(jīng)計(jì)算，15批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度均在0.94以上，見表7。

4討論

1）牛蒡苷作為牛蒡子飲片的指標(biāo)成分，是評價牛蒡子飲片質(zhì)量的重要指標(biāo)。牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑由牛蒡子飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥而制成，其質(zhì)量評價應(yīng)以牛蒡苷為指標(biāo)成分。結(jié)果顯示，15批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中牛蒡苷含量的轉(zhuǎn)移率為21.3%～33.3%。

2）通過實(shí)驗(yàn)考察了3種溶液（乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液）、3個流速（0.8，1.0，1.2 mL/min）、3個柱溫條件（25，30，35 ℃）對反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，在乙腈-0.1%磷酸水溶液、1.0 mL/min及25 ℃柱溫條件下所得到的指紋圖譜基線穩(wěn)定、分離度較好，可選用該條件作為牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜檢測的最優(yōu)條件。應(yīng)用中藥指紋圖譜相似度評價軟件檢測可知，15批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的相似度均大于0.94。

3）中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑對于研究配方顆粒具有重要的指導(dǎo)作用，本文根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定要求》（征求意見稿），制備了15批牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，通過對牛蒡苷含量及指紋圖譜的研究，建立了牛蒡子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對提高牛蒡子配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有一定的參考價值。有關(guān)牛蒡子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒三者之間各成分的變化規(guī)律，以及各成分變化所引起的藥理作用還需今后作進(jìn)一步的研究。

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