數(shù)字化單分子免疫分析技術(shù)研究進(jìn)展及毒品領(lǐng)域應(yīng)用展望

王繼業(yè) 姚偉宣 王鵬娟 孟凡偉

摘? 要：數(shù)字化單分子免疫分析（Simoa）技術(shù)是一種新型的超高靈敏度、特異性、全自動(dòng)化的多重檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)結(jié)合了單分子、圖像識(shí)別、數(shù)字化分析和熒光檢測(cè)技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)，目前已經(jīng)在神經(jīng)性疾病的微創(chuàng)檢查、腫瘤早期診斷、炎癥、感染性疾病甚至miRNA檢測(cè)等領(lǐng)域進(jìn)行大量研究，均取得了不錯(cuò)的成果。毒品成癮、戒斷和耐受實(shí)質(zhì)上是機(jī)體的一系列生理、生化過程，Simoa技術(shù)用于吸毒人員的生理生化研究將有助于闡明毒品成癮和耐受機(jī)制，并為毒品戒斷藥物的研制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)畏肿用庖叻治黾夹g(shù);毒品成癮;生物標(biāo)志物

中圖分類號(hào)：O657.3;TP212.3? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2096-4706（2019）10-0016-03

Abstract：Digital single molecule immunoassay（Simoa）is a new type of ultra-sensitive，specific，fully automated multiplex detection technology. This technology combines single molecule，image recognition，digital analysis and fluorescence detection technology to achieve single molecule detection. It has been extensively used in the fields of minimally invasive neurological examination，early tumor diagnosis，inflammation，infectious diseases and even miRNA detection. The research has achieved good results. Drug addiction，withdrawal and tolerance are essentially a series of physiological and biochemical processes in the body. Simoa technology used in the physiological and biochemical research of drug addicts will help to clarify the mechanism of drug addiction and tolerance，and provide theoretical basis for the development of drug withdrawal drugs.

Keywords：single molecule immunoassay;drug addiction;biomarkers

0? 引? 言

毒品成癮是指對(duì)毒品的心理依賴和生理依賴，是一種慢性、復(fù)發(fā)性的腦部疾病，嚴(yán)重影響個(gè)人健康、家庭和睦和社會(huì)安定。對(duì)毒品成癮機(jī)制和戒斷原理的研究將有助于吸毒人員進(jìn)行科學(xué)、有效的毒品戒斷。毒品進(jìn)入人體后會(huì)進(jìn)行一系列的生理和生化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，并改變?nèi)梭w各種生物分子的含量，這些生物分子的改變對(duì)與研究毒品成癮機(jī)制和研制毒品戒斷藥物均有重要意義，是目前神經(jīng)生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。

針對(duì)毒品生物標(biāo)志物的研究，涉及到的檢測(cè)方法包括色譜法、質(zhì)譜法、光譜法和免疫法等，已經(jīng)有大量文獻(xiàn)進(jìn)行了介紹。近幾年出現(xiàn)了一種新型的超高靈敏度數(shù)字化單分子免疫分析（Simoa）技術(shù)。目前已經(jīng)在神經(jīng)、炎癥、感染、腫瘤等方面獲得了應(yīng)用，取得了客觀的成果，而在毒品檢測(cè)方面還未見其應(yīng)用。該技術(shù)超高靈敏度的生物標(biāo)志物檢測(cè)性能能檢測(cè)到普通檢測(cè)方法檢測(cè)不出的物質(zhì)，這對(duì)重新認(rèn)識(shí)毒品成癮帶來的生理生化變化有及其重要作用，并將極大推進(jìn)成癮機(jī)制的研究進(jìn)展。

本文綜述了Simoa技術(shù)目前的應(yīng)用領(lǐng)域及其優(yōu)勢(shì)，并對(duì)其在毒品成癮機(jī)制和戒斷藥物研制方面的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

1? 技術(shù)原理

Simoa技術(shù)的基本原理為大量固定捕獲抗體的磁珠與樣本進(jìn)行反應(yīng)，通過控制磁珠和樣本中抗原的比例，可以使每個(gè)磁珠只結(jié)合一個(gè)或不結(jié)合抗原，而后加入熒光標(biāo)記的二抗，結(jié)合了抗原的磁珠將產(chǎn)生熒光信號(hào);將磁珠-抗原抗體復(fù)合物加到刻滿微孔的芯片上，通過控制微孔的尺寸，可以保證每個(gè)微孔只含有一個(gè)磁珠-抗原抗體復(fù)合物;而后在其表面鋪一層特制的油進(jìn)行熒光成像，根據(jù)圖像上每個(gè)微孔是否發(fā)出熒光進(jìn)行計(jì)數(shù)，通過熒光分子的比例可以推算出抗原的濃度，以數(shù)字化檢測(cè)方式極大提高檢測(cè)的靈敏度。該技術(shù)結(jié)合了熒光檢測(cè)、單分子和數(shù)字化分析技術(shù)，具有超高靈敏度、特異性、全自動(dòng)化、支持多重檢測(cè)等性能。為了驗(yàn)證該技術(shù)的靈敏度，Rissin等對(duì)比了Simoa和酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在檢測(cè)前列腺癌抗原方面的效果，結(jié)果Simoa的檢測(cè)下限比酶聯(lián)免疫反應(yīng)低1000倍，達(dá)到了fg/mL[1]。

2? Simoa應(yīng)用領(lǐng)域

基于Simoa的優(yōu)良檢測(cè)性能和操作方便性，目前已經(jīng)有大量研究人員將其應(yīng)用于神經(jīng)性疾病、腫瘤、炎癥、感染性疾病及miRNA檢測(cè)等領(lǐng)域。

神經(jīng)絲蛋白L（NFL）是一種能用于神經(jīng)損傷檢測(cè)的生物標(biāo)志物。傳統(tǒng)的免疫分析技術(shù)不能檢出血清中的NFL，需要抽取病人的腦脊液，從而會(huì)產(chǎn)生較大損傷。Kuhle等用三種不同的免疫分析方法檢測(cè)血液和腦脊液中的NFL，結(jié)果Simoa的檢測(cè)下限為0.62pg/mL（0個(gè)樣本低于檢測(cè)下限）;電化學(xué)免疫分析技術(shù)的檢測(cè)限為15.6pg/mL（20個(gè)樣本低于檢測(cè)下限）;酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的檢測(cè)限為78.0pg/mL（18個(gè)樣本低于檢測(cè)下限），Simoa技術(shù)的檢測(cè)下限是電化學(xué)免疫分析技術(shù)的25倍，是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)的125倍。而血清中NFL的水平與腦脊液中的水平相關(guān)，因而可以用Simoa技術(shù)進(jìn)行腦部疾病和神經(jīng)性疾病的微創(chuàng)檢測(cè)[2]。Disanto等以Simoa技術(shù)對(duì)多發(fā)性硬化患者和健康人群的血清中的NFL濃度進(jìn)行檢測(cè)比較，結(jié)果有腦部和/或脊柱釓增強(qiáng)病變的患者血清NFL濃度高于健康人群，且濃度與病變數(shù)目相關(guān)，經(jīng)過不同療法治療之后，病變患者的血清NFL濃度降低。而傳統(tǒng)的分析技術(shù)不能檢測(cè)這么低的血清NFL濃度，用Simoa技術(shù)檢測(cè)血清NFL濃度可用于多發(fā)性硬化的早期診斷和治療跟蹤[3]。

用傳統(tǒng)影像和生化技術(shù)進(jìn)行腫瘤診斷，發(fā)現(xiàn)的時(shí)候多為中晚期，而早發(fā)現(xiàn)早治療可以極大提高腫瘤患者的治愈率，近年來科學(xué)家們?cè)趪L試用不同的技術(shù)提高腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)靈敏度，從而達(dá)到早發(fā)現(xiàn)早治療的目的。Simoa技術(shù)的超高靈敏度使其在腫瘤早期診斷和術(shù)后評(píng)估中有極大的應(yīng)用前景。目前Simoa技術(shù)是唯一可以檢測(cè)到前列腺切除術(shù)后血清中PSA濃度的方法，其檢測(cè)靈敏度是傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)的1667倍，這對(duì)前列腺癌切除術(shù)后的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和二次放療具有重要意義，既可以避免過度放療，也可以降低因介入不及時(shí)而導(dǎo)致的癌癥復(fù)發(fā)[4]。

感染性疾病檢測(cè)方面，Simoa技術(shù)也取得了優(yōu)異的成果。Simoa技術(shù)的p24檢測(cè)下限為4.87fg/mL，比傳統(tǒng)免疫分析方法高2000～3000倍，能比傳統(tǒng)免疫分析方法提前9～11天檢測(cè)到HIV感染，這對(duì)HIV的治療和傳染預(yù)防具有很大意義[5]。Simoa技術(shù)還能將糞便中的艱難梭菌毒素的檢測(cè)假陽(yáng)性降低25%，是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的感染篩查方法。在登革熱感染出現(xiàn)癥狀之前，目前的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)無法檢測(cè)到循環(huán)系統(tǒng)中IgG和IgM抗體，而Simoa技術(shù)能將IgG檢測(cè)靈敏度提高1000倍，IgM檢測(cè)靈敏度提高10000倍，可用來區(qū)分原發(fā)性和繼發(fā)性感染，評(píng)估發(fā)生登革出血熱（DHF）及登革休克綜合征（DSS）的風(fēng)險(xiǎn)[6]。

炎癥方面，Song等用Simoa技術(shù)監(jiān)測(cè)克羅恩病TNF- α免疫治療后細(xì)胞因子的變化。與對(duì)照相比，克羅恩病患者的血漿IL-6水平升高，但是TNF-α無顯著不同，抗TNF-α治療12周，患者的IL-6和TNF-α水平下降，而傳統(tǒng)的分析方法靈敏度不夠高，無法監(jiān)測(cè)治療后的TNF-α水平[7]。

Simoa技術(shù)不僅能進(jìn)行免疫分析，通過設(shè)計(jì)還能檢測(cè)核酸。在磁珠表面偶聯(lián)捕獲核酸探針，當(dāng)核酸目標(biāo)物存在時(shí)，將形成捕獲核酸探針-目標(biāo)物-信號(hào)核酸探針復(fù)合物;將復(fù)合物落到光盤的小孔中即可進(jìn)行熒光數(shù)字化分析，得到核酸濃度。特別是用在miRNA檢測(cè)方面時(shí)，Simoa技術(shù)的超高靈敏度和特異性性能，使得檢測(cè)過程不需要進(jìn)行靶向擴(kuò)增。以三重血清回收率實(shí)驗(yàn)，用來檢測(cè)檢測(cè)人肺總RNA中的miR-141、miR-21和miR-16靈敏度和交叉反應(yīng)，驗(yàn)證了Simoa技術(shù)在miRNA檢測(cè)中具有超高靈敏度和特異性，其LOQ值接近10fM，且交叉反應(yīng)少[8]。Rissin等用堿性肽核酸探針通過互補(bǔ)配對(duì)特異性結(jié)合miRNA-122，能識(shí)別單個(gè)堿基的錯(cuò)配，與健康人群對(duì)照相比，急性肝損傷患者血清中miRNA-122的水平較高[9]。

3? 毒品成癮研究

各類毒品進(jìn)入人體后會(huì)到達(dá)腦部的不同區(qū)域，而后激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生毒理作用，目前研究比較多的信號(hào)通路有阿片受體、多巴胺、大麻受體、谷氨酸受體和絲裂酶原活化蛋白激酶等，可以介導(dǎo)神經(jīng)興奮或抑制，從而影響行為、記憶和學(xué)習(xí)能力。早在90年代就有文獻(xiàn)報(bào)道嗎啡能刺激機(jī)體產(chǎn)生和釋放細(xì)胞因子，其中最重要的是白細(xì)胞介素。而后在研究戒斷藥物AV411的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，嗎啡改變了膠質(zhì)激活標(biāo)志物、細(xì)胞因子、趨化因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)[10]。Mao等進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)嗎啡不僅具有很高的成癮性和耐受潛力外，還可誘導(dǎo)免疫抑制。對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的84種炎癥相關(guān)基因表達(dá)情況監(jiān)測(cè)后發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受動(dòng)物脾臟中的TNF-α和IL-β顯著降低。在毒品戒斷藥物研究方面，張曉輝及其合作研究者發(fā)現(xiàn)精神活性物質(zhì)首先激活Toll樣受體4（TLR4），從而活化小膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥因子，正向調(diào)節(jié)信號(hào)通路，提高神經(jīng)元興奮性，以致毒品成癮和依賴;他們通過設(shè)計(jì)和篩選發(fā)現(xiàn)可用于毒癮戒斷治療的小分子抑制劑，并已經(jīng)運(yùn)用于臨床試驗(yàn)[11]。毒品成癮機(jī)制所涉及的生理生化過程繁多而復(fù)雜，目前已有很多的文獻(xiàn)對(duì)毒品的成癮機(jī)制進(jìn)行了研究，涉及神經(jīng)內(nèi)分泌、細(xì)胞內(nèi)信使等系統(tǒng)，檢測(cè)的標(biāo)志物包括免疫因子、炎癥因子、RNA等。

4? 結(jié)? 論

Simoa技術(shù)是一種新型的免疫分析技術(shù)，檢測(cè)原理涉及了單分子和數(shù)字化檢測(cè)技術(shù)，具有超高靈敏度、特異性、能實(shí)現(xiàn)多重自動(dòng)化檢測(cè)，并且支持自主試劑研發(fā)。目前已經(jīng)在神經(jīng)性疾病微創(chuàng)檢測(cè)和生理分析、腫瘤的早期診斷和術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、感染性疾病的早期檢測(cè)和預(yù)防、炎癥因子的研究等方面得到了應(yīng)用。毒品成癮和戒斷過程中的生理生化過程復(fù)雜，到目前為止還沒有完全闡明，將Simoa技術(shù)用于吸毒和戒毒人員的生物標(biāo)志物研究將有助于發(fā)現(xiàn)含量微小的標(biāo)志物，進(jìn)而對(duì)成癮機(jī)制研究和戒斷藥物的研制提供技術(shù)支持。

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作者簡(jiǎn)介：王繼業(yè)（1982.03-），男，漢族，山東煙臺(tái)人，副教授，博士，研究方向：毒品防控。