右歸丸對腎陽虛模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響

張文釗 田洪昭 左軍 李冀

摘要 目的：探討右歸丸對腎陽虛模型大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響。方法：將60只健康雄性SD大鼠隨機分為右歸丸組、模型組和空白組，每組20只。右歸丸組大鼠接受腎陽虛模型制備后予右歸丸灌胃給藥干預(yù);模型組大鼠接受腎陽虛模型制備后接受右歸丸組同體積的0.9%NaCl灌胃，連續(xù)灌胃20 d;空白組大鼠不接受造模制備，第16日起同右歸丸組同體積的0.9%Nacl灌胃，連續(xù)灌胃20日。造模結(jié)束后每隔4日常規(guī)記錄大鼠體質(zhì)量、肛溫、飲水量、尿量、以及抓取激惹反應(yīng)。比較3組大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、大鼠皮質(zhì)醇（CORT）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1（CRHR1）的含量變化。結(jié)果：1）造模后發(fā)現(xiàn)接受模型制備的大鼠表現(xiàn)為肛溫降低，飲水量及攝食量減少，體質(zhì)量下降，大便溏薄，尿量增多，抓取激惹反應(yīng)減弱。進行藥物干預(yù)后，右歸丸組大鼠的肛溫、飲水量、攝食量、抓取激惹反應(yīng)、體質(zhì)量均高于模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），尿量減少，且大便干濕趨于正常;2）與空白組比較模型組及右歸丸組腎上腺、下丘腦、垂體的臟器指數(shù)均下降（P<0.05），其中模型組下降的趨勢更為明顯，右歸丸組較模型組腎上腺、下丘腦、垂體的臟器指數(shù)有所上升（P<0.05）;3）與空白組比較，模型組及右歸丸組大鼠接受造模后血清CRF、ACTH、CORT以及腎上腺、下丘腦、垂體的CRHR1含量均明顯下降，經(jīng)過右歸丸干預(yù)后，該組別的大鼠CRF、ACTH、CORT、CRHR1含量均得到提升，其中CRF、ACTH含量接近空白組水平。4）與空白組比較，模型組及右歸丸組大鼠接受造模后腎上腺、下丘腦、垂體的CRF、ACTH、CORT及CRHR1 mRNA水平均明顯下降，經(jīng)過右歸丸干預(yù)后，該組別的大鼠CRF、ACTH、CORT、CRHR1mRNA水平均得到提升。結(jié)論：右歸丸可能是通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功能發(fā)揮溫腎補陽的作用。

關(guān)鍵詞 腎陽虛;右歸丸;機制;下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸;CRF;ACTH;CORT;CRHR1

Effects of Yougui Pills on Hypothalamus-Pituitary-Adrenal Cortex Axis in the Kidney-Yang Deficiency Model Rats

Zhang Wenzhao，Tian Hongzhao，Zuo Jun，Li Ji

Abstract Objective：To explore the effects of Yougui Pills on hypothalamus-pituitary-adrenal cortex axis in the kidney-yang deficiency model rats.Methods：A total of 60 healthy male SD rats were randomly divided into a Yougui Pills group，a model group and a blank group，with 20 cases in each group.After the kidney-yang deficiency model establishment，the rats of Yougui Pills group had Yougui Pills by intragastric administration; After the kidney-yang deficiency model establishment，the rats of the model group had the same volume 0.9% Nacl as Yougui Pills by intragastric administration，continuous for 20 days; The rats in the blank group did not accept model preparation，and had the same volume 0.9% Nacl as Yougui Pills by intragastric administration began with the 16th day，continuous for 20 days; After model establishment，the weight，anus temperature，water intake，urine volume，and grab irritability reaction of rats were recorded every 4 days.The content changes of corticotrophin releasing factor（CRF），adrenocorticotropic hormone（ACTH）and cortisol（CORT）of rats，adrenocorticotropic hormone releasing hormone receptor 1（CRHR1）among the 3 groups of rats were compared.Results：1）after the model establishment，it was found that the established model rats had anal temperature reduction，drinking water and food intake decrease，weight loss，thin sloppy stool，urine volume increased，fetching irritability reaction weaken.After the pharmacological intervention，the rats of Yougui Pills group were higher than that in the model group in anal temperature，water intake，food intake，grab irritability reaction and weight.The comparison was with statistical differences（P<0.05）and the urine volume reduced and stool moisture returned to normal.2）Compared with the blank group，the indexes of adrenal gland，hypothalamus and pituitary decreased in the model group and the Yougui Pills group（P<0.05）.The model group had more obvious decreased trend.The indexes of adrenal gland，hypothalamus and pituitary increased in the Yougui Pills group compared with model group（P<0.05）.3）Compared with the blank group，the rats had model establishment in the model group and Yougui Pills group had the significantly reduction of serum CRF，ACTH，CORT and CRHR1 content of adrenal gland，hypothalamus and pituitary，after the intervention of Yougui Pills.CRF，ACTH，CORT，CRHR1 content of the rats in the group had improved.CRF and ACTH levels were close to the blank group levels.4）Compared with the blank group，the model established rats in the model group and Yougui Pills group had the significantly mRNA levels reduction of CRF，ACTH，CORT and CRHR1 in adrenal gland，hypothalamus and pituitary.After the Yougui Pills intervention，CRF，ACTH，CORT and CRHR1 mRNA levels were improved in the group.Conclusion：The Yougui Pills may exert the function of warming the kidney and tonifying yang by adjusting the hypothalamus-pituitary-adrenal cortex axis.

Key Words Kidney yang deficiency; Yougui Pills; Mechanism; Hypothalamus-pituitary-adrenal cortex axis; CRF; ACTH; CORT; CRHR1

中圖分類號：R285.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.015

中醫(yī)現(xiàn)代研究表明腎陽虛的臨床癥狀改變與下丘腦-垂體-腎上腺軸（Hypothalamus-Pituitary-Adrenal，HPA）功能紊亂密切相關(guān)，HPA軸通過反饋調(diào)節(jié)通路參與控制包括應(yīng)激反應(yīng)、免疫等在內(nèi)的諸多生理的反應(yīng)，腎陽虛患者體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)繼續(xù)性存在，導(dǎo)致HPA軸過度興奮并逐漸消耗其儲備能力;且長期的應(yīng)激介導(dǎo)于HPA軸釋放糖皮質(zhì)激素，誘發(fā)機體淋巴細胞過度凋亡，引起免疫抑制[1]。因此我們推測，各種干預(yù)措施（藥物、各種刺激等）如果能夠明顯改善HPA軸，就可以在一定程度上改變腎陽虛引發(fā)的臨床癥狀。右歸丸出自《景岳全書》，基于“陰中求陽”的理論所創(chuàng)，具有溫補腎陽，填精益髓之功效，主治腎陽不足引起的諸癥。本課題組已從臨床角度證實右歸丸有增強腎陽虛患者免疫功能的作用，但該方增強免疫的機制有待進一步探討。本研究擬從下丘腦-垂體-腎上腺軸與腎陽虛之間的關(guān)系著手，利用改良的“氫化考的松腎陽虛”動物模型為載體，探討右歸丸的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用健康雄性SD大鼠60只，平均體質(zhì)量（230±20）g，由中國上海SLAC實驗動物有限責(zé)任公司提供[合格證號：SCXK（瀘）2007-0005]，于實驗動物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后體質(zhì)量達（300±20）g進行實驗研究。食物和水在整個實驗過程中均由實驗動物自由索取。實驗經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)動物管理制度和使用委員會批準(zhǔn)而進行，實驗過程中動物的處理均嚴(yán)格按照國際道德準(zhǔn)則和國家健康指南關(guān)于維護和使用實驗動物先關(guān)條例進行。

1.1.2 藥物 右歸丸（濃縮丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，國藥準(zhǔn)字Z11021040）。右歸丸混懸液制備：將右歸丸完全溶解于雙蒸水中，參照成人的體質(zhì)量及計量，根據(jù)[2]《藥理實驗方法學(xué)》中換算動物劑量折算方法將右歸丸配置成含藥0.243 9 g/mL的混懸液，備用。

1.1.3 試劑與儀器 苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride PMSF，美國，批號：W98923），Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：828392），聚丙烯酰胺凝膠（中國碧云天公司，批號：392-32），RPMI 1640和胎牛血清（美國Thermo公司，批號：16000-044）。大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）Elisa試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號：FA021572），大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號：FA02106B），大鼠皮質(zhì)醇（CORT）ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，批號：YM-S2070），單克隆大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1（CRHR1）抗體（Abcan公司，美國，批號：ab150561）。高速冷凍離心機，轉(zhuǎn)膜儀，凝膠成像系統(tǒng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增儀（美國ABI公司，型號ProFlex），切片機（美國RMC公司，型號PowerTome-PC），酶標(biāo)儀（美國Thermo labsystem公司，型號Multiskan FC），脫色搖床（美國Thermo labsystem公司，型號MaxQ8000）及PL 203型電子天平（瑞士METTLER TOLEDO，型號PL203），全自動生化分析儀（日本日立公司，型號：7180型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 腎陽虛模型制備方法：大鼠接受改良鄺安堃式[3]腎陽虛模型制備，大鼠每日接受25 mg/kg氫化可的松肌肉注射，連續(xù)注射15 d。將40只造模成功大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為右歸丸組、模型組，每組20只，其余20只為空白對照組。

1.2.2 干預(yù)方法 右歸丸組大鼠接受腎陽虛模型制備后予右歸丸混懸液灌胃給藥干預(yù)，連續(xù)灌胃20 d，1次/d，2 mL/（200 g·次）。模型組大鼠接受腎陽虛模型制備后接受右歸丸組同體積的0.9%NaCl溶液灌胃，連續(xù)灌胃20 d?？瞻捉M不接受造模制備，第16天起同右歸丸組同體積的0.9% NaCl溶液灌胃，連續(xù)灌胃20 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 大鼠一般癥狀 造模結(jié)束后每隔4 d常規(guī)記錄大鼠體質(zhì)量、肛溫、飲水量、尿量、以及抓取激惹反應(yīng)。

1.2.3.2 取材 將各組大鼠按照0.3 mL/kg的比例腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，進行腹主動脈采血，迅速離心后取上清液。隨后于冰上迅速分離下丘腦、垂體及腎上腺儲存于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。同時參照寶森方法計算臟器指數(shù)。

1.2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法 將收集的輔助動脈血在4 ℃條件下進行9 000 r/min離心5 min后，使用高壓槍頭吸取離心后的上清液，送至檢驗中心，應(yīng)用全自動生化分析儀檢測CRF、ACTH、CORT濃度。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行檢測，包被、封閉酶標(biāo)反應(yīng)孔、洗滌、加入待檢測樣品、加入酶標(biāo)抗體、加入底物液、終止反應(yīng)等過程均嚴(yán)格按照說明書進行，試劑盒由廣州達安基因股份有限公司提供，OPD顯色后采用492 nm波長，TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測需要450 nm波長。檢測時一定要首先進行空白孔系統(tǒng)調(diào)零，用測定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測定孔平均值的比值（P/N）表示。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡（westernblotting）法 取收集的組織200 mg，加入1 mL含蛋白酶抑制劑（PMSF）裂解緩沖液于冰上進行勻漿，4 ℃，15 000 r/min離心5 min，取上清液，100 μL分裝后-80 ℃?zhèn)溆?。根?jù)DAB方法對所提蛋白液進行濃度測定。以100 μL蛋白液中加入25 μL的上樣緩沖液于100 ℃金屬浴中變性。按照，每泳道上樣量為50 μg蛋白，計算上樣量。電泳（4%濃縮膠，12%分離膠，120 V，50 mA，1.5 h）結(jié)束后將凝膠取出，用PVDF膜轉(zhuǎn)印，遵循膠在負極，膜在正極的原則，50 V，100 mA，2 h。5%脫脂奶粉液的封閉2 h，TBS洗3次，5 min/次，分別加入5%脫脂奶粉按1∶1 000稀釋的抗CRHR1和β-actin抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBS洗3次，5 min/次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶2 000）室溫2 h，TBS洗3次，5 min/次。將濾膜放人配好的顯色液中顯色15～30 min，計算機掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，Model Gel Doc 2000）分析處理。

1.3.6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法 取收集的組織200 mg加入1 mL Trizol勻漿，震蕩30 s后加入氯仿0.2 mL，劇烈搖動30 s，室溫下放置3 min后置于4 ℃，12 000 r/min離心15 min。輕吸上層無色水相至另一試管后加入0.5 mL的異丙醇，室溫下放置10 min。加入75%乙醇1 mL，震蕩10 s后置于4 ℃，7 500 r/min離心5 min，摒棄上清液，小心吸取殘留乙醇，并開蓋干燥5 min，加入20 μL純化乙醇溶解RNA。采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒檢測CRF、ACTH、CORT、CRHR1的基因表達水平。取5 μL產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像所得DNA條帶采用凝膠成像系統(tǒng)進行分析，讀取條帶ID值。用于擴增的引物序列如下：β-actin mRNA正向序列：5，-actggcattgtgatggactc-3，反向序列：5，-acgcactgtggcataga-3，;CRF mRNA正向序列：5，-ccagcaacctcagccgattc-3，;反向序列：5，-aaaaagttagccgcagcctg-3，;ACTH mRNA正向序列：5，-atcaactaaccattgatata-3，;反向序列：5，-agtttcattgattattattt-3，;CORT mRNA正向序列：5，-atagtagaagaatgtctctg-3，;反向序列：5，-aaattactggatgagtttca-3，;CRHR1 mRNA正向序列：5，-agacttgctcgcgcagggcg-3，;反向序列：5，-agccagagcctgccggtggg-3。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有結(jié)果均選擇3個或3個以上數(shù)據(jù)，各實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用t檢驗和單因素方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行方差比較和組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般癥狀比較 造模后發(fā)現(xiàn)接受模型制備的大鼠表現(xiàn)為肛溫降低，飲水量及攝食量減少，體質(zhì)量下降，大便溏薄，尿量增多，抓取激惹反應(yīng)減弱。進行藥物干預(yù)后，右歸丸組大鼠的肛溫、飲水量、攝食量、抓取激惹反應(yīng)、體質(zhì)量均高于模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），尿量減少，且大便干濕趨于正常。見圖1～5。

2.2 對腎陽虛證大鼠臟器指數(shù)的影響 與空白組比較模型組及右歸丸組腎上腺、下丘腦、垂體的臟器指數(shù)均下降（P<0.05），其中模型組下降的趨勢更為明顯，右歸丸組較模型組腎上腺、下丘腦、垂體的臟器指數(shù)有所上升（P<0.05）。見圖6。

2.3 血清CRF、ACTH、CORT含量的變化 與空白組比較，模型組及右歸丸組大鼠接受造模后血清CRF、ACTH、CORT以及腎上腺、下丘腦、垂體的CRHR1含量均明顯下降，經(jīng)過右歸丸干預(yù)后，該組別的大鼠CRF、ACTH、CORT、CRHR1含量均得到提升，其中CRF、ACTH含量接近空白組水平。見表1，圖7。

2.5 CRF、ACTH、CORT及CRHR1 mRNA水平的變化 與空白組比較，模型組及右歸丸組大鼠接受造模后腎上腺、下丘腦、垂體的CRF、ACTH、CORT及CRHR1 mRNA水平均明顯下降，經(jīng)過右歸丸干預(yù)后，該組別的大鼠CRF、ACTH、CORT、CRHR1mRNA水平均得到提升。見圖8。

3 討論

腎乃臟腑陰陽之本，亦是人體生長、發(fā)育、生殖之源，是生命活動之根本故為“先天之本”。一身之陽氣由腎主導(dǎo)，腎陽虛即腎臟陽氣虛衰，是腎臟陽氣衰竭表現(xiàn)的癥候，火衰其本則陽虛之證迭出。通過國內(nèi)外大量文獻[5-6]，我們可知鄺安堃于60年代首創(chuàng)的腎陽虛模型可以理想的模擬機體腎陽虛所發(fā)生的病理性改變。而基于中醫(yī)臟腑辨證依據(jù)，我們所確定的肛溫、體質(zhì)量、飲食及抓取激惹反應(yīng)等變化可以準(zhǔn)確的體現(xiàn)中醫(yī)關(guān)于腎陽虛證的變化，可作為造模成功與否的一個標(biāo)準(zhǔn)。本文結(jié)果顯示：接受模型制備的大鼠均出現(xiàn)一系列符合腎陽虛證的癥狀，這和徐文聃[4]等近期研究結(jié)果相符合。且經(jīng)過右歸丸干預(yù)后大鼠癥狀出現(xiàn)改善，進一步證實了本研究模型制作成功。

腎陽虛的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)本質(zhì)一直是各醫(yī)家討論的熱點話題，沈自尹[7]通過研究證實HPA軸發(fā)生功能紊亂是腎陽虛證的共同點。閔建新[8]等通過對腎陽虛模型大鼠HPA軸進行免疫組化形態(tài)學(xué)觀察后發(fā)現(xiàn)腎陽虛時大鼠腎上腺皮質(zhì)組織的CRF陽性纖維數(shù)量明顯減少，腎上腺束狀帶明顯變薄，上述報道和本研究發(fā)現(xiàn)氫化可的松長期肌肉注射的大鼠腎上腺、甲狀腺、垂體的臟器指數(shù)均發(fā)生明顯變化具有一致性。

國際上屢屢有學(xué)者想要探索促進HPA軸恢復(fù)的方法，但均以失敗告終。Markow ska[9]等通過上調(diào)ACTH的水平抑制大鼠腎上腺皮質(zhì)細胞過度凋亡，增加了腎上腺皮質(zhì)組織內(nèi)皮質(zhì)酮和醛固酮的含量，但是對大鼠外周血清中皮質(zhì)酮和醛固酮的含量并沒有產(chǎn)生任何改善作用。Gomez-Gil[10]等對抑郁癥患者使用丁螺旋酮后發(fā)現(xiàn)其血漿中ACTH濃度增加，認為丁螺旋酮可能可以通過促進ACTH的分泌而改善抑郁癥患者HPA的抑制狀況，但Gomez-Gil并未從HPA軸的其他環(huán)節(jié)進行進一步深入研究。

中藥復(fù)方是中醫(yī)學(xué)發(fā)揮臨床療效的應(yīng)用形式，配伍是中藥復(fù)方的靈魂。本方由熟地黃、附子（炮附片）、肉桂、山藥、山茱萸（酒炙）、菟絲子、鹿角膠、枸杞子、當(dāng)歸、杜仲（鹽炒）組成，方中以附子、肉桂、鹿角膠為君藥，溫補腎陽，填精補髓。臣以熟地黃、枸杞子、山茱萸、山藥滋陰益腎，養(yǎng)肝補脾，陰中求陽。佐以菟絲子、杜仲補益肝腎，強筋壯骨;當(dāng)歸補血養(yǎng)肝，諸藥配合，共奏溫補腎陽，填精補髓之功?，F(xiàn)代藥理研究顯示[11]：熟地黃、山茱萸提取物可有效的抑制皮質(zhì)酮損傷性大鼠腦組織神經(jīng)元的凋亡，山藥提取物可以升高去甲腎上腺素的含量而達到改變HPA軸形態(tài)的目的;杜仲提取物可以調(diào)節(jié)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的HPA軸形態(tài)而改善癥狀;當(dāng)歸提取物能夠降低氫化可的松造成“陽虛”小鼠的淋巴細胞凋亡率，提高其機體免疫力，負反饋于HPA軸，改善其病理變化。本研究使用右歸丸作為干預(yù)手段后，發(fā)現(xiàn)大鼠的CRF、ACTH、CORT、CRHR1含量均得到提升，從HPA軸的下丘腦、垂體、腎上腺環(huán)節(jié)均可實現(xiàn)，提示右歸丸具有改善腎陽虛HPA軸功能的作用，揭示了右歸丸的現(xiàn)代內(nèi)涵。

綜上所述，我們認為HPA軸功能紊亂是腎陽虛的關(guān)鍵，右歸丸通過改善下丘腦、垂體、腎上腺軸等環(huán)節(jié)的平衡，進一步體現(xiàn)了中醫(yī)治療的整體觀。另外考慮中醫(yī)藥對機體多靶點、多途徑性，右歸丸整體調(diào)節(jié)機制仍處于不斷探索中，待進一步擴寬及深入。

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（2019-02-26收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（81874426）作者簡介：張文釗（1990.03—），男，博士研究生在讀，研究方向：方劑配伍規(guī)律與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，E-mail：zhengpeinegd@163.com通信作者：李冀（1960.11—），男，研究生，教授，研究方向：方劑配伍規(guī)律與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，E-mail：ly900311@126.com