重慶云陽橘紅褐斑病病原鑒定及生物學(xué)特性初步研究

杜用璽 徐揚(yáng) 呂朝耕 池秀蓮 王升 康傳志 孫楷 袁杰 王鐵霖 郭蘭萍

摘要 目的：鑒定從重慶云陽橘紅基地采集到疑似橘紅褐斑病樣品病原菌。方法：使用組織分離、形態(tài)學(xué)鑒定、真菌ITS序列分析及致病性測定。結(jié)果：將其鑒定為橘紅褐斑病，病原菌為交鏈格胞菌（Alternaria alternata）。生物學(xué)特性分析表明，該病原菌菌絲生長適宜溫度為15～30 ℃，最適溫度為20～25 ℃，37 ℃時(shí)不能生長;pH值為4～12時(shí)均可生長，最適pH值為10;光照對菌絲生長影響不大;該菌可利用多種碳、氮源，最適碳源為果糖和D-甘露醇，最適氮源為蛋白胨和硝酸鈉。結(jié)論：不同褐斑病菌株間存在一定的差異。

關(guān)鍵詞 橘紅褐斑病菌;病原鑒定;生物學(xué)特性

Pathogenic Identification of Alternaria Brown Spot and Preliminary Research of its Biological Characteristics in Chongqing Yunyang

Du Yongxi1，2，Xu Yang1，Lyu Chaogeng1，Chi Xiulian1，Wang Sheng1，Kang Chuanzhi1，Sui Kai1，Yuan Jie1，Wang Tielin1，Guo Lanping1，2

（1 National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences，State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，Beijing 100700，China; 2 School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Abstract Objective：To identify the pathogens suspected of orange-red brown spot samples collected from the orange-red base in Yunyang，Chongqing.Methods：Tissue isolation，morphological identification，sequence analysis of fungal ITS and pathogenicity were used.Results：It was identified as orange-red brown spot，and the pathogen was Alternaria alternata.The analysis of biological characteristics showed that the suitable temperature for the growth of the pathogenic mycelia was 15～30 ℃，the optimal temperature was 20～25 ℃，and it cannot grow at 37 ℃; it can grow at pH 4～12，and the optimal pH value was 10; Light had little effect on the growth of mycelium; the bacteria can use a variety of carbon and nitrogen sources，the most suitable carbon sources were fructose and D-mannitol，and the most suitable nitrogen sources were peptone and sodium nitrate.Conclusion：There are some differences between different brown spot strains.

Key Words Alternaria alternate; Pathogen identification; Biological characterization

中圖分類號：R282.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.11.005

橘紅，是一種常用中藥，具有散寒、燥濕、利氣、消痰等功效。其中，橘皮類橘紅主要為蕓香科植物紅橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種成熟的外層果皮干燥而成[1]。橘紅原產(chǎn)我國，主產(chǎn)四川、重慶等地，其中三峽庫區(qū)腹地的云陽縣，以種植大紅袍紅橘為主，種植歷史達(dá)4 000年[2]。鏈格孢褐斑?。ˋlternaria Brown Spot，ABS）由交鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起[3-4]，主要為害一些橘類，以及橘和柚，或橘和橙的雜交柑橘，引起落葉、落果、枯梢，帶病果實(shí)因果面病斑而難以鮮銷[5]。該病害在澳大利亞皇帝柑橘上首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，之后在美國佛羅里達(dá)州、哥倫比亞、以色列、土耳其等國家地區(qū)相繼報(bào)道，對柑橘種植業(yè)造成了嚴(yán)重的影響[6]。2010年，柑橘褐斑病在我國首次報(bào)道[7]。截至目前，該病害已在重慶紅橘、廣西及廣東貢柑等多種蕓香科作物上報(bào)道[8]。本研究對2016年在云陽橘紅基地橘紅果實(shí)上分離的病原菌進(jìn)行了致病性測定，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

1.1.1 供試菌株來源 2016年1月26日收到病果，采自重慶云陽橘紅基地。經(jīng)常規(guī)組織分離和純化培養(yǎng)[9]后，接種于PDA平板上，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 病原菌鑒定 光學(xué)顯微鏡下觀察葉片及果實(shí)病斑和分離獲得的疑似病原菌菌絲及分生孢子的形態(tài)特征。觀察、測量菌落在PDA平板上的生長情況。根據(jù)鏡檢特征及菌落形態(tài)，進(jìn)行病原菌的初步鑒定。

1.2 病原菌的分子鑒定 提取病菌基因組DNA，采用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行分子鑒定。PCR擴(kuò)增體系及條件如下：25 μL體系;模板DNA，2 μL;2Master Mix（天根，北京，中國）12.5 μL;引物各1 μL;dd H2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)用膠回收試劑盒（Axygen，北京，中國）回收后與pEASY-T載體（Takara，大連，中國）連接，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，經(jīng)培養(yǎng)后使用PCR進(jìn)行驗(yàn)證。將驗(yàn)證的陽性克隆送北京華大生物技術(shù)有限公司測序。將測序獲得序列在NCBI的nt數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行blastn搜索。采用Mega 4.0統(tǒng)計(jì)軟件[10]，以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并分析進(jìn)化關(guān)系。

1.3 病原菌致病性測定 將健康果實(shí)用75%的乙醇表面擦拭消毒后，采用針刺接種法[11]，將分離得到的病原菌餅接于果面上，以清水為陰性對照，同時(shí)設(shè)置無傷口接種果實(shí)為平行對照，每個(gè)處理3次重復(fù)。接種后果實(shí)于28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。同時(shí)從發(fā)病后的果實(shí)上再次分離病菌，與接種病菌比較確認(rèn)。

1.4 病原菌的生物學(xué)測定

1.4.1 溫度對菌絲生長的影響 培養(yǎng)7 d后，用打孔器在菌落邊緣處取直徑為5 mm的菌餅，接種于PDA平板中央，分別于4、15、20、28、30、37和50 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，培養(yǎng)7 d后，用自動(dòng)菌落分析和抑菌圈測量系統(tǒng)（Protocol 3型）測量菌落直徑。

1.4.2 pH值對菌絲生長的影響 取培養(yǎng)7 d直徑為5 mm的菌餅，分別接種于pH值為4、6、7、8、10和12的6種不同的PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑。

1.4.3 光照對菌絲生長速率的影響 取培養(yǎng)7 d直徑為5 mm的菌餅，分別于24 h全黑暗、24 h全光照和12 h光暗交替3種模式，28 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后測量菌落直徑。

1.4.4 不同碳源、氮源對菌絲生長速度的影響 采用Crapek[12]基礎(chǔ)培養(yǎng)基：NaNO3 2 g、KCl 0.5 g、K2HPO4 1 g、FeSO4 0.01 g、MgSO4 0.5 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g、水1 000 mL、pH值為配比正常情況下使用。以相同碳量的可溶性淀粉、果糖、麥芽糖、葡萄糖及D-甘露醇代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖作為試驗(yàn)碳源，配制成含不同碳源的培養(yǎng)基。用以上Crapek培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再分別以等氮量的硝酸鉀、蛋白胨、酵母浸膏、牛肉浸膏、氨基乙酸代替硝酸鈉作為試驗(yàn)的氮源，配制成含不同氮源的培養(yǎng)基。以上制作成平板后，接種取自培養(yǎng)7 d病原菌的菌餅，置28 ℃下培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 為害癥狀和形態(tài)學(xué)鑒定 發(fā)病初期，果實(shí)呈現(xiàn)淺褐色不規(guī)則狀小斑點(diǎn)（圖1A），后期病斑為深褐色、近圓形，病斑中部顏色較淺，呈凹陷狀，外圍有淺黃色暈圈（圖1B）。葉片葉脈模糊，有疑似霉層附著（圖1C）。病害很少侵入果實(shí)，送檢樣品中僅有一例，受害果實(shí)病斑凹陷深入至橘紅囊瓣，呈深褐色不規(guī)則狀病斑（圖1D）。對送檢樣品的葉片及橘梗保濕培養(yǎng)7 d后，在橘梗部有白色氣生菌絲生成，葉片有深褐色霉層。

利用組織分離法，分別在LB及PDA培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)病原細(xì)菌及真菌，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d后觀察。LB平板上無病原細(xì)菌生長。對PDA平板上分離得到的真菌用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行初步分子鑒定。結(jié)果如下：病菌生長初期，白色氣生菌絲發(fā)達(dá);生長后期菌落質(zhì)地厚實(shí)，呈現(xiàn)同心輪紋狀，為灰褐色或黑灰色，邊緣白色氣生菌絲發(fā)達(dá)，背面由中心向外顏色由黑灰至淺灰色，同心輪紋狀向外輻射。分生孢子淺褐色或深褐色，近梨形或橢圓形，具有2～5個(gè)縱橫膈膜，分生孢子梗形狀與孢子類似，可形成分生孢子鏈，無分枝（圖2A，B）。菌株菌絲體分枝，表面光滑，有分隔，寬1～8 μm，營養(yǎng)菌絲無色透明，繁殖菌絲顏色較深，為暗黃色至褐色（圖2C）。

2.2 病原菌的rDNA-ITS序列分析 用真菌通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增分離菌株的rDNA-ITS并測序，目的片段長度分別為592 base pairs（bp），將測序結(jié)果在NCBI上用BLAST進(jìn)行同源性分析，為交鏈格孢菌（Alternaria alternata）（圖3）;利用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹可知，該病原菌與柑橘褐斑病菌[Alternaria alternata（15-246）]聚在同一分支上面，遺傳距離最近，表明菌株Juhong-1是柑橘褐斑病的病原菌。

2.3 病原菌致病性分析結(jié)果 接種14 d后，果面出現(xiàn)淡黃色斑點(diǎn)，后期斑點(diǎn)逐漸變深褐色;無傷口接種一半，沒有明顯的發(fā)病癥狀。對照果實(shí)不發(fā)病。見圖4。對發(fā)病部位再次組織分離，獲得的菌株與接種的菌株形態(tài)一致，證明分離物即為柑橘褐斑病的病原。

2.4 病原菌的生物學(xué)測定結(jié)果

2.4.1 溫度對菌絲生長速率的影響 褐斑病菌在4～31 ℃均可生長，適宜生長溫度為20～30 ℃，最適溫度為25 ℃。低溫4 ℃時(shí)生長較緩慢，而高溫下，≥37 ℃不能生長。見圖5。

2.4.2 pH值對菌絲生長的影響 褐變病菌在pH值為4～12范圍內(nèi)均能生長，各pH值間，菌絲生長速率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6。

2.4.3 光照對菌絲生長速率的影響 不同光照處理，對菌絲生長影響不大，各處理間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖7。

2.4.4 不同碳源、氮源對菌絲生長的影響 供試的5種碳源中，以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌落生長速度最快，其次是以果糖為碳源的培養(yǎng)基，而以葡萄糖、蔗糖和D-甘露醇為碳源的培養(yǎng)基菌落生長相對緩慢。見圖8。而供試的5種氮源中，菌株在以牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基上生長最快，其次依次為硝酸鉀和胰蛋白胨，而在以硝酸鈉和和酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基上生長較為緩慢。此外，不同碳源、氮源間，菌絲的稀疏程度不一。其中，以D-甘露醇為碳源的菌絲最為稀疏，以牛肉浸膏為氮源的菌絲最為濃密。見表1。

3 討論

近年來，柑橘褐斑病的危害面積不斷擴(kuò)大，對橘紅品質(zhì)的影響嚴(yán)重[13]。柑橘產(chǎn)業(yè)相關(guān)的研究和技術(shù)推廣人員及果農(nóng)對該病害了解極少，容易將其與炭疽病混淆，用常規(guī)炭疽病藥劑防治，效果很差，且噴施藥劑增加濕度，發(fā)病更為嚴(yán)重。經(jīng)研究，2種病害存在易于分辨的特征：炭疽病嫩葉從葉尖、葉緣或沿主脈開始，出現(xiàn)水漬狀，病健交接不明顯，后期變?yōu)辄S褐色，頂部嫩稍形似開水燙狀，后期變黑直接脫落;而褐斑病病葉上有褐色或黑色病斑，與炭疽病的主要區(qū)別為周圍有黃色暈圈，有塌陷病斑相連，為害嚴(yán)重時(shí)可造成枝稍枯死[14-15]。常用的多菌靈、甲基托布津、咪鮮胺等藥劑對炭疽病有效，而對褐斑病防治效果不佳。

對褐斑病菌病生理生化特性的研究還鮮有報(bào)道。僅趙圓等對分離自重慶萬州地區(qū)的一株柑橘褐斑病菌進(jìn)行了生理生化特性的研究[16]。本研究對采自云陽褐斑病分離物經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定和ITS序列分析，鑒定為柑橘褐斑病菌（Alternaria alternata）。經(jīng)生物學(xué)特性初步研究，該病原菌菌絲生長適宜溫度為15～30 ℃，最適溫度為20～25 ℃，37 ℃時(shí)不能生長，與田間發(fā)病規(guī)律相吻合。pH值為4～12均可生長，最適pH值為10.0;光照對菌絲生長影響不大;可利用多種碳、氮源，最適碳源為果糖和D-甘露醇，氮源為蛋白胨和硝酸鈉。這與趙圓等的報(bào)道不盡一致，說明不同褐斑病菌株間存在一定的差異。這為該病害的致病分子機(jī)制及綜合防治研究提供了充分的理論基礎(chǔ)，同時(shí)推動(dòng)了柑橘褐斑病菌抗病品種的篩選和培育的進(jìn)程。

參考文獻(xiàn)

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].1部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：378.

[2]胡中會(huì)，趙立華，張鐵.柑橘褐斑病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)，2015，30（1）：9-12.

[3]李紅葉，梅秀鳳，符雨詩，等.柑橘鏈格孢褐斑病的發(fā)生危害風(fēng)險(xiǎn)和治理對策[J].果樹學(xué)報(bào)，2015，32（5）：969-976.

[4]陳昌勝，黃峰，程蘭，等.紅橘褐斑病病原鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2011，41（5）：449-455.

[5]Wilmer Barrera，Hoy Jeffrey，Li Bin.Temperature and Leaf Wetness Effects on Infection of Sugarcane by Puccinia melanocephala[J].Journal of Phytopathology，2012，160（6）：294-298.

[6]N-A Cobb.Letters on the disease of plants-Alternaria of the citrus tribe[J].Agric Gaz NSW，1903，14955-986.

[7]張玉潔，楊續(xù)旺，張志信，等.柑橘褐斑病的病原分離和藥物篩選[J].北方園藝，2010，34（14）：169-171.

[8]李紅葉，梅秀鳳，符雨詩，等.柑橘鏈格孢褐斑病的發(fā)生危害風(fēng)險(xiǎn)和治理對策[J].果樹學(xué)報(bào)，2015，32（5）：969-976.

[9]方中達(dá).植病研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：122.

[10]Koichiro Tamura，Dudley Joel，Nei Masatoshi，et al.MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0[J].Molecular biology and evolution，2007，24（8）：1596-1599.

[11]唐爽爽，劉志恒，余朝閣，等.遼寧省西瓜炭疽病病原菌鑒定及生物學(xué)特性研究[J].植物保護(hù)，2014，40（4）：38-44.

[12]Koichiro Tamura，Dudley Joel，Nei Masatoshi，et al.MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis（MEGA）software version 4.0[J].Molecular biology and evolution，2007，24（8）：1596-1599.

[13]唐淬.柑橘黑斑病、褐斑病的分離鑒定及分子檢測[D].重慶：西南大學(xué)，2012.

[14]梅秀鳳.柑橘褐斑病和黑腐病病原及內(nèi)生型鏈孢菌的比較研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2016.

[15]陳國慶.中國柑橘炭疽病病原種類及種群遺傳多樣性研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2010.

[16]趙圓.柑橘褐斑病菌的生物學(xué)特性及遺傳多態(tài)性研究[D].重慶：西南大學(xué)，2014.

（2019-10-15收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1700701）;財(cái)政部中央本級專項(xiàng)（2060302）;國家發(fā)改委標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（ZYBZH-C-HLJ-17，ZYBZH-C-GD-07）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)項(xiàng)目（CARS-21）;中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（ZZXT201806）;中央本級重大增減支項(xiàng)目“名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設(shè)”（2060302）作者簡介：杜用璽（1995.08—），男，碩士研究生在讀，研究方向：藥用植物病理學(xué)，E-mail：877023154@qq.com通信作者：王鐵霖（1986.12—），女，博士，助理研究員，研究方向：藥用植物病理學(xué)，E-mail：wtl82@163.com;郭蘭萍（1969.08—），女，博士，研究員，研究方向：中藥資源，E-mail：glp01@126.com