魚鴨混養(yǎng)池塘羅非魚無乳鏈球菌病的病原分離鑒定及其防治

陳福艷 黎建斌 歐陽賢華 楊學(xué)明 黃彩林 李大列 雷愛瑩 梁萬文

摘要：【目的】查明羅非魚與鴨混養(yǎng)模式下引起羅非魚發(fā)病的主要病原，并探索微生物與中藥綜合防治的有效方法，為建立安全、高效的魚鴨混養(yǎng)模式提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā繌膹V西南寧市隆安縣那桐鎮(zhèn)某羅非魚與鴨混養(yǎng)池塘的發(fā)病羅非魚中取樣進(jìn)行病原菌分離純化，對獲得的純化分離菌株進(jìn)行16S rRNA序列測序及人工感染試驗和藥敏試驗，并在藥敏試驗的基礎(chǔ)上采用內(nèi)服結(jié)合外用消毒的方式進(jìn)行治療，且在羅非魚痊愈后使用微生物制劑（成分為芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌等）調(diào)節(jié)池塘水質(zhì)，同時給羅非魚投喂微生物制劑和中藥（三黃散、肝膽利康散和黃芪多糖）。【結(jié)果】引起羅非魚與鴨混養(yǎng)池塘中羅非魚發(fā)病的病原菌為無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），其對羅非魚的半數(shù)致死濃度（LD50）為4.7×106 CFU/mL，對羅紅霉素、青霉素、氯霉素、磺胺異惡唑、阿莫西林、利福平、頭孢克洛、呋喃唑酮、氟本尼考、頭孢氨芐和頭孢派酮等抗菌藥物高度敏感，對諾氟沙星、慶大霉素和卡那霉素不敏感（耐藥）。通過內(nèi)服氟苯尼考、三黃散、維生素K3和黃芪多糖并全塘潑灑戊二酫與苯扎溴銨混合液及過硫酸氫鉀，連續(xù)用藥14 d后羅非魚病情基本得到控制。定期潑灑微生物制劑，結(jié)合羅非魚內(nèi)服微生物制劑和中藥的效果良好，即使在高溫季節(jié)也未出現(xiàn)水質(zhì)惡化和魚類發(fā)病現(xiàn)象?！窘Y(jié)論】引起魚鴨混養(yǎng)池塘羅非魚發(fā)病的病原菌為無乳鏈球菌，可采取氟本尼考與三黃散、維生素K3和黃芪多糖聯(lián)合用藥的方法進(jìn)行治療。生產(chǎn)上，在魚鴨混養(yǎng)池塘潑灑微生物制劑及羅非魚內(nèi)服微生物制劑和中藥，對改善池塘水質(zhì)及預(yù)防疾病發(fā)生具有積極作用，能有效降低魚鴨混養(yǎng)模式下魚類的發(fā)病率。

關(guān)鍵詞： 羅非魚;魚鴨混養(yǎng)模式;無乳鏈球菌;微生物制劑;中藥

中圖分類號： S943.125.42? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）11-2583-09

Isolation， identification and prevention of the pathogen of Streptococcus agalactiae disease in tilapia of fish-duck polyculture pond

CHEN Fu-yan1， LI Jian-bin1， OUYANG Xian-hua2， YANG Xue-ming1， HUANG Cai-lin3， LI Da-lie1， LEI Ai-ying1， LIANG Wan-wen1*

（1Guangxi Academy of Fisheries Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture， Nanning? 530021， China; 2Guangxi Fangcao Angui Biotechnology Co.， Ltd.， Nanning

530001， China; 3Guangxi Aquatic Products Breeding Center， Nanning? 530031， China）

Abstract：【Objective】To identify the pathogens of tilapia diseases in a tilapia-duck polyculture pond， explore the ways to comprehensively control diseases by microorganisms and Chinese herbal medicines， and provide scientific basis for establishing a safe and efficient fish-duck polyculture model. 【Method】The pathogen of tilapia fish disease in a tilapia-duck polyculture pond in Natong， Longan， Nanning were isolated and identified， and 16S rRNA sequencing， artificial infection test and drug sensitivity test on the purified isolate were performed. Then oral administration combined with external disinfection was used for treatment based on the drug sensitivity test. After the tilapia were cured， the microbial preparations（the ingredients were bacillus， lactobacillus， yeast and photosynthetic bacteria， etc.） were used to control the water quality of the pond， and tilapia were fed with microbial preparations and traditional Chinese medicines（Sanhuangsan， Gandanlikangsan and Astragalus polysaccharides）. 【Result】The pathogen of the tilapia disease in this pond was identified as Streptococcus agalactiae， and its medium lethal concentration（LD50） for tilapia was 4.7×106 CFU/mL. It was highly sensitive to roxithromycin， penicillin， chloromycetin， sulfanisoxazole， amoxicillin， rifampicin， cefaclor， furazolidone， flubenicol， cefalexin and cefoperazone， and resistant to norfloxacin， gentamicin and kanamycin. After continuous oral administration of flufenicol， Sanhuangsan， vitamin K3， astragalus polysaccharides， and the whole pond sprayed with a concentrated glutaridine/benzamium bromide solution and potassium persulfate for 14 d， tilapia disease was basically controlled. The spray of microbial preparations regularly combined with oral administration of microbial preparations and Chinese herbal medicines had sound effects on water quality， no deterioration of water quality and disease occurred even in hot seasons. 【Conclusion】The pathogen causing tilapia in fish-duck polyculture ponds was S. agalactiae， which can be treated with the combination of flubenico， Sanhuangsan， vitamin K3 and astragalus polysaccharide. In production， spraying microbial preparations and oral administration of microbial preparations and Chinese herbal medicines on fish-duck polyculture ponds has a positive effect on improving water quality and preventing disease occurrence， and can effectively reduce the disease incidence of fish in polyculture modes.

Key words： tilapia; fish-duck polyculture; Streptococcus agalactiae; microbial preparation; Chinese herbal medicine

0 引言

【研究意義】羅非魚作為我國廣西、廣東、海南、福建和云南等地經(jīng)濟魚類的主要養(yǎng)殖品種之一（駱樂和何韜，2006），其養(yǎng)殖模式多種多樣，包括單養(yǎng)、混養(yǎng)和立體養(yǎng)殖等（劉雪兵等，2013）。無論采取哪種養(yǎng)殖模式，羅非魚均表現(xiàn)出生長速度快和抗病力強的優(yōu)點（呂業(yè)堅和黃玉玲，2011）。羅非魚與鴨混養(yǎng)是一種常見的立體養(yǎng)殖模式，養(yǎng)殖者利用周邊開闊的水岸養(yǎng)殖魚和鴨，實現(xiàn)魚鴨雙豐收（李繼業(yè)，1997;黃邦星，2007），但在該養(yǎng)殖模式下的水質(zhì)極易惡化，進(jìn)而導(dǎo)致魚病頻發(fā)（梅文濤和齊同俊，2008;袁媛等，2013），其主要原因是鴨糞直接排入池塘堆積在底泥中，糞泥經(jīng)厭氧菌分解產(chǎn)生大量的有機酸、氨氮化合物、硫化物和亞硝酸鹽，造成水質(zhì)惡化及水體pH降低，促使各種病菌快速繁殖（張千云，1999）。近年來，魚鴨混養(yǎng)模式在我國得到廣泛推廣應(yīng)用，特別是在南方地區(qū)羅非魚與鴨混養(yǎng)模式最常見，但也存在病害頻發(fā)、藥物治療效果不佳而造成羅非魚病期長和持續(xù)性死亡的現(xiàn)象，給養(yǎng)殖者帶來巨大經(jīng)濟損失（崔小華等，2014;呂小麗等，2017）。因此，明確羅非魚與鴨混養(yǎng)模式下引起羅非魚發(fā)病的主要病原，并探索藥物防治結(jié)合微生物制劑調(diào)控水質(zhì)的綜合防治措施，對促進(jìn)魚鴨混養(yǎng)模式健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有大量關(guān)于羅非魚病原菌鑒定的研究報道。譚健民和陳信廉（2010）對廣東發(fā)病羅非魚的肝臟等器官進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，明確引起羅非魚發(fā)病的病原體為海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）;黃鈞等（2012）對患豎鱗病的羅非魚進(jìn)行病原分離和鑒定，結(jié)果顯示該病是由嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）與溫和氣單胞菌（A. sobria）共同感染引起;黃艷華等（2014）從瀕死羅非魚腦部分離并鑒定出羅非魚無乳鏈球菌（S. agalactiae）;呂小麗等（2016）從大批死亡的羅非魚腹水、肝臟和心臟組織中分離出類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides），并進(jìn)行藥敏試驗，為該病的防治提供了參考。在羅非魚病害防治方面，胡大勝等（2012）對比了12種藥物對羅非魚無乳鏈球菌的抑菌效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青霉素G、鹽酸沙拉沙星、氨芐青霉素和氟苯尼考對羅非魚無乳鏈球菌的抑菌效果最佳;黃鈞等（2012）研究發(fā)現(xiàn)復(fù)達(dá)欣、菌必治、氟哌酸、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、先鋒必、特治星、氟苯尼考、鹽酸沙拉沙星和復(fù)方磺胺嘧啶等20種藥物可有效抑制羅非魚嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌;此外，張彬等（2010）研究發(fā)現(xiàn)黃連、金銀花、黃芩、大黃、連翹和黃柏等中藥水提物對羅非魚海豚鏈球菌有抑菌作用;高桂生等（2016）研究發(fā)現(xiàn)五倍子、烏梅、沙棘和蘇木4種中藥水提物對羅非魚溫和氣單胞菌有明顯抑菌作用，將其兩兩組合后發(fā)現(xiàn)五倍子+烏梅組合的抑菌效果最強;梁志凌等（2016）采用82種中藥對羅非魚無乳鏈球菌進(jìn)行體外抑菌試驗，結(jié)果顯示黃連、五倍子和紅藤等20種中藥的水提物可顯著抑制羅非魚無乳鏈球菌?！颈狙芯壳腥朦c】近年來，關(guān)于魚鴨混養(yǎng)模式的研究報道主要集中在養(yǎng)殖經(jīng)濟效益分析方面（黃秋標(biāo)等，2015;張恒和龐濤，2017），而對于在羅非魚與鴨混養(yǎng)模式下魚病病原菌的鑒定鮮見報道，且利用化學(xué)藥物、微生物或中藥針對該養(yǎng)殖模式下發(fā)生的魚病進(jìn)行防治也尚無報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】查明羅非魚與鴨混養(yǎng)池塘內(nèi)引起羅非魚發(fā)病的主要病原，并探索微生物與中藥綜合防治的有效方法，為建立安全、高效的魚鴨混養(yǎng)模式提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix和DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;奧可丹水質(zhì)測試盒購自無錫奧可丹生物科技有限公司;藥敏紙片（羅紅霉素、青霉素、氯霉素、磺胺異惡唑、阿莫西林、利福平、頭孢克洛、呋喃唑酮、氟本尼考、頭孢氨芐、頭孢派酮、恩諾沙星、諾氟沙星、慶大霉素和卡那霉素15種藥片）購自杭州天和微生物試劑有限公司;優(yōu)酸菌和碳源購自南寧歐海生物科技有限公司;氟苯尼考、恩諾沙星、維生素K3、肝膽利康散和三黃散購自北京鑫洋水產(chǎn)高新技術(shù)有限公司;戊二酫（20%）購自廣西南寧諾惠動物藥業(yè)有限公司;黃芪多糖購自成都芳水生物科技有限公司;過硫酸氫鉀購自上海泰緣生物科技股份有限公司。

1. 2 水域條件

發(fā)病羅非魚池塘位于廣西南寧市隆安縣那桐鎮(zhèn)，水源豐富、無污染，水域面積7 ha，水深2.5～3.0 m;排灌方便，周邊通風(fēng)向陽，無高大樹木等障礙物;池塘東南面有低矮的小灌木坡，鴨舍搭建在池塘北面平緩坡岸，管理人員居住用房建造在池塘西面。

1. 3 池塘清整與魚種放養(yǎng)

2018年3月中旬，當(dāng)水溫上升至18 ℃以上時開始清整池塘和清除周邊雜草和樹木，注入新水至水深達(dá)1.0～1.5 m;3月25日使用生石灰清塘，用量為2250 kg/ha。池塘水體毒性消失且水溫在20 ℃以上時開始投苗。共投放羅非魚種19.0萬尾，其中，4.0萬尾規(guī)格為100～150 g/尾，15.0萬尾規(guī)格為8～10 g/尾;且陸續(xù)投入其他配養(yǎng)品種：鯉魚種15.0萬尾、草魚種5.0萬尾、鏈魚種0.8萬尾、鳙魚種0.5萬尾及鯰魚種0.3萬尾。

1. 4 池塘日常管理

1. 4. 1 飼料投喂 主要投喂羅非魚飼料，根據(jù)羅非魚規(guī)格不斷調(diào)整飼料顆粒大小及蛋白含量。飼料為廣西百躍牌羅非魚顆粒飼料，蛋白含量為28%～32%。堅持“定時、定點、定質(zhì)和定量”的科學(xué)投喂方法，并結(jié)合天氣及魚群情況適當(dāng)調(diào)整。每天投喂2次，分別在上午8：00—9：00和下午16：00—17：00。投喂時先喂大魚后喂小魚，時間控制在40～60 min。

1. 4. 2 水質(zhì)管理 池塘適時加注新水。早期（4—6月）每半個月用生石灰調(diào)節(jié)水質(zhì)，用量為195～225 kg/ha。羅非魚發(fā)病后除正常使用生石灰調(diào)節(jié)水質(zhì)外，還添加微生物制劑調(diào)控水質(zhì)。

1. 4. 3 日常管理 增氧機每天中午開機1～2 h，凌晨開機3～5 h，主要堅持“三開三不開”原則（晴天中午開機，陰天次日清晨開機，連續(xù)陰雨半夜開機;傍晚不開機，陰雨天中午不開機，早上日出后不開機）。同時視具體情況適當(dāng)調(diào)整，以魚群不缺氧為宜。每日早中晚巡查池塘，觀察魚群的活動、進(jìn)食及水質(zhì)變化等情況，發(fā)現(xiàn)問題及時處理。

1. 5 水質(zhì)與病害監(jiān)測

池塘pH、氨氮、亞硝酸鹽及溶解氧等水質(zhì)指標(biāo)采用奧可丹水質(zhì)測試盒進(jìn)行測量，每周測量1次，測量時間為上午9：00—11：00。通過日常觀察魚群的活動、進(jìn)食及水質(zhì)指標(biāo)等情況，初步判斷其健康狀況;如發(fā)現(xiàn)魚出現(xiàn)浮頭、食量減少或不食及魚打轉(zhuǎn)等異常癥狀，則參考SC/T 7014—2006《水生動物檢疫實驗技術(shù)規(guī)范》（夏艷潔等，2007），采集病魚樣本進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1. 6 細(xì)菌分離與鑒定

參照何力等（2007）的方法，對表現(xiàn)出浮頭、打轉(zhuǎn)、突眼及體表紅腫充血等典型癥狀的瀕死羅非魚（10尾）進(jìn)行細(xì)菌分離。無菌條件下剖取病魚的腦組織、肝臟和腎臟等，取樣接種于血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落的生長情況。挑取血瓊脂培養(yǎng)基上生長的單一菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并進(jìn)行革蘭氏染色和顯微觀察。采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對純化后的細(xì)菌進(jìn)行DNA提取，然后用于PCR擴增。分離菌株16S rRNA的PCR擴增引物為16S-F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和16S-R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'），目的片段大小約1450 bp。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：細(xì)菌基因組DNA 1.0 μL，2×Taq PCR MasterMix 10.0 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各0.8 μL，以超純水補足至20.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，使用DNA膠回收試劑盒對陽性PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，然后送至上?；瞪锛夹g(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果輸入NCBI（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov）核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析，以確定細(xì)菌種類。

1. 7 回歸感染試驗

挑取純化后的分離菌株進(jìn)行人工感染試驗，用于人工感染試驗的羅非魚共200尾，規(guī)格150.0±10.0 g/尾，暫養(yǎng)期間健康無病。將羅非魚隨機均分為5組，每組2個平行，每個平行20尾魚，分別養(yǎng)殖在0.8 m3的塑料桶內(nèi)，每桶配充氣石1個。第1組為空白對照組，注射生理鹽水（0.2 mL/尾），其余4組分別注射1.5×105、1.5×106、1.5×107和1.5×108 CFU/mL的菌懸液。菌懸液用滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋。人工感染后連續(xù)觀察14 d，重點觀察和記錄羅非魚的活動及死亡情況，并測量水溫、pH和氨氮等指標(biāo)。采用Reed-Muench氏法計算細(xì)菌的半數(shù)致死濃度（LD50）。

1. 8 藥敏試驗及臨床治療

采用紙片擴散法（K-B）對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗，藥敏試驗結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）公布的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，個別藥物判斷標(biāo)準(zhǔn)參照其說明書。分離菌株經(jīng)純化培養(yǎng)后，使用滅菌生理鹽水進(jìn)行洗脫稀釋制備菌懸液（1.5×107 CFU/mL）;在無菌條件下取300 μL菌懸液涂布于胰蛋白胨大豆（TSB）培養(yǎng)皿（直徑11.5 cm）上，待培養(yǎng)基稍涼干后將藥敏紙片貼上，用攝子輕壓紙片;每個平皿貼6片，每種藥物3個平衡;37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈。根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇合適藥物，并結(jié)合臨床經(jīng)驗對患病羅非魚進(jìn)行治療。

1. 9 微生物調(diào)控水質(zhì)及中藥預(yù)防病害措施

病害治愈后，定期使用微生物制劑調(diào)節(jié)池塘水質(zhì)，并定期灌服微生物制劑和中藥以提高其免疫力。微生物制劑發(fā)酵制備：按照復(fù)合微生物干粉（含芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌等復(fù)合物）1 kg∶碳源5 kg∶暴氣自來水100 kg的比例進(jìn)行均勻攪拌，將攪拌物密封于發(fā)酵罐，置于陰涼處，或在25～35 ℃的氣溫條件下發(fā)酵2～3 d即可使用，發(fā)酵液在養(yǎng)護(hù)和使用過程中要注意防止污染。微生物制劑使用分為環(huán)境外潑和拌料內(nèi)服兩種方式。使用微生物制劑前，需提前12 h以過硫酸氫鉀進(jìn)行池塘改底。微生物制劑外潑用量為45～75 kg/ha，每隔7～10 d潑灑1次，直至羅非魚上市;在鴨子活動區(qū)用量加倍，一般選擇在晴天上午潑灑，并提前1～2 h開增氧機。微生物制劑拌料用量為飼料量的3%～4%，每隔5～7 d用藥1次，每次2～3 d，尤其在7—9月病害高發(fā)期堅持內(nèi)服直至羅非魚上市，同時堅持每周停料1 d。中藥添加方法：將2 kg三黃散、2 kg肝膽利康散和2 kg黃芪多糖添加到1 t飼料中，混勻，制成顆粒飼料，定期投喂，每隔20 d投喂1次，每次3～5 d，直至羅非魚上市前1個月。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病害暴發(fā)情況

2018年6月15日池塘內(nèi)有少量羅非魚死亡，內(nèi)服用藥[恩諾沙星（5 g/kg）和維生素K3（3 g/kg）拌料]3 d后病情有所好轉(zhuǎn)，暫停喂藥;6月18日臺風(fēng)來臨前夕，天氣悶熱，此時水溫27～29 ℃、pH 7.5～7.7、溶解氧2.3～6.0 mL/L、氨氮5.80～7.21 mg/L、亞硝酸鹽0.042～0.065 mg/L;羅非魚出現(xiàn)浮頭、反應(yīng)遲緩和游邊等異常情況。采取解救措施：加注新水、增設(shè)增氧機、施放降氨靈及應(yīng)急解毒安，雖然池塘水質(zhì)有所好轉(zhuǎn)，但羅非魚病情并未得到有效改善，死亡數(shù)由6月18日的200尾增加到6月22日的800多尾，6月15—30日累計損失羅非魚約2500 kg。

2. 2 患病魚臨床癥狀

6月15日患病羅非魚出現(xiàn)體色發(fā)黑、游動緩慢、離群獨游、打轉(zhuǎn)、不進(jìn)食或食量減少等癥狀;肉眼可觀察到大部分患病羅非魚突眼，體表充血，鰓絲紅腫充血;剖解發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)充滿血樣（圖1-A），肝臟、脾臟和腎臟紅腫、充血和出血;腸道食物較少，腸壁紅腫充血，有些腸道呈透明或半透明狀，嚴(yán)重者一觸碰腸道即破裂，有黃色水樣流出;有的腸道脹氣（圖1-B）。

2. 3 病原菌分離鑒定結(jié)果

從瀕死羅非魚腦組織、肝臟和腎臟分離獲得的菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上均能生長出乳白色的菌落，其形態(tài)一致，但大小不一（圖2-A）;革蘭氏染色及顯微觀察顯示，分離菌株為革蘭氏陽性菌（菌體紫色），菌體呈球形，排列成鏈狀，符合無乳鏈球菌的形態(tài)特征（圖2-B）;分離菌株經(jīng)再次純化培養(yǎng)獲得1株純化菌株（編號為NT0623）。

采用16S rRNA引物對分離菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果擴增獲得大小約1450 bp的目的條帶（圖3），與預(yù)期結(jié)果相符。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，測序結(jié)果（登錄號MK409988）與GenBank數(shù)據(jù)庫中的參考序列進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與無乳鏈球菌（S. aqalactiae）16S rRNA序列的同源性超過99%，即確定分離菌株是無乳鏈球菌。

2. 4 人工感染試驗結(jié)果

在27～29 ℃的水溫條件下，對分離菌株進(jìn)行人工感染試驗，連續(xù)觀察14 d，發(fā)現(xiàn)4個感染組的羅非魚均出現(xiàn)游動緩慢、打轉(zhuǎn)或掙扎等癥狀，其體表充血，感染后期死亡的羅非魚突眼現(xiàn)象十分明顯。剖檢發(fā)現(xiàn)羅非魚體內(nèi)急性敗血，腹腔內(nèi)的肝臟、脾臟、腎臟及腸道等器官紅腫充血，感染組羅非魚的剖檢病變及臨床癥狀與池塘中自然發(fā)病的羅非魚相似。各組羅非魚的累計死亡情況如表1所示，其中，對照組羅非魚的存活率為100%;其余4組羅非魚的累計死亡率為10%～100%，不同組間的死亡率差異明顯，注射菌懸液的濃度越高，羅非魚的死亡率越高。采用Reed-Muench氏法計算得到分離菌株對羅非魚的LD50為4.7×106 CFU/mL，說明該分離菌株是羅非魚自然發(fā)病的致病菌，且毒性較強。

2. 5 藥敏試驗結(jié)果及其治療效果

由表2可知，分離菌株對羅紅霉素、青霉素、氯霉素、磺胺異惡唑、阿莫西林、利福平、頭孢克洛、呋喃唑酮、氟本尼考、頭孢氨芐和頭孢派酮等藥物高度敏感，對恩諾沙星中度敏感，對諾氟沙星、慶大霉素和卡那霉素不敏感（耐藥）。

結(jié)合藥敏試驗結(jié)果及臨床用藥經(jīng)驗，采用內(nèi)服與外用消毒的方式進(jìn)行治療。內(nèi)服用藥：以氟苯尼考3 g/kg、三黃散10 g/kg、維生素K3 5 g/kg和黃芪多糖2 g/kg拌料;外用消毒：以20%戊二酫與苯扎溴銨混合液（3.75 L/ha）及過硫酸氫鉀（3.75 kg/ha）進(jìn)行池塘潑灑消毒。連續(xù)用藥3 d后病情好轉(zhuǎn)，但養(yǎng)殖戶盲目停藥，導(dǎo)致2 d后羅非魚又出現(xiàn)死亡，且死亡數(shù)量加劇;恢復(fù)用藥3 d后病情再度好轉(zhuǎn)，連續(xù)用藥14 d后病情基本得到控制，羅非魚停止死亡，并恢復(fù)正常攝食。

2. 6 微生物調(diào)控水質(zhì)及中草藥預(yù)防病害的效果

病情得到控制后，從7月起池塘定期潑灑微生物制劑以調(diào)控水質(zhì)，同時讓羅非魚內(nèi)服微生物制劑和中藥。通過監(jiān)測池塘水色和水質(zhì)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，池塘水色由原來的暗綠色（6月）逐漸轉(zhuǎn)變成黃綠色（7月）至鮮亮黃綠色（8—10月）;透明度也得到一定程度的改善（表3）;7—9月的池塘水體pH低于6月，其中7月顯著低于6月（P<0.05，下同）;溶解氧含量整體上呈上升趨勢，至10月達(dá)14.57±1.09 mg/L，顯著高于6月;7—10月的亞硝酸鹽、氨氮和磷酸鹽含量均顯著低于6月，硫化物、氯和銅含量也低于6月，但差異不顯著（P>0.05），說明定期潑灑微生物制劑后池塘水質(zhì)得到明顯改善。羅非魚病害監(jiān)測結(jié)果顯示，7—10月羅非魚鏈球菌病無復(fù)發(fā)現(xiàn)象，且健康狀況良好，剖檢羅非魚腹部發(fā)現(xiàn)其肝膽健康，色澤紅潤，腸道肌肉結(jié)實，脂肪沉積少，說明內(nèi)服微生物制劑和中藥的效果良好。綜上所述，池塘潑灑微生物制劑及羅非魚內(nèi)服微生物制劑和中藥對改善池塘水質(zhì)和預(yù)防疾病發(fā)生具有積極作用。

3 討論

羅非魚與鴨混養(yǎng)是我國南方地區(qū)常見的生態(tài)養(yǎng)殖模式，能有效降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟效益，但該養(yǎng)殖模式下羅非魚病害頻發(fā)，尤其是暴發(fā)性細(xì)菌性魚病。為明確羅非魚與鴨混養(yǎng)池塘暴發(fā)魚病的原因，本研究在廣西南寧市隆安縣那桐鎮(zhèn)某羅非魚與鴨混養(yǎng)池塘采集患病羅非魚樣本，經(jīng)細(xì)菌分離純化、形態(tài)觀察、16S rRNA測序分析及人工感染試驗，確定病原為無乳鏈球菌。無乳鏈球菌是羅非魚的主要致病菌之一，暴發(fā)性強，死亡率高，對羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的危害極大（黎婭等，2014）。羅非魚無乳鏈球菌病的主要臨床癥狀是病魚打轉(zhuǎn)游動，且多數(shù)眼球突出，因此又被稱為突眼?。◤埖落h等，2015）。本研究也發(fā)現(xiàn)患病羅非魚出現(xiàn)打轉(zhuǎn)游動與眼球突出的典型癥狀，且動物回歸試驗中人工感染的羅非魚也出現(xiàn)相同癥狀，與張德鋒等（2015）的研究結(jié)果一致。此外，對羅非魚的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查得知，發(fā)病期間天氣突變，高溫悶熱，水質(zhì)惡化，出現(xiàn)溶氧量低、氨氮增高的情況，進(jìn)一步驗證無乳鏈球菌是條件性致病菌。魚病發(fā)生是魚體生理狀態(tài)、病原體及水質(zhì)環(huán)境相互作用的結(jié)果（黃錦爐，2012）。水體環(huán)境既是鏈球菌傳播感染的媒介，也是重要的致病因素，環(huán)境惡劣導(dǎo)致魚產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，而應(yīng)激反應(yīng)是魚病暴發(fā)的重要要素。因此，在羅非魚養(yǎng)殖過程中要加強水質(zhì)、魚病和微生態(tài)環(huán)境的監(jiān)測及預(yù)警，發(fā)現(xiàn)問題及時處理，避免引起病害暴發(fā)。

近年來，隨著抗菌藥物在羅非魚病害防治上的大量使用，病原菌耐藥性、食品安全及環(huán)境污染等問題日益突出。本研究通過定期使用中藥及微生物制劑預(yù)防羅非魚無乳鏈球菌病，取得良好效果，及時控制了病害的發(fā)展。中藥與微生物制劑聯(lián)合應(yīng)用，對提高動物機體免疫機能、抗病能力及促進(jìn)其生長均具有一定的協(xié)同增效作用，可能與中藥中含有某些活性組分，如有機酸、多糖及雙歧生長因子等有關(guān)，因為這些活性組分可促進(jìn)有益微生物的生長與繁殖（劉明杰等，2001;邢躍楠和趙文，2007;鄧恒為，2013;丘金珠，2015）;同時，有益微生物在魚類腸道中能產(chǎn)生多種消化酶促進(jìn)中藥的發(fā)酵、分解和轉(zhuǎn)化過程，使其在魚體內(nèi)更好地被吸收利用而發(fā)揮藥效（王祥紅等，1998）?？梢?，中藥與微生物制劑聯(lián)合應(yīng)用將是動物病害綜合防預(yù)的新路徑。

魚鴨混養(yǎng)池塘的水質(zhì)相對更容易惡化，因此控制水質(zhì)環(huán)境是保障養(yǎng)殖成功的關(guān)鍵。養(yǎng)殖水體環(huán)境是一個由多種微生物組成的動態(tài)平衡系統(tǒng)，有益微生物和有害微生物共同存在。人為定期向養(yǎng)殖水體中潑酒適量復(fù)合微生物制劑，使各種微生物的生長特性及代謝產(chǎn)物具有多樣性，而有利于形成共生增殖關(guān)系，在新的環(huán)境里能快速形成復(fù)雜而穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，有益微生物通常能增殖成為優(yōu)勢種群（李卓佳等，1999）。養(yǎng)殖水體中有益微生物組成的優(yōu)勢種群能抑制有害微生物的生長與繁殖，在一定程度上能減少魚類病害的發(fā)生。此外，有益微生物通過分解或轉(zhuǎn)化水體中的糞便和殘餌等有害物質(zhì)，能為浮游動植物的生長與繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)，或擴散到空氣中，有效去除水體中的氨氮、亞硝酸鹽和有機質(zhì)等有害物質(zhì)，降低生物耗氧量（BOD）和化學(xué)耗氧量（COD），提高溶氧量，調(diào)節(jié)水質(zhì)pH，同時促進(jìn)底泥氮磷釋放及浮游動植物生長，進(jìn)而提高水體的生產(chǎn)能力（張進(jìn)鳳等，2009）。本研究向魚鴨混養(yǎng)池塘定期潑灑復(fù)合微生物制劑，有效避免養(yǎng)鴨對池塘造成的污染，即使在高溫季節(jié)也未出現(xiàn)水質(zhì)惡化和魚類發(fā)病現(xiàn)象。

4 結(jié)論

引起魚鴨混養(yǎng)池塘羅非魚發(fā)病的病原菌為無乳鏈球菌，可采取氟本尼考與三黃散、維生素K3和黃芪多糖聯(lián)合用藥的方法進(jìn)行治療。生產(chǎn)上，在魚鴨混養(yǎng)池塘潑灑微生物制劑及羅非魚內(nèi)服微生物制劑和中藥，對改善池塘水質(zhì)及預(yù)防疾病發(fā)生具有積極作用，能有效降低魚鴨混養(yǎng)模式下魚類的發(fā)病率。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）