豬細(xì)小病毒分子病原學(xué)研究進(jìn)展

翟銀建 沈?qū)W懷 潘孝成 趙瑞宏

摘要：豬細(xì)小病毒能引起母豬以初產(chǎn)發(fā)生流產(chǎn)、不孕，產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等為特征的豬，繁殖障礙性疾病。豬細(xì)小病毒病在世界各地的豬場(chǎng)廣泛流行，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的損失。該文主要對(duì)豬細(xì)小病毒的生物學(xué)特性、致病機(jī)理及分子結(jié)構(gòu)特性等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，以期為豬細(xì)小病毒病的研究和防控提供參考。關(guān)鍵詞：豬細(xì)小病毒;分子病原學(xué);生物學(xué)特性;致病機(jī)理;分子結(jié)構(gòu)中圖分類號(hào)：S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi：1 0.3969/j .issn.2096-3637.2019.11 .009

引言

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒（ Porcine parvovlrus，PPV）引起母豬繁殖機(jī)能障礙的主要疾病之一，主要導(dǎo)致母豬特別是初產(chǎn)母豬流產(chǎn)，產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬，以及部分仔豬關(guān)節(jié)炎和腹瀉等癥狀[1-3]。德國(guó)科學(xué)家Mary和Mahnel在1966年進(jìn)行豬瘟病毒組織培養(yǎng)時(shí)首次發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒，首次證明了其致病性。1967年，Huygelen研究團(tuán)隊(duì)在豬腎細(xì)胞培養(yǎng)物中也分離到了一株細(xì)小病毒，并在次年證明該病毒為DNA病毒[4]。白20世紀(jì)60年代，從歐洲、亞洲、美洲等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)相繼分離出該病毒，我國(guó)于1982年和1985年由潘雪珠等分離到2株該病毒，分別命名為PPVS-1株和PPVS-2株[5-6]。目前該病呈現(xiàn)世界性分布并在大多數(shù)地區(qū)呈地方流行性，而且該病感染母豬后無明顯臨床癥狀，很容易造成廣泛傳播，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響和制約養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[2]。

PPV病原生物學(xué)特性

1.1 PPV形態(tài)特征及分類

PPV是一種較小、外觀呈現(xiàn)六角形或圓形、二十面等軸立體對(duì)稱的無囊膜病毒，通過電鏡觀察，直徑約為20-26nm，能通過42nm的濾器，衣殼由32個(gè)殼粒組成[8]，PPV病毒粒子通常有2種形式，一種是含有核酸和衣殼的完全病毒，另一種是沒有核酸只有衣殼且衣殼呈中空的病毒，2種存在形式的PPV在氯化銫中的浮密度分別為1.39 g/mL和1.30g/mL，雖然存在形式不同，但都可凝集紅細(xì)胞[9]。PPV屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬成員，是目前動(dòng)物病毒中僅次于圓環(huán)病毒的最小最簡(jiǎn)單的一類單鏈線狀DNA病毒。目前發(fā)現(xiàn)的犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus）、鼠細(xì)小病毒（ Mice Minutevirus）、鵝細(xì)小病毒（Gooseparvovirus）等與PPV都同屬細(xì)小病毒屬的成員，并且這些同屬的細(xì)小病毒在進(jìn)化關(guān)系上具有很高的同源性[10]。

1.2 PPV理化性質(zhì)

PPV具有較強(qiáng)的耐熱性，56℃條件下處理30 min后病毒的血凝性和傳染性都沒有明顯變化，70℃處理后感染能力仍未喪失，只有略微下降，80℃處理5min，才會(huì)失去感染力和血凝性[11-12]。PPV在4℃條件下長(zhǎng)期穩(wěn)定，在-20℃條件下其毒力可以保存1年以上不受影響[13]。PPV對(duì)酶、脂溶劑及有機(jī)溶劑同樣也具有很強(qiáng)的抵抗力，對(duì)常規(guī)消毒劑有一定的抵抗力，在罔舍及排泄物等白然條件下可存活14周以上，PPV對(duì)酸堿具有很強(qiáng)的耐受性，pH在3.0-10.0范圍內(nèi)不影響病毒的感染能力，通常在0 5%氫氧化鈉、2%戊二醛或3%甲醛長(zhǎng)時(shí)間作用下才能使病毒滅活[14]。研究發(fā)現(xiàn)，PPV在體外培養(yǎng)增殖時(shí)在胰酶的短時(shí)間作用不僅對(duì)病毒懸液的感染性沒有影響，反而可增加病毒復(fù)制的滴度[15]。

1.3 PPV體外培養(yǎng)特性

PPV的細(xì)胞適應(yīng)性廣泛，可以在豬原代細(xì)胞、次代細(xì)胞或傳代細(xì)胞，包括豬睪丸細(xì)胞系、豬腎細(xì)胞系、牛腎細(xì)胞系等細(xì)胞系上復(fù)制增殖，甚至可在Hela、Hep-2等人的細(xì)脆系上正常生長(zhǎng)[16]。PPV的細(xì)胞培養(yǎng)接毒與其他病毒培養(yǎng)的方法有明顯區(qū)別，接種時(shí)機(jī)應(yīng)在細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)，通常是待細(xì)胞鋪壁占細(xì)胞瓶的1/2或1/3時(shí)接毒，這是由于PPV需要依靠宿主細(xì)胞DNA聚合酶進(jìn)行病毒自身核酸的復(fù)制，當(dāng)接種條件適當(dāng)時(shí)，通常接種后2-3d即可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變[17]。雖然PPV可以在多種細(xì)胞上進(jìn)行增殖，但其對(duì)不同種類細(xì)胞的適應(yīng)性有明顯差異，研究證實(shí)PPV對(duì)豬睪丸細(xì)胞系（ST細(xì)胞系）的適應(yīng)性最好，豬腎細(xì)胞系（PK-1 5細(xì)胞系）[18]。PPV在細(xì)胞中多次傳代后，以空病毒粒子形式出現(xiàn)的病毒顆粒比例會(huì)升高，進(jìn)而會(huì)抑制病毒的復(fù)制，因此，體外高傳代培養(yǎng)病毒時(shí)，病毒滴度會(huì)有較為明顯的降低[19]。PPV還存在接毒時(shí)間、劑量的依賴性差異，李智力等人通過對(duì)PPV接毒時(shí)間TOI、MOI和收毒時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，成功建立了基于PK-15細(xì)胞反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)的PPV培養(yǎng)工藝，在5L反應(yīng)器上最大病毒滴度達(dá)到107.2TCID50/mL，并首次發(fā)現(xiàn)乳酸對(duì)葡萄糖得率與病毒滴度具有正相關(guān)性[20]。

PPV感染臨床癥狀及致病機(jī)理

PPV感染以母豬的繁殖障礙為主要特征，即產(chǎn)死產(chǎn)、木乃伊胎、胚胎死亡和不孕，在急性感染條件下，雖然沒有明顯的臨床表現(xiàn)，但在發(fā)病母豬和仔豬的器官和組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量PPV才存在。母豬在懷孕期感染PPV往往不會(huì)引起明顯的特征性病變，但其可能引起子宮內(nèi)膜輕度炎癥、子宮上皮組織和固有層出現(xiàn)彌漫性或者局灶性的單核細(xì)胞浸潤(rùn)、妊娠黃體萎縮、胎盤鈣化等癥狀;流產(chǎn)死胎肝臟、脾臟、腎臟等明顯腫大、質(zhì)地變脆、色素暗沉等;感染的體弱仔豬產(chǎn)m后，在四肢及頸胸部的內(nèi)側(cè)出現(xiàn)淤血斑，并有m血現(xiàn)象，全身皮膚黏膜發(fā)紺，最后衰竭死亡;感染死胎經(jīng)組織病理學(xué)觀察，可在組織器官內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞壞死和核內(nèi)包涵體，大腦出現(xiàn)特征性的腦膜炎病變[21-22]。研究表明，PPV與豬的消瘦綜合征以及豬的非化膿性心肌炎有關(guān)[23]。張洪玲[24]對(duì)PPV誘導(dǎo)豬胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，PPV可通過激活p53介導(dǎo)的線粒體通路誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞凋亡，PPV感染原代和永生化豬胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，通過激活細(xì)胞內(nèi)Fas/FasL介導(dǎo)的通路和p53介導(dǎo)的線粒體通路誘導(dǎo)豬胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡。張棵[25]研究PPV感染對(duì)黃體細(xì)胞的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，PPV感染激活了p53信號(hào)通路，并通過活化的p53調(diào)控線粒體通路誘導(dǎo)黃體細(xì)胞凋亡，并可通過下調(diào)孕酮合成過程中的關(guān)鍵蛋白StAR及關(guān)鍵酶3B-HSD和CYPllA1的表達(dá)，抑制黃體細(xì)胞孕酮的合成。張?jiān)姥芯勘砻鱌PV感染ST細(xì)胞后可誘導(dǎo)細(xì)胞白噬的發(fā)生，而且白噬的發(fā)生反向促進(jìn)病毒的復(fù)制，并揭示了atg5基因在其中發(fā)揮的重要作用，該研究為探明PPV的致病機(jī)理提供新的理論依據(jù)[26]。

PPV分子結(jié)構(gòu)特征

3.1 PPV基因組結(jié)構(gòu)

PPV是能夠白主復(fù)制的單鏈線狀DNA病毒，大小約為5000bp，成熟的病毒粒子僅含有負(fù)鏈DNA基因組。由于病毒單鏈基因很容易發(fā)生折疊，進(jìn)而結(jié)合構(gòu)成Y形發(fā)夾結(jié)構(gòu)和U形發(fā)夾等二級(jí)結(jié)構(gòu)[27]。成熟病毒粒子DNA的3端Y字形結(jié)構(gòu)由120個(gè)核苷酸構(gòu)成，根部有80個(gè)核苷酸形成，Y字上部40個(gè)核苷酸構(gòu)成，其中3端的部分基因是保守序列;5'端U形結(jié)構(gòu)由127nt構(gòu)成，是通過1個(gè)24nt的短回文序列截?cái)嗔?'端127nt處的回文序列折疊而成，5'端環(huán)狀結(jié)構(gòu)（Loop）在對(duì)病毒核酸的復(fù)制發(fā)揮重要作用，如果丟失PPV將無法復(fù)制，但如果在5'端核酸70-80個(gè)核苷酸的位置發(fā)生少量的基因丟失，并不會(huì)對(duì)PPV在宿中細(xì)胞中的核酸復(fù)制產(chǎn)生影響[25]。PPV具有ORF1和ORF2 2個(gè)開放閱讀框，5'端的開放閱讀框負(fù)責(zé)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，3'端的開放閱讀框負(fù)責(zé)編碼結(jié)構(gòu)蛋白，其中由P4早期啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的NS1和NS22個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)病毒DNA的復(fù)制發(fā)揮重要作用;晚期啟動(dòng)子P40轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)蛋白VPI和VP2，兩者以1：10的比例組裝形成直徑約20-25nm的核衣殼[29]。VP2結(jié)構(gòu)蛋白完全包含于VP1蛋白中，并與之重疊，VP3結(jié)構(gòu)蛋白則由VP2蛋白切割形成，所以轉(zhuǎn)錄的mRNAs都終止于94-96mu的Poly （A）終止信號(hào)處[30]。

3.2 PPV的DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄

PPV的復(fù)制需要借助宿主細(xì)胞的體系完成，當(dāng)細(xì)胞處于旺盛的有絲分裂時(shí)，細(xì)胞內(nèi)積聚的DNA聚合酶可以被PPV用于合成白身基因組，因此，處于細(xì)胞周期S期的晚期和G2期早期的細(xì)胞最有利于該病毒的復(fù)制。在PPV基因組復(fù)制過程中，其3'端可進(jìn)行自我回折，產(chǎn)生DNA聚合酶所需引物-OH，因此PPV的復(fù)制過程不需要DNA環(huán)化和RNA引物的作用，在DNA聚合酶的作用下，從PPV基因組3'端Y型發(fā)夾結(jié)構(gòu)起始合成互補(bǔ)鏈，將感染的親代DNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈復(fù)制型DNA，然后以合成的正反鏈DNA為模板，合成子代病毒組裝所需的DNA和轉(zhuǎn)錄mRNA[31]。

PPV感染宿主細(xì)胞后，早期啟動(dòng)子P4從基因組的225核苷酸處起始轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生的原始轉(zhuǎn)錄物為PT4;晚期啟動(dòng)子P40從2035核苷酸處起始轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物PT40，2個(gè)轉(zhuǎn)錄共同終止于poly （A）的終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)區(qū)。PT4分別經(jīng)過C型拼接、D型拼接或者不進(jìn)行拼接，產(chǎn)生大量的次級(jí)轉(zhuǎn)錄基因，分別翻譯為結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。編碼161個(gè)氨基酸的非結(jié)構(gòu)蛋白NS2（ 18.1KD），該蛋白N端的86個(gè)氨基酸與NSI完全相同，NS2獨(dú)有的75個(gè)氨基酸分布在蛋白的C末端;非結(jié)構(gòu)蛋白NS3（12.4KD）由106個(gè)氨基酸構(gòu)成，其N端的86個(gè)氨基酸序列與NSI完全一致，C端的20個(gè)氨基酸與NS1不同，但與VP1編碼區(qū)重疊，然而目前仍沒有明確的證據(jù)證明PPV感染的細(xì)胞中存在NS3蛋白;PT4不經(jīng)過拼接產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，由663個(gè)氨基酸構(gòu)成;PT40通過B型拼接產(chǎn)生約29 kb的VPlmRNA，經(jīng)過A型拼接產(chǎn)生約29kb的VP2 mRNA，VPI mRNA和VP2 mRNA從不同位置的ATG起始翻譯，產(chǎn)生2種結(jié)構(gòu)蛋白VPI（80.9KD）和VP2（6.43KD）[32].

3.3 PPV主要結(jié)構(gòu)蛋白及功能

PPV基因組編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是分子質(zhì)量為83KD的VP1、為64KD的VP2和60KD的VP3，均是由基因組右側(cè)的ORF編碼，而VP3不是由mRNA翻譯的產(chǎn)物，則是VP2水解后的產(chǎn)物[33]。在VP1蛋白的N端存在一個(gè)脯氨酸積聚區(qū)域，該區(qū)域在介導(dǎo)PPV進(jìn)入宿主細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用;VP2是具有紅細(xì)胞凝集功能的蛋白，同時(shí)也是構(gòu)成病毒殼表面蛋白的主要成分，此外，VP2蛋白還可以進(jìn)行自我裝配，形成類病毒的蛋白粒子，陔蛋白粒子具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[34]。宋文博[35等通過PCR擴(kuò)增8株P(guān)PV毒株的VP2基因，通過測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不同分離毒株的VP2蛋白氨基酸同源性較高，僅存在個(gè)別氨基酸位點(diǎn)的差異，同時(shí)也構(gòu)建了rPRVSMX-VP2重組毒株，通過小鼠安全性試驗(yàn)證明：rPRVSMX-VP2可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生與載體毒相當(dāng)水平的PPV抗體，誘導(dǎo)產(chǎn)生的PPV血凝抑制抗體（HI抗體）可達(dá)到1：27。VP1、VP2和VP33種蛋白是PPV的結(jié)構(gòu)蛋白，也是具有良好免疫原性的蛋白，Mollter[36]等分別用VP1、VP2和VP3 3種蛋白免疫家兔均能誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制血凝抗體和中和抗體，并且血凝抑制抗體滴度和中和滴度具有平行關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)在豬細(xì)小病毒的結(jié)構(gòu)蛋白上存在3個(gè)抗原表位區(qū)，分別是病毒蛋白轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)區(qū)Loopl和Loop3近區(qū)域、二折疊下陷和三折疊突起區(qū)之間和鄰近三折疊中心區(qū)，這些外露的抗原表位區(qū)域，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體。

3.4

PPV主要非結(jié)構(gòu)蛋白及功能

PPV基因組編碼3種非結(jié)構(gòu)蛋白，分別是分子質(zhì)量為78.5 KD的NS1、18.1 KD的NS1、12.4KD的NS3，均是由基因組左側(cè)的ORF編碼，NSI和NS22種非結(jié)構(gòu)蛋白均是從P4啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄，2種非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制和包裝中發(fā)揮十分重要的作用[37]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，除NSI和NS22種非結(jié)構(gòu)蛋白外，SAT蛋白也是一個(gè)晚期的NS蛋白，其轉(zhuǎn)錄南晚期啟動(dòng)子調(diào)控，但目前關(guān)于SAT蛋白的研究很少，其生物學(xué)作用仍然不清楚[38]。NS1蛋白是由經(jīng)拼接大小為4.7kb的mRNA翻譯產(chǎn)生，其含有細(xì)小病毒屬病毒共有的保守守序列[39]。孫秀[40]對(duì)分離到的45株P(guān)PV毒株的NSI基因進(jìn)行克隆，并對(duì)基因序列進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NSI核酸序列同源性性達(dá)98.2% - gg.g%，氨基酸序列同源性為98.0%-99.7%，結(jié)果同樣表明PPV的NSI基因具有高度的同源性，通過對(duì)氨基酸序列的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)相對(duì)容易突變的氨基酸位點(diǎn)有12個(gè)，其氨基酸位點(diǎn)依次為55（V→A）、59（N→D）、164（V→A）、195（R→K）、242（G→S）、358（S→G）、544（ A→S）、562（ K→R）、568 （M→I）、579（Q→K，Q→P）、590（ D→N）和633（ I→M，I→V）。研究發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白在細(xì)小病毒的組裝過程中發(fā)揮重要作用，在病毒新復(fù)制的單鏈DNA基因組的5'末端通過共價(jià)健與NS1連結(jié)，隨后在病毒轉(zhuǎn)配過程中NS1被移除，并且連在病毒粒子的外層[41]。非結(jié)構(gòu)蛋白NSI同樣具有抗原性，并雖然其含量很低，但在病毒復(fù)制時(shí)能持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。PPV的NS2蛋白南161個(gè)氨基酸構(gòu)成，NS2蛋白的表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞有一定的選擇性，不是在所有的宿主細(xì)胞中都能表達(dá)NS2蛋白，只在相適應(yīng)宿主細(xì)胞中才會(huì)表達(dá)[42]。由于NS2蛋白和NS3蛋白相對(duì)較小，對(duì)這2種非結(jié)構(gòu)蛋白的研究較少，對(duì)其承擔(dān)的生物學(xué)功能和意義仍然不十分清楚，有待進(jìn)一步研究。

結(jié)束語(yǔ)

PPV早期的研究主要集中于病原學(xué)、理化性質(zhì)、防治措施等方面，白20世紀(jì)80年代，各國(guó)的研究者逐漸加強(qiáng)了關(guān)于PPV分子結(jié)構(gòu)和基因組成等方面研究。目前，對(duì)PPV的分子結(jié)構(gòu)特征有了較為清楚的了解，但是對(duì)于VP3的功能研究、NSI調(diào)節(jié)P40啟動(dòng)子、PPV基因組的同源性高但毒力存在很大差異以及對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究?jī)H限于3'端等問題仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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