斑馬魚(yú)對(duì)銅、鉛和鎳的生物富集動(dòng)力學(xué)研究

甘露菁 榮菡 楊丹 王磊

摘?要：以斑馬魚(yú)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用雙箱動(dòng)力學(xué)模型模擬了其暴露在不同濃度的3種重金屬（Cu、Pb、Ni）養(yǎng)殖水中，考察其在富集與排出過(guò)程中的生物富集規(guī)律，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)重金屬含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行非線(xiàn)性擬合，得到斑馬魚(yú)富集重金屬的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。對(duì)模型擬合度檢驗(yàn)表明雙箱動(dòng)力學(xué)模型擬合程度良好，可用于描述Cu、Pb和Ni在斑馬魚(yú)體內(nèi)的生物富集規(guī)律。結(jié)果表明：斑馬魚(yú)對(duì)水中重金屬的富集能力與暴露濃度呈正相關(guān)，而其對(duì)不同重金屬的富集具有選擇性，對(duì)3種重金屬生物富集能力由強(qiáng)到弱排序?yàn)镃u>Pb>Ni，其中斑馬魚(yú)對(duì)Cu的富集能力極強(qiáng)。此外，斑馬魚(yú)對(duì)3種重金屬的排出速率系數(shù)與生物半衰期均與暴露濃度無(wú)明顯相關(guān)性，不同種類(lèi)的重金屬在斑馬魚(yú)體內(nèi)的生物半衰期按時(shí)間長(zhǎng)短排序?yàn)镹i>Pb>Cu，但排出階段結(jié)束后，斑馬魚(yú)體內(nèi)的重金屬濃度依然高于初始濃度數(shù)倍甚至數(shù)十倍。

關(guān)鍵詞：斑馬魚(yú);生物富集動(dòng)力學(xué);銅;鉛;鎳

近年來(lái)，我國(guó)水體重金屬污染問(wèn)題十分突出，大量的重金屬元素排放至地表徑流進(jìn)入水生生態(tài)環(huán)境[1]，影響水生生物食品安全性[2-4]，人類(lèi)食用重金屬超標(biāo)的水生生物后會(huì)造成不同程度的急性或慢性中毒現(xiàn)象[5]。斑馬魚(yú)因具有時(shí)代周期短、產(chǎn)卵多且受精卵容易觀察等優(yōu)點(diǎn)，被很多學(xué)者當(dāng)做受試生物用在重金屬對(duì)水生生物的毒性作用研究中。如李淑瓊等[6]采用斑馬魚(yú)為試驗(yàn)生物，進(jìn)行了靜態(tài)方式的急性毒性試驗(yàn)，獲得了Zn、Cr、Cd的12 h半致死濃度。李汝等[7]將斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)行為學(xué)與水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了生物魚(yú)運(yùn)動(dòng)學(xué)指標(biāo)監(jiān)測(cè)水質(zhì)變化的目標(biāo)。但目前將斑馬魚(yú)用在對(duì)重金屬污染的生物作用過(guò)程研究較為少見(jiàn)，尤其是缺乏富集動(dòng)力學(xué)方面的研究，使得人們對(duì)重金屬在魚(yú)類(lèi)體內(nèi)富集的動(dòng)力學(xué)特征缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。雙箱動(dòng)力學(xué)作為一種數(shù)學(xué)模型，普遍用于重金屬的生物富集研究，如貽貝[ 8-9]、牡蠣[10]、滸苔[11]等。本研究以斑馬魚(yú)作為研究對(duì)象，運(yùn)用雙箱動(dòng)力學(xué)模型研究銅（Cu）、鉛（Pb）和鎳（Ni）3種重金屬在不同濃度下在其體內(nèi)的生物富集動(dòng)力學(xué)特性，以提高對(duì)其動(dòng)力學(xué)特性的系統(tǒng)認(rèn)識(shí)，對(duì)斑馬魚(yú)用于重金屬預(yù)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)，也可為魚(yú)類(lèi)富集重金屬的食用安全研究提供支撐。

1?材料與方法

1.1?動(dòng)物、材料與試劑

斑馬魚(yú)，購(gòu)于珠海市拱北花鳥(niǎo)魚(yú)市場(chǎng)，體質(zhì)量0.35±0.08g。實(shí)驗(yàn)前對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行馴養(yǎng)[12]，時(shí)間為7d，期間維持自然光照周期，養(yǎng)殖水溫27±1℃，pH值7.0±0.5，溶解氧不低于5.0mg/L，自來(lái)水充分曝氣24h作為培養(yǎng)用水，飼喂魚(yú)專(zhuān)用全價(jià)顆粒料，購(gòu)自青島海洋大學(xué)飼料廠(chǎng)。實(shí)驗(yàn)期間亦保持此飼養(yǎng)條件。Cu、Pb、Ni標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000mg/L），購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，ICP-MS調(diào)諧液，由Perkin Elmer原裝進(jìn)口，濃硝酸為優(yōu)級(jí)純，天津大茂，水為超純水，所用容量瓶使用前均經(jīng)20%硝酸浸泡3d。

1.2?儀器與設(shè)備

ELAN DRC-e電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)Perkin Elmer公司;Mars5微波消解儀，美國(guó)CEM公司;Mili-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司。

1.3?方法

1.3.1?樣品采集?參考GB 11607—1989《國(guó)家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)Cu、Pb和Ni含量的規(guī)定設(shè)計(jì)暴露濃度。實(shí)驗(yàn)按照Cu、Pb和Ni暴露濃度分為4組，即空白對(duì)照組（Cu、Pb和Ni的濃度為0）、低劑量組（Cu、Pb和Ni的濃度均為10μg/L）、中劑量組（Cu、Pb和Ni的濃度均為50μg/L）、高劑量組（Cu、Pb和Ni的濃度均為100μg/L）。斑馬魚(yú)置于100L聚乙烯水箱中，每組水箱中加入60L含有不同濃度Cu、Pb和Ni的復(fù)合溶液。每個(gè)水箱中放入斑馬魚(yú)300只，進(jìn)行重金屬的富集。實(shí)驗(yàn)采用半靜態(tài)的方法，每天換 1 次同種濃度的實(shí)驗(yàn)用水，以保持水體中重金屬濃度恒定。富集實(shí)驗(yàn)時(shí)間為20d，取樣間隔為4h、12h、1d、2d、4d、6d、8d、12d、20d，每次隨機(jī)取10條斑馬魚(yú)進(jìn)行分析，采集的魚(yú)樣用蒸餾水沖洗后，整魚(yú)勻漿后冷凍，備分析。富集實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即進(jìn)行排出實(shí)驗(yàn)，將剩下的斑馬魚(yú)置于另一批100L水箱中，4組均不再向水中加入重金屬，排出階段為20d，取樣間隔為1、2、4、6、8、12、20d，采樣方法同上。

1.3.2?樣品制備與分析?準(zhǔn)確稱(chēng)取勻漿后的斑馬魚(yú)樣品0.5g置于微波消解罐中，加硝酸6mL后，置于已設(shè)定好程序的微波工作站中進(jìn)行消解，升溫程序?yàn)? min 升溫至 120 ℃保持 3 min，2 min升溫至 150 ℃保持 3 min，2 min 升溫至 200 ℃保持 12 min[13]。

ICP-MS操作參數(shù)：等離子體氣流量：15L/min;射頻功率：1 100W，霧化室溫度：2 ℃;霧化器流量：0.89L/min;輔助氣流量：1.2L/min，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速：24r/min;離子透鏡電壓：10V;數(shù)據(jù)采樣模式：跳峰采集模式;采樣深度：10 mm;重復(fù)次數(shù)：3 次;掃描次數(shù)：100 次。

1.3.3?實(shí)驗(yàn)應(yīng)用模型?目前重金屬在生物體和水體之間的作用過(guò)程多用兩相分配模型中的雙箱動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行描述[14]。重金屬在生物體內(nèi)的富集通?？煽醋魇侵亟饘僭谏矬w與水相之間的兩相間的分配過(guò)程，則富集及釋放過(guò)程可用一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程對(duì)其進(jìn)行描述（圖1）。

其中，含有重金屬污染物的水體作為第一相，生物體作為第二相，那么水體相中重金屬濃度的變化為：

而生物體相中重金屬的濃度變化為：

式（2）中，C-W為水體相中重金屬污染物的濃度（μg/L）;C-A為生物體相中重金屬污染物的濃度（μg/kg）;t為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的時(shí)間（d）;K-1為生物吸收速率常數(shù);K-2為生物排出速率常數(shù);K-M為生物代謝速率常數(shù);K-V為重金屬污染物揮發(fā)速率常數(shù)。由于本實(shí)驗(yàn)中重金屬在體內(nèi)難以揮發(fā)，且短時(shí)間內(nèi)在斑馬魚(yú)體內(nèi)的代謝影響基本可以忽略，故可將K-M和K-V視為零。因此，由式（1）～（2）推導(dǎo)可得斑馬魚(yú)對(duì)重金屬的富集和排出方程[15]：

式（4）中，t*為富集階段的實(shí)驗(yàn)天數(shù)（d），本研究中為20d;C-0為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前生物體內(nèi)原本含有的重金屬污染物濃度（μg/kg）。

根據(jù)式（3）～（4），對(duì)監(jiān)測(cè)所得重金屬濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行非線(xiàn)性擬合得到K-1 和K-2值。那么在理論平衡狀態(tài)下，可求得生物富集系數(shù)（bioconcentration factors，BCF）：

重金屬的生物學(xué)半衰期，即生物體排出一半體內(nèi)的重金屬所需要的時(shí)間：

亦可通過(guò)模型計(jì)算出生物富集達(dá)到理論平衡時(shí)，體內(nèi)重金屬的最大含量C-Amax：

1.4?數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用Excel 2010及Origin 8.0進(jìn)行模型擬合與分析。通過(guò)卡方檢驗(yàn)結(jié)合判定系數(shù)R2來(lái)評(píng)價(jià)該模型的擬合度，驗(yàn)證雙箱模型用于斑馬魚(yú)對(duì)重金屬Cu、Pb、Ni的生物富集研究可行性。

2?結(jié)果與分析

2.1?3種重金屬在斑馬魚(yú)體內(nèi)的富集與排出規(guī)律

由圖2可知，富集階段Cu在斑馬魚(yú)體內(nèi)的富集量與對(duì)照組相比都有明顯升高，且都與富集時(shí)間、暴露質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。富集時(shí)間結(jié)束時(shí)（20d），斑馬魚(yú)對(duì)3種不同質(zhì)量濃度的Cu富集均未達(dá)到平衡，但富集量已分別達(dá)到初始濃度的8.9（10μg/L暴露質(zhì)量濃度）、18.5（50μg/L暴露質(zhì)量濃度）、28.2倍（100μg/L暴露質(zhì)量濃度）。

在排出階段，Cu在斑馬魚(yú)體內(nèi)的富集量明顯隨著排出時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，并在排出階段的第8天后趨于平緩。但實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，體內(nèi)的Cu濃度依然是初始濃度的4～16倍。

由圖3可知，與Cu相似，富集階段Pb在斑馬魚(yú)體內(nèi)的富集量與對(duì)照組相比都有明顯升高，且都與富集時(shí)間、暴露質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。富集時(shí)間結(jié)束時(shí)（20d），斑馬魚(yú)對(duì)3種不同質(zhì)量濃度的Pb富集均未達(dá)到平衡，但富集量已分別達(dá)到初始濃度的16.1（10μg/L暴露質(zhì)量濃度）、21.7（50μg/L暴露質(zhì)量濃度）、29.0倍（100μg/L暴露質(zhì)量濃度）。在排出階段，Pb在斑馬魚(yú)體內(nèi)的富集量隨著排出時(shí)間的延長(zhǎng)明顯減少，并在排出階段的第8天后減少幅度趨于平緩。40d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，體內(nèi)的Pb濃度依然是初始濃度的9.8～19.3倍。

由圖4可知，與前兩種重金屬相似，富集階段Ni在斑馬魚(yú)體內(nèi)的富集量與對(duì)照組相比都有明顯升高，且都與富集時(shí)間、暴露質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。富集時(shí)間結(jié)束時(shí)（20d），斑馬魚(yú)對(duì)3種不同質(zhì)量濃度的Ni富集均未達(dá)到平衡，但富集量已分別達(dá)到初始濃度的6.0（10μg/L暴露質(zhì)量濃度）、10.3（50μg/L暴露質(zhì)量濃度）、14.6倍（100μg/L暴露質(zhì)量濃度）。在排出階段，Ni在斑馬魚(yú)體內(nèi)的富集量明顯隨著排出時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，但實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，體內(nèi)的Ni濃度依然是初始濃度的2.7～7.7倍。

2.2?3種金屬在斑馬魚(yú)體內(nèi)的生物富集動(dòng)力學(xué)參數(shù)

對(duì)圖2～4的數(shù)據(jù)進(jìn)行非線(xiàn)性擬合，得到吸收速率常數(shù)K-1、排出速率常數(shù)K-2，再根據(jù)式（5）～（7）得到斑馬魚(yú)對(duì)3種重金屬生物富集的其他動(dòng)力學(xué)參數(shù)BCF、體內(nèi)理論平衡最大濃度（C-Amax）和生物半衰期（附表）。

由附表可見(jiàn)，斑馬魚(yú)對(duì)3種重金屬Cu、Pb和Ni的K-1、BCF、C-Amax基本隨著重金屬暴露濃度增大而增大，而K-2則與暴露濃度無(wú)明顯相關(guān)性。BCF描述的是生物對(duì)污染物的富集能力，對(duì)比可知，斑馬魚(yú)對(duì)3種不同重金屬的富集能力排序?yàn)镃u>Pb>Ni，其中對(duì)Cu的富集能力極強(qiáng)，此富集能力排序與Lim等[16]的研究相似。生物半衰期描述的是生物排出體內(nèi)污染物的能力，由附表可見(jiàn)，暴露濃度對(duì)排出時(shí)間基本沒(méi)有影響，但是不同種類(lèi)的重金屬在斑馬魚(yú)體內(nèi)不同，其排序?yàn)镹i>Pb>Cu，其中Ni的平均為32.5d、Pb的為15.9d、Cu的為12.9d。由此可見(jiàn)，斑馬魚(yú)對(duì)Cu的富集能力較強(qiáng)，但排出速度也較快，而其對(duì)Ni的富集能力較弱，但排出亦慢。

從附表可以看出，3種重金屬不同濃度下的回歸方程都達(dá)到極顯著水平（P<0.001），相關(guān)系數(shù)R2都在0.9以上，可見(jiàn)此模型擬合程度良好，可用于描述Cu、Pb、Ni在斑馬魚(yú)體內(nèi)的富集與排出規(guī)律。

3?結(jié)論

本研究通過(guò)模擬斑馬魚(yú)養(yǎng)殖環(huán)境，使其分別暴露在重金屬Cu、Pb和Ni濃度分別為10、50、100μg/L的養(yǎng)殖水中，通過(guò)在不同時(shí)間測(cè)定斑馬魚(yú)體內(nèi)重金屬的濃度變化，研究斑馬魚(yú)對(duì)3種重金屬的富集規(guī)律。研究分為富集階段與排出階段，在富集階段中，斑馬魚(yú)對(duì)水中重金屬的富集能力隨著暴露濃度增加而增加，而其對(duì)不同重金屬的富集具有選擇性，3種重金屬中，斑馬魚(yú)對(duì)Cu的富集能力極強(qiáng)，其C-Amax最高可達(dá)1.8×106μg/kg，BCF最高可達(dá)1.8×104。斑馬魚(yú)對(duì)3種重金屬生物富集能力由強(qiáng)到弱排序?yàn)镃u>Pb>Ni。在排出階段中，斑馬魚(yú)對(duì)3種重金屬的排出速率系數(shù)與生物半衰期均與暴露濃度無(wú)明顯相關(guān)性，不同種類(lèi)的重金屬在斑馬魚(yú)體內(nèi)的B1/2按時(shí)間長(zhǎng)短排序?yàn)镹i>Pb>Cu，但排出階段結(jié)束后，斑馬魚(yú)體內(nèi)的重金屬濃度依然高于初始濃度數(shù)倍甚至數(shù)十倍，說(shuō)明受到重金屬污染的斑馬魚(yú)，即使在無(wú)重金屬污染的水中進(jìn)行飼養(yǎng)，依然難以達(dá)到釋放重金屬的目的。本研究有助于了解Cu、Pb和Ni 3種重金屬在斑馬魚(yú)體內(nèi)的生物富集動(dòng)力學(xué)特性，對(duì)斑馬魚(yú)用于重金屬預(yù)測(cè)，尤其是Cu，提供科學(xué)依據(jù)與研究支撐。

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（責(zé)任編輯?唐建敏）