雜交水稻骨干親本W(wǎng)x基因第一內(nèi)含子+1位堿基多態(tài)性分析

連玲 潘麗燕 朱永生 許惠濱 鄭燕梅 何煒 羅曦 王穎妲 蔡秋華 謝華安 張建福

摘要：[目的]直鏈淀粉含量是影響稻米品質(zhì)的重要因素，而編碼顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（granule-boundstarchsynthetase，GBSS）的蠟質(zhì)基因（Wx）是影響直鏈淀粉含量的主效基因。本研究擬分析120份雜交水稻親本的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基的多態(tài)性，以期研究其對(duì)內(nèi)含子的剪接效率及Wx的表達(dá)的影響，為親本育種篩選提供理論參考。[方法]選取120份水稻親本材料，采用CTAB法提取基因組DNA，并以此為模版PCR擴(kuò)增Wx基因片段;采用限制性內(nèi)切酶AccI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，根據(jù)瓊脂糖電泳結(jié)果分析Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型;同時(shí)測(cè)定其中19份親本的直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值。[結(jié)果]PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示所有材料中均可擴(kuò)增出清晰且單一的目的條帶;PCR產(chǎn)物的AccI酶切分析結(jié)果顯示，其中81份親本的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基是T，即為T型，占總數(shù)的67.5%，38份親本為G型，占總數(shù)的31.67%，而僅有1份親本為雜合型，即GT型，占總數(shù)的0.83%。19份親本的直鏈淀粉含量測(cè)定結(jié)果表明，7份G型親本的直鏈淀粉含量比12份T型親本的高，且其中6個(gè)G型親本的直鏈淀粉含量平均值均超過20%。另外，測(cè)定結(jié)果表明T型親本和G型親本的膠稠度和堿消值差別不明顯。[結(jié)論]120份雜交水稻骨干親本的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型測(cè)定結(jié)果表明，與T型親本相比，G型親本的直鏈淀粉含量明顯較高，而膠稠度和堿消值沒有明顯差別。

關(guān)鍵詞：Wx基因;第一內(nèi)含子;堿基多態(tài)性;直鏈淀粉含量

中圖分類號(hào)：S511文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2019）12-1355-09

0 引言

[研究意義]隨著人們對(duì)稻米品質(zhì)要求的提高，水稻育種在注重提高產(chǎn)量的同時(shí)也越來越重視稻米品質(zhì)的改良。直鏈淀粉含量是稻米食用和蒸煮加工品質(zhì)的重要影響因素，稻米中直鏈淀粉含量高使得米飯硬、口感差，而其含量太低則導(dǎo)致米飯?zhí)涴そY(jié)，口感也不好，因此適中的直鏈淀粉含量是優(yōu)質(zhì)米的重要指標(biāo)。稻米中直鏈淀粉含量主要由Wx基因編碼的顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（GBSS）所決定，而Wx的表達(dá)量與該基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型直接相關(guān)。因此，對(duì)Wx基因序列進(jìn)行相關(guān)分析可為提高稻米品質(zhì)育種效率提供必要的理論參考。

[前人研究進(jìn)展]Wx基因位于6號(hào)染色體，Wang等克隆獲得了水稻W(wǎng)x基因，全長5499bp，包括5’及3'非翻譯區(qū)、13個(gè)內(nèi)含子和14個(gè)外顯子;蛋白編碼區(qū)CDS全長1830bp，編碼609個(gè)氨基酸。Wx基因的表達(dá)與直鏈淀粉含量密切相關(guān)，將反義Wx基因?qū)攵i稻保持系岡4B和II-32B，結(jié)果顯示純合轉(zhuǎn)基因成熟種子中直鏈淀粉含量均有不同程度降低;陳剛等將反義Wx基因?qū)胛溥\(yùn)粳7號(hào)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株穎果中Wx蛋白減少，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶活性明顯下降，直鏈淀粉含量下降，總淀粉含量也顯著降低。研究表明Wx基因的第一內(nèi)含子剪切效率與第一內(nèi)含子+1的堿基直接相關(guān)，當(dāng)Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基為G時(shí)，即為等位基因Wx，能夠正常剪接，產(chǎn)生較多大小為2.3kb的Wx基因成熟mRNA進(jìn)而翻譯成Wx蛋白，即GBSS，從而使得稻米中直鏈淀粉含量較高;而當(dāng)Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基為T時(shí)，即為等位基因Wx，無法正常剪接，產(chǎn)生保留1kb第一內(nèi)含子的大小為3.3kb的mRNA前體，Wx蛋白翻譯受阻，GBSS量少，使得稻米中直鏈淀粉含量較低。對(duì)于Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型的鑒定，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基是G時(shí)，它與前后的堿基構(gòu)成限制性內(nèi)切酶AceI的識(shí)別位點(diǎn)，使相應(yīng)的擴(kuò)增片段能被AceI酶切;而當(dāng)Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基是T時(shí)，相應(yīng)的擴(kuò)增片段不能被AceI酶切。因此可以對(duì)相應(yīng)片段進(jìn)行擴(kuò)增并采用Ace I酶切后，通過電泳條帶判斷出Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型。另外，研究發(fā)現(xiàn)Wx基因序列中第一內(nèi)含子剪切位點(diǎn)上游55bp處有（CT）n微衛(wèi)星序列即串聯(lián)重復(fù)序列，對(duì)不同品種的相關(guān)序列進(jìn)行分析，已發(fā)現(xiàn)的（CT）n包括（CT）20、（CT）19、（CT）18、（CT）17、（CT）14、（CT）13、（CT）11、（CT）10和（CT）8，（CT）n的多態(tài)性與直鏈淀粉含量直接相關(guān);一般高直鏈淀粉含量品種含有（CT）重復(fù)次數(shù)少，即n≤14的Wx等位基因，低或中等直鏈淀粉含量品種含有重復(fù)次數(shù)較多，即n≥16的Wx等位基因，同時(shí)在（CT）n下游182bp處存在同樣與直鏈淀粉含量相關(guān)的（AATT）n重復(fù)序列，含有（AATT）6等位基因的品種直鏈淀粉含量較高，而含有重復(fù)次數(shù)少的（AATT）5等位基因的品種直鏈淀粉含量較低，但是這2個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的直接功能還不太清楚。[本研究切人點(diǎn)]雖然蔡秀玲等采用PCR-AccI分子標(biāo)記檢測(cè)法檢測(cè)了63個(gè)栽培品種Wx基因第一內(nèi)含子+l位堿基類型，但目前仍有許多品種的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型有待進(jìn)一步分析，尤其是生產(chǎn)上常用親本材料。分析應(yīng)用于育種的水稻親本材料的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基，可為相關(guān)育種提供理論依據(jù)。[擬解決的關(guān)鍵問題]本研究對(duì)120份水稻親本材料的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基進(jìn)行分析，分析獲得120份親本材料的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型，測(cè)定其中部分材料的直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值，并分析與Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型的相關(guān)性，為水稻高品質(zhì)育種提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及試劑

120份親本種子，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所、農(nóng)業(yè)部華南雜交水稻種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。室內(nèi)浸種、催芽，生長一周后取整植株，用于提取基因組DNA。

rTaq DNA聚合酶和Ace I限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA的提取采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取基因組DNA，具體步驟如下：取0.1g左右的水稻植株裝進(jìn)2mL eppendorf管中，在液氮中迅速磨成粉末狀;加入800uL 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，65℃溫浴30min（隔5min左右翻動(dòng)1次，使樣品受熱均勻）;取出2mLeppendorf管，冷卻后加入800ul氯仿：異戊醇（24：1），混勻后10000r-min離心10min，取出后吸取上清至新的1.5mL eppendorf管中;加入2/3上清體積的冰異丙醇，混勻后置-20℃冰箱中靜置30mm.;10000r·min離心5min，棄去上清;加入500ul75%的乙醇洗滌2次，置超凈工作臺(tái)吹干;加入200uL TE buffer（或無菌雙蒸水），溶解DNA。上述提取的DNA保存于-20℃，備用。

1.2.2PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增所用上游引物Wx F 5’CTTTGTCTATCTCAAGACAC 3’，下游引物Wx R5’TTTCCAGCCCAACACCTTAC 3。

以上述提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品做3次重復(fù)，反應(yīng)體系為：rTaq Buffer l uL，dNTP（2.5mmol·L）0.8uL，上游引物WxF（10umol-L）0.4uL，下游引物WxR（10pmol'L）0.4uL，DNA模板1uL，rTaq 0.1uL，ddHO補(bǔ)足至10uL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min后，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。反應(yīng)完成后，取4uL PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，選其中7個(gè)樣品送測(cè)序，進(jìn)行序列分析。

1.2.3AccI酶切分析取上述PCR產(chǎn)物，進(jìn)一步進(jìn)行酶切分析，反應(yīng)體系為：10×M buffer 1uL，PCR產(chǎn)物3uL，Acc 10.5uL，ddHO補(bǔ)足至10uL，37℃酶切5h;取5uL酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4米質(zhì)分析從120份親本材料中隨機(jī)選取19份材料，種植于福建省三明市沙縣夏茂基地。收獲成熟種子，自然曬干，每個(gè)品種稱取200g，采用中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部標(biāo)準(zhǔn)米質(zhì)測(cè)定方法NY/T83-2017，對(duì)樣品的直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)品種測(cè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，樣品中均可擴(kuò)增出清晰且單一的目的條帶（圖1-A），所擴(kuò)增出的Wx基因片段大小為253bp（圖1-B），矩形框所示為Wx基因第一內(nèi)含子+1位，即堿基出現(xiàn)多態(tài)的位點(diǎn)。

2.2AccI酶切結(jié)果

采用限制性內(nèi)切酶AccI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，瓊脂糖電泳結(jié)果表明酶切后出現(xiàn)3種帶型，第一種是只有約120bp的1條帶（圖2-A第一泳道），即Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基為G時(shí)，形成限制性內(nèi)切酶Ace I識(shí)別位點(diǎn)_QTATAC（圖2-B），253bp的Wx基因片段均被切成126bp和127bp 2個(gè)片段，由于這2個(gè)片段大小只差1個(gè)堿基所以電泳顯示在同一個(gè)位置，這種類型記為G型。第二種還是253bp一條帶（圖2-A第三泳道），與圖1-A顯示的條帶相同，即Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基為T時(shí)（圖2-B），253bp的Wx基因片段無法被AccI酶切，這種類型記為T型。第三種是出現(xiàn)2條帶（圖2-A第二泳道），一條為沒有被AccI酶切動(dòng)的253bp的條帶，一條為被AccI酶切動(dòng)后呈120bp左右的一條帶，包含第一種和第二種2種帶型，即為雜合型，記為GT型。

2.3120份親本的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型分析

以本課題保存的120份水稻親本為材料，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增Wx基因片段，并用限制性內(nèi)切酶AceI進(jìn)行酶切分析，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示了120份親本的條帶類型（圖3）。根據(jù)2.2中的分類，對(duì)120份親本的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型進(jìn)行分析（表1）。結(jié)果表明，120份親本材料中，81份為T型，占總數(shù)的67.5%，其中5個(gè)品種少蘗粳、空育131、臺(tái)農(nóng)67、09NB352越光、臺(tái)灣粳稻為粳稻品種，其余為秈稻品種;38份為G型，占總數(shù)的31.67%，其中云引為粳稻，特青為秈偏粳，其余為秈稻品種;一個(gè)品種內(nèi)江P164為GT型，占總數(shù)的0.83%。另外，將其中7個(gè)品種的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并送測(cè)序;序列分析結(jié)果顯示明恢86、明恢63、多系1號(hào)和閩恢3301的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基為T，功米3號(hào)、南恢397、廣恢128的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基為G（圖4），與酶切分析結(jié)果一致。

2.4 直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值與Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型的相關(guān)分析

從120個(gè)親本中隨機(jī)選取19個(gè)親本，均為秈稻（特青為秈偏粳），其中12個(gè)親本的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型為T型，其余7個(gè)親本的為G型。對(duì)19個(gè)親本的直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型為G型7個(gè)親本的直鏈淀粉含量比堿基類型為T型親本高;除了IR661的直鏈淀粉含量平均值為16.91%，其他6個(gè)G型親本的直鏈淀粉的含量平均值均超過20%，Nerica2品種的直鏈淀粉含量最高，平均值達(dá)到26.84%;而Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型為T型的直鏈淀粉含量平均值均在20%以下，最高的為16.67%，而最低的為9.98%;對(duì)T型組和G型組親本的直鏈淀粉含量進(jìn)行方差分析，差異極顯著。膠稠度的測(cè)定結(jié)果顯示，總體上看，Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型為G型親本的膠稠度偏高一些，但T型組和G型組親本的膠稠度沒有顯著差異。另外，堿消值的測(cè)定結(jié)果顯示T型組和G型組親本之間并沒有存在明顯的規(guī)律性差別，方差分析顯示沒有顯著差異（表2）。以上結(jié)果表明，直鏈淀粉含量確實(shí)與Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型存在直接的關(guān)系，即Wx蛋白的表達(dá)量與直鏈淀粉含量密切相關(guān);而膠稠度和堿消值與其關(guān)系較小。

3討論與結(jié)論

對(duì)于稻米中直鏈淀粉含量性狀的改良，傳統(tǒng)育種方法是收取成熟的種子后測(cè)定直鏈淀粉的含量，這種做法周期長，效率不高，而且比較容易受環(huán)境條件的影響。而分子標(biāo)記輔助選擇直接對(duì)基因型進(jìn)行選擇，在苗期即可以進(jìn)行，省時(shí)省力，大大提高了育種效率。

對(duì)于Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基的鑒定，一種是PCR-AccI法;另一種是PCR一步法，即設(shè)計(jì)的引物3’末端堿基是基因第一內(nèi)含子+1位堿基且為G，當(dāng)模板DNA相應(yīng)位置是C時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖電泳圖上清晰可見，而當(dāng)相應(yīng)位置是A時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖電泳圖上條帶模糊。因此，PCR一步法是根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳條帶亮度來判斷得出Wx基因第一內(nèi)含子+l位堿基類型，這種方法雖然更快速，但是容易受PCR擴(kuò)增效率的影響，比如實(shí)驗(yàn)過程中因操作問題使得PCR擴(kuò)增效率低，這樣即使相應(yīng)位置是G電泳條帶也可能會(huì)比較淡，所以就會(huì)影響判斷結(jié)果。PCR-AccI法需要在PCR之后再進(jìn)行酶切，然后再進(jìn)行電泳，多了一個(gè)酶切步驟，但是不受PCR擴(kuò)增效率的影響，準(zhǔn)確率相對(duì)比較高。張士陸等采用直鏈淀粉含量低的親本對(duì)057進(jìn)行回交改良，利用PCR-AccI分子標(biāo)記輔助選擇Wx基因型，結(jié)合直鏈淀粉含量測(cè)定進(jìn)行驗(yàn)證，獲得了農(nóng)藝性狀與057相似且直鏈淀粉降低的穩(wěn)定株系。利用PCR-AccI進(jìn)行輔助選育，經(jīng)回交轉(zhuǎn)育將來自中等直鏈淀粉含量?jī)?yōu)質(zhì)秈稻的Wx基因?qū)胩厍嗥贩N，選育了保持有特青主要農(nóng)藝性狀且直鏈淀粉含量下調(diào)的優(yōu)質(zhì)品系;進(jìn)一步用改良品系與培矮64S雜交，所得到的雜交組合具結(jié)實(shí)率高等優(yōu)異農(nóng)藝性狀且直鏈淀粉含量明顯改善。用優(yōu)質(zhì)的秈稻品種D香1B對(duì)綜合性狀優(yōu)良但品質(zhì)欠佳的G46B進(jìn)行品質(zhì)改良，利用PCR-Acc 1分子標(biāo)記輔助選擇，獲得了直鏈淀粉含量中等的品系。另外，利用PCR-Acc I分子標(biāo)記輔助選擇，將供體材料控制直鏈淀粉的Wx導(dǎo)入到不同恢復(fù)系中，篩選獲得了直鏈淀粉含量適中的恢復(fù)系材料;并將改良株系與廣占63S和Y58S配組，得到了農(nóng)藝性狀沒有發(fā)生明顯改變且直鏈淀粉含量適中的組合。充分說明了利用PCR-Acc I分子標(biāo)記輔助選擇是改良水稻品種直鏈淀粉含量的有效方法。本研究采用PCR-AccI法對(duì)120個(gè)親本材料的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基進(jìn)行了分析，并且PCR擴(kuò)增后全部樣品先進(jìn)行電泳，以確保每個(gè)樣品均已擴(kuò)增出明顯的目的條帶，后再進(jìn)行酶切;另外，所用引物擴(kuò)增出的片段，Acc I酶切位點(diǎn)在片段的中間，被AccI酶切后瓊脂糖電泳圖上只出現(xiàn)較小的一條帶，易與沒有被切動(dòng)的條帶區(qū)分開，電泳效果好。

本研究對(duì)120個(gè)親本材料的Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基進(jìn)行了分析，并測(cè)定了其中19個(gè)親本的直鏈淀粉含量、膠稠度和堿消值，分析說明了直鏈淀粉含量與Wx基因第一內(nèi)含子+1位堿基類型直接相關(guān)，可為這些親本應(yīng)用于米質(zhì)改良育種提供必要的理論依據(jù)。