赤水烏骨雞TYR基因多態(tài)性及生物信息學(xué)分析

祖盤玉　李維　林家棟　李洪林　劉洋　牟騰慧　龍廣麗　簡華峰　張福平

摘要：【目的】找出赤水烏骨雞和泰和烏雞TYR基因外顯子的多態(tài)位點(diǎn)（SNP），為后期利用分子遺傳學(xué)技術(shù)選育烏度更深的赤水烏骨雞提供參考依據(jù)。【方法】采用DNA混池結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測序法，分析赤水烏骨雞和泰和烏雞TYR基因外顯子的SNP位點(diǎn)，并對篩選出的SNP位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析?！窘Y(jié)果】在泰和烏雞中發(fā)現(xiàn)4個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為Exon1-C829T、Exon1-C921T、Intron1-A1018G和Intron2-T79A，其中，Exon1-C829T和Exon1-C921T為同義突變;在赤水烏骨雞中發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為Intron1-G156A、Intron2-T7C、Intron4-G201A、Intron4-C221T和Exon5-A205G（非編碼區(qū)）。利用在線生物信息學(xué)分析軟件對TYR基因突變前后編碼區(qū)序列的mRNA二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)赤水烏骨雞的mRNA二級結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，而泰和烏雞Exon1-C829T和Exon1-C921T的突變均引起mRNA二級結(jié)構(gòu)改變，使得TYR基因mRNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能減小，即二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增加。赤水烏骨雞TYR蛋白二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角及擴(kuò)展鏈組成，分別占26.65%、55.31%、3.41%和14.63%?！窘Y(jié)論】Exon1-C921T突變可能會(huì)對雞的肉色產(chǎn)生影響，故推測Exon1-C921T是影響赤水烏骨雞和泰和烏雞烏度差異的原因之一。

關(guān)鍵詞： 赤水烏骨雞;泰和烏雞;TYR基因;SNP位點(diǎn);生物信息學(xué)

中圖分類號： S831.89 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）12-2806-06

Polymorphism and bioinformatics analysis of TYR gene in Chishui Black-bone Chicken

ZU Pan-yu1， LI Wei2， LIN Jia-dong1， LI Hong-lin1， LIU Yang1， MOU Teng-hui1，

LONG Guang-li1， JIAN Hua-feng1， ZHANG Fu-ping1*

（1College of Animal Sciences， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region， Ministry of Education/Guizhou Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction， Guiyang? 550025， China; 2Guizhou Management Station of Livestock Genetic Resources，

Guiyang? 550001， China）

Abstract：【Objective】To find the polymorphic loci（SNP） of exon of TYR gene from Chishui Black-bone Chicken and Taihe Silky Fowl， and lay a foundation for the later cultivation of Chishui Black-bone Chicken with deeper Wudu by molecular genetics technology. 【Method】The TYR gene exon SNPs of Chishui black-bone chicken and Taihe Silky Fowl were analyzed by DNA pooling and direct sequencing of PCR products， and bioinformatics analysis on SNP selected was conducted. 【Result】It was found that there were four SNPs in Taihe Silky Fowl， namely：Exon1-C829T， Exon1-C921T， Intron1-A1018G， Intron2-T79A， among which Exon1-C829T and Exon1-C921T were synonymous mutations. Five SNPs were found in Chishui Black-bone Chicken， they were Intron1-G156A， Intron2-T7C， Intron4-G201A， Intron4-C221T， Exon5-A205G（non-coding region）. The bioinformatics analysis software was used to analyze the mRNA secondary structure of coding region of TYR gene before and after mutation. It was found that mRNA secondary structure of Chishui Black-bone Chicken did not change， but both Taihe Silky Fowl Exon1-C829T and Exon1-C921T caused changes in the secondary structure of mRNA， which resulted in the minimum free energy of the secondary structure of TYR gene mRNA， that was， the stability of the secondary structure increases. TYR protein secondary structure of Chishui Black-bone Chicken was consisted of α-helix， random coil， β-turn and extended chain which accounted for 26.65%， 55.31%， 3.41% and 14.63%. 【Conclusion】Exon1-C921T mutation may change the color of chicken meat. Exon1-C921T may be one of the reasons that affect the difference between Chishui Black-bone Chicken and Taihe Silky Fowl.

Key words： Chishui Black-bone Chicken; Taihe Silky Fowl; TYR gene; SNPs; bioinformatics

0 引言

【研究意義】赤水烏骨雞是貴州省優(yōu)良的肉蛋兼用型地方品種，具有抗潮濕、體型較大、耐熱耐粗飼料、覓食能力強(qiáng)、生長速度快、肉質(zhì)鮮美及營養(yǎng)成分豐富等優(yōu)良特性（李思，2015），但與泰和烏雞相比，其皮膚、胸肌、腿肌、舌頭和骨膜的烏度均較淺。烏骨雞的藥用價(jià)值與其烏度（黑色素含量）密切相關(guān)（徐幸蓮等，1999;鄭從義等，1999），目前消費(fèi)者對烏骨雞品質(zhì)的判斷也都是基于其烏度。烏骨雞的烏度與真黑色素和脫黑色素的含量有關(guān)，當(dāng)真黑色素含量較高時(shí)，其皮膚呈褐色或黑色，若脫黑色素含量較高則呈黃色（Ito et al.，2000）。黑色素的合成速率及其合成量又與酪氨酸酶（TYR）密切相關(guān)（劉青等，2018），即TYR是催化酪氨酸合成真黑色素和脫黑色素的關(guān)鍵酶，TYR基因突變會(huì)引起其活性改變，進(jìn)而影響組織黑色素沉積，最終促使哺乳動(dòng)物被毛或家禽羽色及膚色白化（Tsai et al.，1999）。因此，研究TYR基因外顯子多態(tài)性對進(jìn)一步揭示烏骨雞黑色素沉積規(guī)律及選育烏度更深的烏骨雞具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來的研究表明，TYR基因不僅影響動(dòng)物的毛色，還對哺乳動(dòng)物、魚類及禽類的體色產(chǎn)生影響。在哺乳動(dòng)物上，王斌等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，白猴色素變化與TYR基因的多態(tài)雜合突變有關(guān);Kausar等（2013）發(fā)現(xiàn)綿陽TYR基因C位點(diǎn)突變導(dǎo)致TYR發(fā)生功能性缺陷，進(jìn)而影響黑色素合成。此外，TYR基因突變會(huì)導(dǎo)致眼睛、皮膚及毛發(fā)缺乏黑色素，即白化?。ˋrveiler et al.，2017）。Yoshimura等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，攜帶TYR基因G308C突變的轉(zhuǎn)基因小鼠無色素沉著，易發(fā)生白化病;孫婉（2017）在人類TYR基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的錯(cuò)義突變（W400G和Q273H），經(jīng)PolyPhen-2預(yù)測得知這2個(gè)突變可能有害，甚至可能致病;徐盈等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，眼皮白化病患者的父親TYR基因編碼區(qū)發(fā)生R116T突變，其母親出現(xiàn)移碼突變c.929insC，而患者這兩種突變均有發(fā)生。在魚類上，蔣燕玲（2016）對橘色雙冠麗魚體色進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在褪色過程中，其TYR基因表達(dá)量表現(xiàn)為黑色顯著高于灰色和黃亮色，而灰色和黃亮色的差異不顯著;周愛國（2016）發(fā)現(xiàn)烏鱧皮膚組織的TYR基因表達(dá)量極顯著高于白甲烏鱧;王良炎（2017）對黃河鯉TYR基因的研究發(fā)現(xiàn)，該基因參與黃河鯉體色形成，在黑色皮膚中含量最高，且其表達(dá)水平與黑色素細(xì)胞數(shù)量和分布存在一定相關(guān)性。在禽類上，Chang等（2006）、Sato等（2007）研究表明TYR基因外顯子和內(nèi)含子中的突變可導(dǎo)致雞全身顏色和肉色變化;李國輝等（2012）、Zhang等（2015）研究表明TYR基因不同基因型均會(huì)影響雞的肉色，且上調(diào)的TYR基因在黑雞中具有更高表達(dá)量，推測TYR基因差異表達(dá)是影響烏骨雞烏度的主要原因之一?？梢?，加強(qiáng)TYR基因多態(tài)性分析對選育烏度更深的赤水烏骨雞具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)家禽TYR基因多態(tài)性分析的研究主要集中在第1外顯子、啟動(dòng)子及組織表達(dá)量方面，而針對赤水烏骨雞的研究尚無相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用DNA混池結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測序法，分析赤水烏骨雞和泰和烏雞TYR基因外顯子的多態(tài)位點(diǎn)（SNP），并對篩選獲得的SNP位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在找出兩個(gè)烏雞品種TYR基因外顯子的差異SNP位點(diǎn)，為后期利用分子遺傳學(xué)技術(shù)選育烏度更深的赤水烏骨雞提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

赤水烏骨雞和泰和烏雞均由貴州大學(xué)科研雞場提供，為相同條件飼養(yǎng)至150日齡的健康雞，在翅下靜脈肝素鈉抗凝采集血樣。瓊脂糖、Taq PCR MasterMix溶液及Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1. 2 基因組DNA提取

采用Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，以紫外分光光度計(jì)測定總DNA的濃度和純度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上已公布的紅色原雞TYR基因序列（GenBank登錄號NC_006088），利用Primer Premier 5.0對TYR基因的5個(gè)外顯子（Exon1～Exon5）及部分內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物，引物詳細(xì)信息見表1。

1. 4 PCR擴(kuò)增及SNP位點(diǎn)鑒定

取144份赤水烏骨雞和98份泰和烏雞血樣DNA，分別構(gòu)建DNA混池并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。運(yùn)用DNASTAR中的Seq Man將DNA池測序結(jié)果與原序列（GenBank登錄號NC_006088）進(jìn)行比對分析，找出各種群的SNP位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA模板2.5 μL，上、下游引物各1.8 μL，ddH2O 6.4 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1. 5 TYR基因生物信息學(xué)分析

1. 5. 1 mRNA二級結(jié)構(gòu)及蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線軟件RNAfold web server（http：//nibiru.tbi. univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）對TYR基因突變前后編碼區(qū)序列進(jìn)行mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，并進(jìn)行比對分析;同時(shí)以NPS@：SOPMA secondary structure prediction（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？page=npsa_sopma.html）預(yù)測分析TYR蛋白二級結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL Interactive Workspace（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測TYR蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1. 5. 2 等位基因頻率估算 運(yùn)用MWSnap v3.00.74中的標(biāo)尺測量各SNP位點(diǎn)等位基因相應(yīng)的峰值，并估算等位基因頻率（Ai）。Ai=Bi/（B1+B2），式中，Ai表示SNP位點(diǎn)某等位基因頻率，B1和B2分別表示測序峰圖上該等位基因1和2峰的高度。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖1）顯示獲得的目的條帶單一清晰，片段大小與預(yù)期結(jié)果相符，說明設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物特異性較好，擴(kuò)增產(chǎn)物可用于下一步的測序分析。

2. 2 TYR基因SNP位點(diǎn)鑒定結(jié)果

利用DNASTAR對赤水烏骨雞和泰和烏雞的TYR基因測序結(jié)果與GenBank上已公布的紅色原雞TYR基因序列（GenBank登錄號NC_006088）進(jìn)行比對分析。由圖2可知，以各外顯子第1個(gè)堿基為+1，在Exon1上：泰和烏雞種群在第921位（C921T，同義突變）、第829位（C829T，屬于同義突變）和第1018位（A1018G，Intron1）發(fā)現(xiàn)有3個(gè)SNPs位點(diǎn)，而赤水烏骨雞上未發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，泰和烏雞的TYR1引物單個(gè)測序驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示;在Exon2、Exon3和Exon4上：赤水烏骨雞和泰和烏雞在其外顯子區(qū)的未發(fā)生任何變化;在Exon5上：赤水烏骨雞發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)——A205G（反向測序），但位于非編碼區(qū)（protein_id=XP_015135298.1）;在Intron1上，兩個(gè)雞品種均發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)，突變情況分別為赤G156A和泰T79A;在Intron2上，赤水烏骨雞發(fā)現(xiàn)1個(gè)SNP位點(diǎn)（赤T7C）;在Intron4上，赤水烏骨雞發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNPs位點(diǎn)（赤G201A和赤C221T）。

2. 3 等位基因頻率估算結(jié)果

由表2可知，赤水烏骨雞Intron2-T7C、Intron4-G201A和Intron4-C221T突變前后的等位基因頻率相等，Intron1-G156A突變后的等位基因頻率小于突變前的等位基因頻率;赤水烏骨雞Exon5-A205G及泰和烏雞Exon1-C829T、Exon1-C921T和Intron1-A1018G突變后的等位基因頻率大于突變前的等位基因頻率。

2. 4 TYR基因mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

利用在線軟件RNA fold web serve對TYR基因突變前后編碼區(qū)序列分別進(jìn)行mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)赤水烏骨雞和紅色原雞一致，而泰和烏雞C829T和C921T的突變均引起TYR基因mRNA二級結(jié)構(gòu)改變，具體表現(xiàn)為其最低自由能減小，而穩(wěn)定性增加。泰和烏雞TYR基因mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果見圖4。

2. 5 TYR蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果

赤水烏骨雞TYR蛋白二級結(jié)構(gòu)與紅色原雞一致，由α-螺旋、無規(guī)則卷曲、β-轉(zhuǎn)角及擴(kuò)展鏈組成，分別占26.65%、55.31%、3.41%和14.63%，其結(jié)構(gòu)圖譜如圖5所示。利用SWISS-MODEL | Workspace預(yù)測TYR蛋白三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)赤水烏骨雞TYR蛋白三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲構(gòu)成（圖6），與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

3 討論

烏骨雞黑色素具有抗氧化、抗衰老、延年益壽和抗紫外線等生物學(xué)功能（Lin and Chen，2005;Tu et al.，2009），泰和烏雞也因此開發(fā)出許多保健食品和調(diào)味品，如烏雞白鳳丸、烏雞白鳳口服液、烏雞膏、烏雞酒及烏雞精復(fù)合調(diào)味品等（邱禮平和姚玉靜，2005）。目前，關(guān)于赤水烏骨雞的保健作用仍停留在烹飪膳食方面，尚未加工生產(chǎn)出相關(guān)產(chǎn)品。赤水烏骨雞烏度略淺于泰和烏雞，但其生長速度及飼料轉(zhuǎn)化率均高于泰和烏雞，且維生素E、必需氨基酸、必需脂肪酸等含量高于大部分雞種（李思，2015）。因此，利用分子遺傳學(xué)技術(shù)選育烏度更深的赤水烏骨雞，并進(jìn)一步開發(fā)其食用及藥用價(jià)值顯得尤為重要。

本研究在兩個(gè)烏雞品種中共發(fā)現(xiàn)9個(gè)SNPs位點(diǎn)，僅泰和烏雞的Exon1-C829T和Exon1-C921T位于編碼區(qū)，且均為同義突變，其他SNPs位點(diǎn)均處于非編碼區(qū)。其中，泰和烏雞Exon1-C829T與陸曉屏等（2015）對他留烏骨雞研究的SNP4位點(diǎn)、路宏朝等（2014）對略陽烏雞研究的C849T位點(diǎn)屬于同一位點(diǎn);泰和烏雞Intron1-A1018G與他留烏骨雞SNP6位點(diǎn)（陸曉屏等，2015）是同一位點(diǎn);赤水烏骨雞Intron2-T7C與略陽烏雞G23549C位點(diǎn)（路宏朝等，2014）是同一位點(diǎn);赤水烏骨雞Intron4-G201A和Intron4-C221T與他留烏骨雞SNP18和SNP20位點(diǎn)（陸曉屏等，2015）分別屬于同一位點(diǎn)。上述SNP位點(diǎn)均是基于羽色性狀相關(guān)研究所獲得，其是否是導(dǎo)致赤水烏骨雞與泰和烏雞烏度差異的原因有待進(jìn)一步探究。

此外，泰和烏雞Exon1-C921T與SNP5位點(diǎn)（陸曉屏等，2015）和2866C/T位點(diǎn)（張建勤等，2008）是同一位點(diǎn)，且該位點(diǎn)在寧夏固原雞（肉色為淡黑色）、海南文昌雞（肉色為淡黃色）、西藏藏雞（肉色為淡黃色）中的優(yōu)勢等位基因型分別為CC型、CT型和CC型，在海賽克斯雞種（肉色為白色）只檢測到CT型和TT型，以TT型為優(yōu)勢等位基因型，且這兩個(gè)基因型和等位基因分布在不同雞品種間存在明顯差異。本研究通過對Exon1-C921T位點(diǎn)mRNA二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其最小自由能降低，而穩(wěn)定性增加;對其等位基因頻率估算發(fā)現(xiàn)T為優(yōu)勢等位基因，由此推測Exon1-C921T是影響赤水烏骨雞和泰和烏雞烏度差異的原因之一。

4 結(jié)論

Exon1-C921T突變很可能會(huì)對雞的肉色產(chǎn)生影響，故推測Exon1-C921T是影響赤水烏骨雞和泰和烏雞烏度差異的原因之一。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）