珍貴紅木樹種檀香紫檀組培快繁體系的建立

徐呈祥　馬艷萍　彭碧琳　潘建芳　廖苑蓓

摘要：【目的】探究檀香紫檀植株高效、穩(wěn)定的離體再生技術(shù)，為其苗木的規(guī)?；a(chǎn)提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳蕴聪阕咸捶N子為外植體，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度瓊脂、蔗糖、IBA、IAA和6-BA進(jìn)行無菌播種、誘導(dǎo)萌芽、增殖和生根培養(yǎng)，建立檀香紫檀組培快繁體系。【結(jié)果】檀香紫檀種子以0.1% HgCl2溶液消毒8 min的萌發(fā)率最高，為31.7%;微莖段芽萌發(fā)、生長(zhǎng)及分化效果隨培養(yǎng)基中IBA濃度提高而增強(qiáng)，當(dāng)IBA濃度為0.3 mg/L時(shí)微莖段腋芽誘導(dǎo)率最高，為94.5%，且生長(zhǎng)狀況最佳，但與添加0.2 mg/L IBA的處理無顯著差異（P>0.05）;IBA促進(jìn)微莖段愈傷組織發(fā)育和增殖的作用強(qiáng)于6-BA，二者配合使用的協(xié)同作用更明顯，以培養(yǎng)基添加0.3 mg/L IBA和3.0 mg/L 6-BA對(duì)愈傷組織發(fā)育和芽梢增殖的效果最佳，增殖系數(shù)為2.8;接種在含1.0 mg/L IBA、0.25 mg/L IAA、0.05 mg/L 6-BA的生根培養(yǎng)基，微莖段生根率最高，為65.2%，且苗木生長(zhǎng)發(fā)育最佳?！窘Y(jié)論】以種子為外植體，通過無菌播種、微莖段增殖和生根培養(yǎng)可獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)組培苗，是實(shí)現(xiàn)檀香紫檀工廠化育苗的理想途徑。

關(guān)鍵詞： 紅木樹種;檀香紫檀;無菌播種;組培繁殖

中圖分類號(hào)： S722.8? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）12-2741-08

Tissue culture and rapid propagation of red sandalwood plantlets

XU Cheng-xian， MA Yan-ping， PENG Bi-lin， PAN Jian-fang， LIAO Yuan-bei

（College of Life Sciences， Zhaoqing University， Zhaoqing，Guangdong? 526061， China）

Abstract：【Objective】Exploring the efficient and stable regeneration technology of plantlets in vitro of red sandalwood（Pterocarpus santalinus） to provide reference for the large-scale production of the seedlings. 【Method】Red sandalwood seeds were used as explants，MS medium was used as the basic medium，and different concentrations of agar，sucrose，IBA，IAA and 6-BA were added for aseptic sowing，germination，proliferation and rooting culture，a tissue culture rapid propagation system of red sandalwood was established. 【Result】The seed germination rate was the highest after disinfection in 0.1% HgCl2 solution for 8 min，and the induction rate was 31.7%; the bud germination，growth and differentiation of sterile micro-stem increased with the increase of IBA concentration of the medium. When the concentration of IBA was 0.3 mg/L，the axillary bud induction rate of micro-stem was the highest（94.5%），and the growth status was the best，however，it was not significantly different from the medium of adding 0.2 mg/L IBA（P>0.05）. The effect of 6-BA on the development and proliferation of micro-stem callus was stronger than that of 6-BA，but the synergy effect of the two was more effective，the callus growth and proliferation effect was the best when added 0.3 mg/L IBA and 3.0 mg/L 6-BA，and the proliferation coefficient was 2.8. When inoculated in rooting medium containing 1.0 mg/L IBA，0.25 mg/L IAA and 0.05 mg/L 6-BA，the rooting rate of the micro-stem segment was the highest，which was 65.2%，and the young plant growth and development was the best. 【Conclusion】With seeds as explants， large-scale tissue culture seedlings can be obtained through sterile sowing， micro-stem proliferation and rooting culture. This is an ideal way to achieve industrial culture of seedlings of red sandalwood.

Key words： rosewood species; red sandalwood; aseptic sowing; propagation by tissue culture

0 引言

【研究意義】檀香紫檀（Pterocarpus santalinus）俗稱小葉紫檀，其心材是唯一被稱為“紫檀”的木材（楊家駒，2000），不僅是最珍貴的紅木，也是國(guó)際上公認(rèn)的具有重要價(jià)值的藥材（姜笑梅等，2010）。由于檀香紫檀很早就被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》，國(guó)際上不僅對(duì)其木材交易嚴(yán)格限制，對(duì)其種子的管控也十分嚴(yán)格（翟東群等，2014;黎云昆，2016;孟倩等，2017）。檀香紫檀在我國(guó)沒有自然分布，主要為20世紀(jì)50年代通過民間途徑引入，生長(zhǎng)表現(xiàn)良好，但長(zhǎng)期未受重視（曾杰等，2000;馬艷萍等，2015），目前僅在海南島有少量栽培，種子產(chǎn)量很低，場(chǎng)圃發(fā)芽率更低，苗木非常稀缺（陳青度等，2004;馬艷萍，2013;Xu et al.，2016）。近年來的研究表明，檀香紫檀扦插成活率很低，屬扦插難生根樹種，其無性繁殖技術(shù)研究中的最大突破是嫁接育苗（徐呈祥等，2017;Huang et al.，2019），并發(fā)現(xiàn)以大果紫檀（P. macrocarpus）為砧木嫁接繁育可促進(jìn)檀香紫檀主干髓心及周圍組織及早心材化（Xu et al.，2018），但嫁接繁殖周期較長(zhǎng)，效率不高。植物組織培養(yǎng)育苗繁殖周期短、效率高，且不受季節(jié)和氣候限制，可保持親本優(yōu)良性狀，生長(zhǎng)整齊標(biāo)準(zhǔn)（王鑫和孔祥生，2014;Efferth，2019）。因此，開展檀香紫檀苗木組織培養(yǎng)研究，對(duì)促進(jìn)我國(guó)熱帶、南亞熱帶地區(qū)珍貴紅木樹種引種栽培具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】針對(duì)扦插難生根樹種的組培快繁，目前已有不少研究報(bào)道。裘珍飛等（2013）以米老排（Mytilaria laosensis）當(dāng)年生枝條莖段為外植體，建立了以芽繁芽的組織培養(yǎng)快速繁殖體系，月增殖率2.43，生根率在81.8%以上。陳怡佳等（2015）以紅葉紫薇（Lagerstroemia indica ‘PinkVelour’）優(yōu)株當(dāng)年生半木質(zhì)化枝條為外植體，采用叢芽發(fā)生途徑建立其組培快繁技術(shù)體系，腋芽誘導(dǎo)率88%，增殖系數(shù)5.21，生根率100%。韓云花等（2015）以楸樹（Catalpa bunge）一年生枝條水培萌發(fā)芽為外植體建立其優(yōu)良無性系組培快繁技術(shù)體系，初代增殖系數(shù)為4.78，繼代增殖系數(shù)為7.97，生根率96.69%。葉小玲等（2017）以大島櫻（Cerasus speciosa）優(yōu)良單株‘小喬’櫻的半木質(zhì)化嫩枝為外植體，通過基本培養(yǎng)基設(shè)置、不同激素成分及濃度水平配比優(yōu)化，建立了高效、穩(wěn)定的離體植株再生技術(shù)。田奧磊等（2017）以武夷巖茶大紅袍（Camellia sinensis ‘Dahongpao’）的無菌種胚為外植體，通過對(duì)其胚的誘導(dǎo)、繼代增殖及生根誘導(dǎo)培養(yǎng)的篩選，建立了完整的組織培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)率100%，生根率在80%以上。孫紅英等（2019）以日本紅楓‘青龍’（Acer palmatum ‘seiryu’）木質(zhì)化枝條為外植體，采用叢生芽誘導(dǎo)途徑建立其組培快繁體系，啟動(dòng)率96.1%，增殖系數(shù)4.8，生根率96.7%?？梢姡煌瑯浞N或器官的外植體材料組培快繁技術(shù)差異明顯。【本研究切入點(diǎn)】目前未見檀香紫檀苗木組培快繁的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以檀香紫檀種子為外植體，通過檀香紫檀無菌播種、無菌苗初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，建立以檀香紫檀種子為外植體的組培快繁體系，為其苗木的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

檀香紫檀翅莢果采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶植物園，貯藏于低溫種子庫(kù)（7 ℃）中，在采收后8個(gè)月內(nèi)使用修枝剪等工具從中逐粒取出種子，選擇比較飽滿、色澤光亮的種子進(jìn)行浸種、消毒和接種。瓊脂、蔗糖、IBA、IAA和6-BA等購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 外植體消毒和培養(yǎng) 精選的種子在室溫下以自來水浸泡24 h，瀝干，用5%（v/v）洗潔精溶液浸泡10 min后用自來水沖洗3次;在無菌操作臺(tái)上用75%酒精浸泡5 min，無菌水沖洗3次，以0.1% HgCl2溶液分別浸泡5、8、10、12和15 min，無菌水沖洗5次。培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，1粒/瓶，每處理接種60粒，隨機(jī)分成2組。MS培養(yǎng)基中添加6.0 g/L瓊脂、15.0 g/L 蔗糖，pH 5.8。培養(yǎng)基在121 ℃、130 kP下滅菌15 min，過夜后接種。培養(yǎng)室溫度設(shè)為（26±2）℃（下同），播種后前10 d室內(nèi)不開燈，此后設(shè)光照強(qiáng)度為1000 lx，光周期為12 h光照/12 h黑暗;40 d后轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。以MS培養(yǎng)基中添加8.0 g/L瓊脂、15.0 g/L蔗糖，種子在0.1% HgCl2溶液中浸泡8 min的處理為對(duì)照（CK1）。

1. 2. 2 誘導(dǎo)培養(yǎng) 接種40 d時(shí)將真葉以上的莖段切成帶1節(jié)（長(zhǎng)1.5～2.0 cm）的微莖段分別接種于MS+30.0 g/L蔗糖+8.0 g/L瓊脂+0.1～0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基上，以促進(jìn)微莖段腋芽萌發(fā)，以不添加IBA的處理為對(duì)照（CK2）。培養(yǎng)室光照強(qiáng)度1000 lx，光周期為14 h光照/10 h黑暗。每處理接種40瓶以上，隨機(jī)分成2組分別觀察統(tǒng)計(jì)，40 d后轉(zhuǎn)接增殖。

1. 2. 3 增殖培養(yǎng) 將誘導(dǎo)培養(yǎng)的莖段切成帶1節(jié)（長(zhǎng)1.5～2.0 cm）的莖段接種于設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基上?；九囵B(yǎng)基及蔗糖、瓊脂濃度同誘導(dǎo)培養(yǎng)基。添加的生長(zhǎng)物質(zhì)為IBA（濃度分別為0、0.1、0.2和0.3 mg/L）和6-BA（濃度分別為0、1.0、2.0和3.0 mg/L），以不添加IBA、6-BA濃度為3.0 mg/L的增殖培養(yǎng)基為對(duì)照（CK3），共設(shè)10種處理。每種培養(yǎng)基接種40瓶以上，隨機(jī)分成2組。培養(yǎng)室光照強(qiáng)度2000 lx，光周期為14 h光照/10 h黑暗。培養(yǎng)至40 d時(shí)觀察測(cè)量增殖效果，包括每個(gè)外植體增殖芽的數(shù)量、高度及愈傷組織的橫徑和縱徑。

1. 2. 4 生根培養(yǎng) 將上述增殖培養(yǎng)的繼代苗轉(zhuǎn)接至6種培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基為1/2MS，蔗糖和瓊脂濃度分別為15.0和8.0 g/L，IBA濃度為1.0 mg/L，IAA濃度分別設(shè)0、0.25和0.50 mg/L，6-BA濃度分別設(shè)0、0.05和0.25 mg/L，以不添加IAA和6-BA的處理為對(duì)照（CK4）。插入培養(yǎng)基的外植體部位無腋芽。培養(yǎng)室光照強(qiáng)度2000 lx，光周期為14 h光照/10 h黑暗。每處理接種總數(shù)不少于40瓶，培養(yǎng)40 d計(jì)算生根率，統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)度>0.5 cm根數(shù)，測(cè)量芽梢高度。

1. 2. 5 煉苗移栽 將生根培養(yǎng)40 d的125株組培苗從無菌培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到塑料溫室，在覆蓋遮陽網(wǎng)（遮光率50%）的空間中打開瓶蓋煉苗，3 d后從培養(yǎng)瓶中取出組培苗，以自來水洗凈根部所沾培養(yǎng)基，在0.2%多菌靈溶液中浸根1 min，然后移栽到由50%園土∶40%草炭∶10%珍珠巖（v∶v∶v）組成的基質(zhì)中培育，20 d后揭去遮陽網(wǎng)，60 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)成活率。

1. 3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

胚根突破種皮長(zhǎng)度達(dá)0.5 cm的種子為萌發(fā)種子。以接種后40 d時(shí)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)萌發(fā)種子占所播種子總粒數(shù)的百分?jǐn)?shù)表示種子萌發(fā)率。統(tǒng)計(jì)受污染且未萌發(fā)種子及未受污染且未萌發(fā)種子的數(shù)量，計(jì)算各自所占的百分?jǐn)?shù)。接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d，統(tǒng)計(jì)芽的萌發(fā)和生長(zhǎng)情況，計(jì)算誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)率（%）=萌發(fā)外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100。增殖培養(yǎng)至40 d時(shí)統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基對(duì)增殖和生長(zhǎng)的影響，計(jì)算增殖系數(shù)，增殖系數(shù)=增殖芽總數(shù)/接種芽總數(shù)。外植體增殖芽的高度及愈傷組織塊直徑用數(shù)顯游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量。生根培養(yǎng)40 d時(shí)觀察統(tǒng)計(jì)生根情況，生根率（%）=生根外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)×100，并統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)度>0.5 cm的根數(shù)。移栽60 d時(shí)調(diào)查統(tǒng)計(jì)移栽成活率，移栽成活率（%）=移栽成活株數(shù)/移栽生根苗總株數(shù)×100。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2013進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 0.1% HgCl2消毒時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響

由表1可知，檀香紫檀種子培養(yǎng)20 d左右可發(fā)芽，萌發(fā)率最高為31.7%;以0.1% HgCl2溶液消毒的時(shí)間由5 min延長(zhǎng)至15 min，檀香紫檀種子萌發(fā)時(shí)間持續(xù)延后，表明0.1% HgCl2溶液對(duì)種子萌發(fā)有抑制或損傷作用。其中，消毒時(shí)間≤10 min的3個(gè)處理間、消毒時(shí)間≥12 min的2個(gè)處理間的萌發(fā)時(shí)間差異不顯著（P>0.05，下同），但兩者間差異顯著（P<0.05，下同）;種子萌發(fā)率隨HgCl2消毒時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)降低，其中消毒12 min較消毒5和8 min的種子發(fā)芽率顯著降低36.9%;隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染種子的萌發(fā)率持續(xù)降低，但未污染也未萌發(fā)的種子萌發(fā)率持續(xù)升高。綜合評(píng)判得出檀香紫檀種子以0.1% HgCl2溶液消毒的最佳時(shí)間為8 min。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，既未污染也未萌發(fā)的種子普遍發(fā)育較差，種子看似飽滿實(shí)則胚敗育或發(fā)育不良。此外，其他條件相同，瓊脂濃度為6.0 g/L處理的種子萌發(fā)率顯著高于瓊脂濃度為8.0 g/L處理。圖1-A和圖1-B分別為檀香紫檀初代培養(yǎng)中萌發(fā)的種子和長(zhǎng)成的無菌苗。

2. 2 不同IBA濃度培養(yǎng)基組成對(duì)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的影響

由表2和圖1-C可知，接種在MS培養(yǎng)基上的檀香紫檀無菌微莖段萌發(fā)率在50.0%以上，有愈傷組織形成，能分化出新芽，但葉色淺，生長(zhǎng)勢(shì)弱;培養(yǎng)基中添加IBA后，對(duì)其芽誘導(dǎo)培養(yǎng)的效果顯著改善，且隨IBA濃度的增大其效果趨向更優(yōu)。較不加IBA的MS培養(yǎng)基（CK2），含0.1 mg/L IBA的MS培養(yǎng)基檀香紫檀無菌微莖段萌發(fā)率、至培養(yǎng)40 d時(shí)誘導(dǎo)分化芽梢數(shù)和分化芽梢高度依次分別顯著提高39.7%、69.2%和38.1%，且生長(zhǎng)狀況明顯得到改善;當(dāng)MS培養(yǎng)基中IBA濃度提高至0.2 mg/L，檀香紫檀無菌微莖段萌發(fā)率、至培養(yǎng)40 d時(shí)誘導(dǎo)分化芽數(shù)和分化芽高度較CK2分別顯著提高65.5%、161.5%和61.9%，生長(zhǎng)狀況進(jìn)一步得到改善;MS培養(yǎng)基中的IBA濃度提高至0.3 mg/L，3項(xiàng)指標(biāo)比CK2分別顯著提高69.05%、169.2%和66.7%，但與添加0.2 mg/L IBA無顯著差異?？梢?，MS培養(yǎng)基中添加0.2 mg/L IBA對(duì)檀香紫檀無菌微莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)比較適宜。

2. 3 培養(yǎng)基中IBA和6-BA濃度及其配比對(duì)芽增殖培養(yǎng)的影響

由圖1-D和表3可知，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后再進(jìn)行增殖培養(yǎng)，檀香紫檀微莖段的分化再生能力明顯增強(qiáng)，接種5 d后即可觀察到愈傷組織開始膨大，20 d左右多數(shù)分化出的芽可萌發(fā)，但增殖培養(yǎng)基中IBA和6-BA濃度及其配比顯著影響愈傷組織發(fā)育和芽的增殖，且2種生長(zhǎng)激素的作用效果存在協(xié)同效應(yīng)。無論對(duì)愈傷組織塊大小還是芽增殖系數(shù)和芽梢高度，IBA和6-BA對(duì)微莖段增殖的促進(jìn)作用都隨其在培養(yǎng)基中濃度的增大而增強(qiáng)，但I(xiàn)BA促進(jìn)增殖的作用明顯強(qiáng)于6-BA。

由表3還可知，檀香紫檀微莖段基部形成的愈傷組織縱徑普遍大于橫徑，且縱徑對(duì)IBA和6-BA濃度及配比的響應(yīng)更敏感。在10個(gè)處理中，以接種在MS+8.0 g/L瓊脂+30.0 g/L蔗糖+3.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基（CK3）上的愈傷組織最小，添加0.1 mg/L IBA后愈傷組織塊的縱徑、橫徑及平均值較CK3分別增加71.4%、127.3%和104.8%，增幅顯著;培養(yǎng)基的IBA濃度增至0.2 mg/L，6-BA濃度設(shè)計(jì)為0、1.0、2.0和3.0 mg/L，愈傷組織塊的平均直徑分別較CK3增大1.43、2.48、3.10和3.62倍，且5個(gè)處理間差異均達(dá)顯著水平;培養(yǎng)基的IBA濃度增至0.3 mg/L，6-BA濃度設(shè)計(jì)為0、1.0、2.0和3.0 mg/L，愈傷組織塊平均直徑分別比CK3增大2.48、3.19、3.90和5.00倍，均與CK3達(dá)顯著差異水平，但6-BA濃度為2.0和3.0 mg/L的2個(gè)處理間差異不顯著。因而，參試的10個(gè)培養(yǎng)基配方，以接種在MS+8.0 g/L瓊脂+30.0 g/L蔗糖+0.3 mg/L IBA+3.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上形成的愈傷組織最大，培養(yǎng)40 d的橫徑和縱徑分別為9.8和11.3 mm，平均為10.5 mm，但與接種在MS+8.0 g/L瓊脂+30.0 g/L蔗糖+0.3 mg/L IBA+2.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上的差異不顯著。

綜上所述，增殖培養(yǎng)基中IBA和6-BA濃度及配比對(duì)檀香紫檀無菌微莖段芽增殖系數(shù)和芽梢高度的影響與其對(duì)愈傷組織塊大小的影響規(guī)律基本一致，只是不同處理間的差異幅度相對(duì)較小，不如對(duì)愈傷組織塊大小的影響明顯，2種生長(zhǎng)激素的協(xié)同作用有所減弱，表現(xiàn)為：（1）增殖培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L IBA和3.0 mg/L 6-BA與只添加3.0 mg/L 6-BA相比，增殖系數(shù)和芽梢高度均無顯著差異;（2）增殖培養(yǎng)基中IBA濃度增至0.2 mg/L、6-BA濃度分別為0和1.0 mg/L時(shí)，均促進(jìn)無菌微莖段的芽增殖系數(shù)和芽梢高度，但2個(gè)處理間無顯著差異;（3）增殖培養(yǎng)基中IBA濃度≥0.2 mg/L、6-BA濃度≥2.0 mg/L的4種處理間增殖系數(shù)和芽梢高度均無顯著差異，培養(yǎng)40 d的增殖芽數(shù)最小為2.5、最大為2.8，芽梢高度最低為3.9 cm、最高為4.5 cm，但以絕對(duì)數(shù)值評(píng)價(jià)，仍以接種在MS+8.0 g/L瓊脂+30.0 g/L蔗糖+0.3 mg/L IBA+3.0 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上的增殖效果最佳（圖1-D），比接種在不添加IBA、6-BA濃度為3.0 mg/L的增殖培養(yǎng)基分別增加154.5%和87.5%（表3）。

2. 4 培養(yǎng)基組成對(duì)微莖段生根和生長(zhǎng)的影響

由表4可知，將檀香紫檀增殖培養(yǎng)的無菌微莖段轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d，當(dāng)基本培養(yǎng)基為1/2MS、瓊脂和蔗糖濃度分別為6.0和15.0 g/L，培養(yǎng)基中IBA、IAA、6-BA濃度及其配比對(duì)生根誘導(dǎo)效果和生根苗生長(zhǎng)發(fā)育有明顯影響（圖1-E）。（1）培養(yǎng)基中IAA濃度為0 mg/L，與不添加IBA（CK4）相比，分別添加0.05和0.25 mg/L IBA的微莖段生根率、根數(shù)和苗高隨IBA濃度增大而減小，減小幅度依次分別為3.4%、8.7%、4.7%和20.8%、47.8%、25.6%，表明生根培養(yǎng)基中IBA濃度為1.0 mg/L時(shí)添加6-BA會(huì)抑制檀香紫檀微莖段生根，6-BA濃度達(dá)0.25 mg/L時(shí)顯著抑制生根;（2）生根培養(yǎng)基中IBA濃度保持1.0 mg/L，添加0.05和0.25 mg/L 6-BA的同時(shí)添加0.25 mg/L IAA，上述6-BA對(duì)檀香紫檀微莖段生根的抑制作用得到一定程度的緩解，接種在較高濃度（0.25 mg/L）6-BA培養(yǎng)基上的微莖段生根率、根數(shù)及苗高分別增加11.8%、25.0%和9.4%，接種在較低濃度（0.05 mg/L）6-BA培養(yǎng)基上的微莖段的3項(xiàng)指標(biāo)值分別增加29.1%、38.1%和22.0%;（3）與CK4相比，微莖段生根誘導(dǎo)（即1.0 mg/L IBA+0.50 mg/L IAA處理）效果顯著提高、生根苗生長(zhǎng)發(fā)育狀況改善，生根率、根數(shù)和苗高分別增大15.7%、13.0%和4.7%，效果顯著高于上述生長(zhǎng)物質(zhì)組合1.0 mg/L IBA+0.25 mg/L IAA+0.25 mg/L 6-BA，但遜于生長(zhǎng)物質(zhì)組合1.0 mg/L IBA+0.25 mg/L IAA+0.05 mg/L 6-BA，差異不顯著。可見，培養(yǎng)基中IBA、IAA、6-BA濃度及其組合是檀香紫檀無菌微莖段生根誘導(dǎo)效果的關(guān)鍵，優(yōu)良的誘導(dǎo)效果需要3種生長(zhǎng)物質(zhì)共同作用。

2. 5 煉苗與移栽

在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d的檀香紫檀組培苗，當(dāng)其苗高為4～5 cm、長(zhǎng)度大于0.5 cm的根系每株達(dá)2～3條時(shí)，選擇發(fā)育較好的125株轉(zhuǎn)移到溫室中在遮光條件下進(jìn)行煉苗馴化，3 d后移栽到50%園土+40%草炭+10%珍珠巖組成的基質(zhì)中培育，20 d后可長(zhǎng)出新葉片，60 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)其成活96株，成活率為76.8%，1年后盆栽苗生長(zhǎng)情況如圖1-F所示。

3 討論

外植體選擇是植物組織培養(yǎng)的首要環(huán)節(jié)。樹木是木本植物，組織培養(yǎng)難度較大，外植體選擇更為重要。莖段是組織培養(yǎng)中最易獲得的原材料，也是研究者通常最先想到的外植體。在扦插難生根樹種的組培快繁中，利用半木質(zhì)化枝條或休眠枝水培后長(zhǎng)出的新梢作為外植體行之有效。但由于內(nèi)生菌的影響，并非所有樹種均適宜選用莖段作為組培快繁的外植體，有些樹種即使獲得“無菌”植株，增殖培養(yǎng)中的污染現(xiàn)象仍然比較嚴(yán)重，究其原因是難以克服植株的內(nèi)生菌（王志偉等，2015;葉小玲等，2017）。楊亞萍等（2015）在茶樹（Camellia sinensis）微莖段組培快繁中發(fā)現(xiàn)使用發(fā)根農(nóng)桿菌抑菌劑雖然有效抑制農(nóng)桿菌，但顯著降低叢生芽增殖率，且叢生芽畸形率明顯增加。本課題組前期選取檀香紫檀水培枝的莖段作為外植體，污染率非常高，為此本研究改以種子為外植體，污染率明顯降低，且對(duì)HgCl2的耐受力強(qiáng)于莖段，但實(shí)施過程中應(yīng)注意檀香紫檀翅莢果的貯藏溫度，保證所用種子質(zhì)量良好。

本研究結(jié)果表明，在檀香紫檀種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基（MS+6.0 g/L瓊脂+15.0 g/L蔗糖）中未添加激素且蔗糖濃度設(shè)計(jì)在較低水平的前提下，無菌苗生長(zhǎng)勢(shì)良好，可能與種子萌發(fā)后子葉發(fā)揮了重要功能和作用有關(guān)，與付姝穎等（2015）對(duì)猴耳環(huán)（Pithecellobium clypearia）、田奧磊等（2017）對(duì)茶樹、張建瑛等（2019）對(duì)胡桃楸（Juglans mandshurica）的研究結(jié)果相似，但在種子萌發(fā)后的無菌微莖段腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)中必須添加IBA，且其濃度不宜低于0.2 mg/L，否則外植體誘導(dǎo)分化率低，培養(yǎng)20 d后開始出現(xiàn)生長(zhǎng)明顯減緩、葉片脫落甚至干枯死亡的現(xiàn)象。檀香紫檀組培快繁中的這種現(xiàn)象在木本植物組培快繁中普遍存在，通常在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加適當(dāng)種類的生長(zhǎng)激素（6-BA）即可解決（陳怡佳等，2015;趙富群等，2017）。本課題組前期曾多次使用6-BA進(jìn)行試驗(yàn)，但誘導(dǎo)效果較裘珍飛等（2013）、田奧磊等（2017）的研究結(jié)果差，也低于改用IBA后外植體分化率最高可達(dá)94.5%且差異十分顯著，在愈傷組織誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)階段也獲得相似的促進(jìn)效果。IBA和6-BA屬于不同大類的生長(zhǎng)激素，但均具有促進(jìn)細(xì)胞分化和分裂、促進(jìn)維管束系統(tǒng)發(fā)育的功能。低濃度IBA誘導(dǎo)微莖段腋芽萌發(fā)和分化是否具有廣泛性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

組培苗能否不斷增殖是組培快繁成功的關(guān)鍵，因此生長(zhǎng)激素配比非常重要（Seran et al.，2006;束曉春等，2019）。樹木組培快繁中主要應(yīng)用細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)優(yōu)化不定芽增殖培養(yǎng)效果，所使用的兩類生長(zhǎng)激素及其組合很多，但具體效果因植物不同而異。趙富群等（2017）以毛棉杜鵑（Rhododendron moulmainense）種子為外植體，采用叢生芽發(fā)生方式建立起組培快繁體系，其最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.02 mg/L IBA +1.0 mg/L ZT，培養(yǎng)60 d，增殖系數(shù)4.50;束曉春等（2019）以南京椴（Tilia mique-liana）無菌苗帶腋芽莖段為外植體，在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L IBA的培養(yǎng)基上其繁殖系數(shù)達(dá)7.53;張赫巖等（2019）以重瓣榆葉梅（Amygdalus triloba f. Multiplex）帶腋芽的莖段為外植體，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L KT，增殖倍數(shù)為4.4。本研究中以MS+8.0 g/L瓊脂+30.0 g/L蔗糖+0.3 mg/L IBA+3.0 mg/L 6-BA為培養(yǎng)基進(jìn)行檀香紫檀無菌苗增殖培養(yǎng)的效果最優(yōu)，但培養(yǎng)40 d時(shí)增殖系數(shù)僅2.8，與裘珍飛等（2013）對(duì)米老排的研究結(jié)果相似，可進(jìn)一步優(yōu)化。

生根難是木本植物組織培養(yǎng)中最常遇到的另一難題，尤其是扦插難生根樹種。迄今，國(guó)內(nèi)外關(guān)于檀香紫檀扦插繁育的研究鮮見報(bào)道，其主要原因是枝條扦插成效不佳，難以規(guī)?；l(fā)展（Vijayalakshmi and Renganayaki，2017;陳仁利和曾杰，2018）。本研究以檀香紫檀種子為外植體開展組培快繁研究，其增殖苗微莖段轉(zhuǎn)接至最佳生根培養(yǎng)基（1/2MS+6.0 g/L瓊脂+15.0 g/L蔗糖+1.0 mg/L IBA+0.25 mg/L IAA+0.05 mg/L 6-BA）培養(yǎng)10 d左右即有新根發(fā)生，25 d左右可生長(zhǎng)出長(zhǎng)度在1.0 cm以上的側(cè)根2～3條，生根率為65.2%，雖遠(yuǎn)不如一些樹種可達(dá)100%（葉小玲等，2017），但對(duì)于紅木樹種而言已屬良好，說明組織脫分化狀況是其生根誘導(dǎo)的基礎(chǔ)，激素類型與濃度配比則是其生根誘導(dǎo)的關(guān)鍵，適宜水平IBA、IAA和6-BA的互作有利其生根誘導(dǎo)。因此，可進(jìn)一步完善其再生體系，深入探究其生根調(diào)控機(jī)理。

4 結(jié)論

檀香紫檀種子以0.1% HgCl2溶液消毒8 min的萌發(fā)率最高;IBA對(duì)微莖段腋芽萌發(fā)、生長(zhǎng)及分化的促進(jìn)作用顯著強(qiáng)于6-BA，IBA與6-BA配合使用具顯著的協(xié)同作用;以培養(yǎng)基添加0.3 mg/L IBA和3.0 mg/L 6-BA對(duì)愈傷組織發(fā)育和芽增殖的效果最佳;微莖段在含1.0 mg/L IBA、0.25 mg/L IAA、0.05 mg/L 6-BA的生根培養(yǎng)基中生根率最高、生長(zhǎng)發(fā)育最佳。因此，以種子為外植體，通過無菌播種、微莖段增殖和生根培養(yǎng)可獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)組培苗，是實(shí)現(xiàn)檀香紫檀工廠化育苗的理想途徑。

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（責(zé)任編輯 鄧慧靈）