基于兩種電泳檢測(cè)方法的華東野生菰ISSR遺傳多樣性分析

謝小燕　蘇曉娜　王惠梅　江紹琳　吳建利　江紹玫

摘要：【目的】篩選更優(yōu)的ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)方法，分析我國(guó)華東地區(qū)野生菰種質(zhì)資源遺傳多樣性，為建立和完善菰植物種質(zhì)庫(kù)及合理開(kāi)發(fā)與利用菰資源提供理論依據(jù)?！痉椒ā刻暨x7條ISSR引物對(duì)華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群104份材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其ISSR-PCR產(chǎn)物分別采用2%瓊脂糖凝膠電泳和5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。【結(jié)果】2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，華東地區(qū)野生菰的多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）為63.49%、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）為1.6349、有效等位基因數(shù)（Ne）為1.3012、Nei’s基因多樣性指數(shù)（He）為0.1871、Shannon’s信息指數(shù)（I）為0.2908、居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.3922、遺傳相似系數(shù)（Gs）變化范圍在0.8293～0.9775;其聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)遺傳相似性系數(shù)閾值為0.885時(shí)，9個(gè)野生菰居群被分為兩大類，SH（上海）和PYH（鄱陽(yáng)湖）居群歸為一類，其他7個(gè)居群歸為另一類。5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，華東地區(qū)野生菰的PPB為78.03%、Na為1.7803、Ne為1.2762、He為0.1804、I為0.2914、Gst為0.5086、Gs變化范圍在0.7679～0.9837;其聚類分析結(jié)果表明，當(dāng)遺傳相似性系數(shù)閾值為0.850時(shí)，9個(gè)居群也被分為兩大類，其中PYH居群?jiǎn)为?dú)為一類，其他8個(gè)居群歸為另一類?！窘Y(jié)論】我國(guó)華東地區(qū)野生菰種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，居群間和居群內(nèi)變異顯著，基于ISSR分子標(biāo)記的野生菰遺傳多樣性采用5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)可獲得更可靠的遺傳圖譜，而2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)更適合早期的ISSR分子標(biāo)記引物篩選。

關(guān)鍵詞： 野生菰;ISSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性;瓊脂糖凝膠電泳;聚丙烯酰胺凝膠電泳;華東地區(qū)

中圖分類號(hào)： S519;Q943? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）12-2638-09

Genetic diversity analysis of Zizania latifolia by ISSR in East China based on two electrophoresis detection methods

XIE Xiao-yan1， SU Xiao-na2， WANG Hui-mei3， JIANG Shao-lin4，

WU Jian-li3， JIANG Shao-mei5*

（1College of Art， Jiangxi University of Finance and Economics， Nanchang? 330013， China; 2Nanchang Business College of Jiangxi Agricultural University， Nanchang? 330013， China; 3China National Rice Research Institute， Hangzhou 310006， China; 4Agronomy College， Jiangxi Agricultural University， Nanchang? 330045， China;

5College of Statistics， Jiangxi University of Finance and Economics， Nanchang? 330013， China）

Abstract：【Objective】To select better electrophoretic detection methods for ISSR-PCR amplification products， analyze the genetic diversity of Zizania latifolia germplasm resources in East China， and provide theoretical basis for the establishment and improvement of Z. latifolia germplasm banks and the rational development and utilization of the resources.【Method】Seven ISSR primers were screened out to amplify 104 genomic DNA from 9 Z. latifolia populations in East China. The ISSR-PCR products were analyzed by 2% agarose gel and 5% non-denaturing polyacrylamide gel detection. 【Result】The results of agarose gel electrophoresis showed that the percentage of polymorphic loci（PPB） of Z. latifolia in East China was 63.49%， the number of observed alleles（Na） was 1.6349， and the number of effective alleles（Ne） was 1.3012， Nei’s genetic diversity index（He） was 0.1871， Shannon information index（I） was 0.2908， genetic differentiation coefficient（Gst） between populations was 0.3922， and genetic similarity coefficient（Gs） varied from 0.8293 to 0.9775. The results of cluster analysis showed that when the threshold of genetic similarity coefficient was 0.885， the nine Z. latifolia populations were classified into two categories， the SH（Shanghai） and PYH （Poyang Lake） populations were classified into one group， and the other seven populations were classified into another group. The results of 5% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis showed that the PPB of Z. latifolia in East China was 78.03%， Na was 1.7803， Ne was 1.2762， He was 0.1804， I was 0.2914， Gst was 0.5086， and Gs ranged from 0.7679 to 0.9837. The results of cluster analysis showed that when the threshold of genetic similarity coefficient was 0.850， the nine populations were also divided into two categories， among which the PYH population was classified into one category and the other eight populations were classified into another category. 【Conclusion】The Z. latifolia germplasm resources in East China are rich in genetic diversity， with significant variation between and within populations. The genetic diversity of Z. latifolia based on ISSR markers can be detected by 5% non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis to obtain a more reliable genetic map， and 2% agarose gel electrophoresis detection is more suitable for early ISSR molecular marker primer screening.

Key words： Zizania latifolia; ISSR markers; genetic diversity; agarose gel electrophoresis; polyacrylamide gel electrophoresis; East China

0 引言

【研究意義】野生菰（Zizania latifolia）作為重要的宿根性水生草本植物，隸屬于禾本科（Gramineae）稻亞科（Oryzoideae）稻族菰屬（Zizania）（陳守良和徐克學(xué)，1994）。最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，華東地區(qū)是我國(guó)野生菰種質(zhì)資源的重要分布地區(qū)之一，尤其在鄱陽(yáng)湖、洪澤湖、太湖和巢湖等湖區(qū)大量分布（蘇曉娜，2017）。菰具有較高的食用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其穎果（菰米）早在周朝就成為供奉帝王的珍貴食材（翟成凱等，2000）。野生菰還具有極高的基因資源利用價(jià)值，與水稻生長(zhǎng)習(xí)性有許多相似之處，可作為水稻遺傳育種優(yōu)良基因庫(kù)的重要源材料（沈瑋瑋等，2010），已受到育種工作者的高度重視。野生菰基因存在自交退化、異交傾向，且穎果易落粒、種子收集難等現(xiàn)象（Kennard et al.，1999），但其分子生物學(xué)理論研究及實(shí)地試驗(yàn)基因改良尚處于起步和探索階段（臧劍等，2017;王惠梅等，2018）。因此，選取瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種電泳方法對(duì)華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性進(jìn)行分析，選出最優(yōu)檢測(cè)方法，探索野生菰種群間的遺傳變異規(guī)律，對(duì)菰遺傳改良、種質(zhì)資源庫(kù)構(gòu)建及物種保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已有較多將分子標(biāo)記用于野生菰遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道。Xu等（2008）利用Adh1a基因測(cè)序?qū)ξ覈?guó)野生菰居群進(jìn)行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，各居群間存在低至中等水平的核苷酸差異，并證實(shí)我國(guó)東北地區(qū)居群Adh1a基因序列變異最豐富。Quan等（2009）開(kāi)發(fā)了菰自身SSR分子標(biāo)記并驗(yàn)證該標(biāo)記用于野生菰遺傳多樣性具有可行性。Chen等（2012）利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)長(zhǎng)江中下游野生菰SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明該流域的野生菰具有高水平的遺傳多樣性。任緒瑞（2014）、吳國(guó)林等（2014）建立了菰ISSR和SRAP反應(yīng)體系，擴(kuò)增產(chǎn)物可用1%瓊脂糖凝膠電泳和6%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。王惠梅等（2015）用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鄱陽(yáng)湖流域野生菰ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示該流域的野生菰遺傳多樣性較高，在遺傳相似性系數(shù)0.728的水平上可將其分為三大類。蘇曉娜（2017）利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)華東地區(qū)野生菰資源SSR遺傳多樣性，得出多態(tài)性條帶百分比高達(dá)89.06%，每對(duì)引物平均擴(kuò)增出8.42個(gè)多態(tài)座位。董琳（2018）利用2%瓊脂糖凝膠電泳分析梁子湖野生菰種質(zhì)資源ISSR遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該湖區(qū)的野生菰具有較高遺傳多樣性，居群內(nèi)遺傳變異大于居群間的變異。至今，瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分離和檢測(cè)的常用方法（王冬冬等，2017）。李新海等（2001）通過(guò)分析3%瓊脂糖凝膠電泳和12%聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)SSR分子標(biāo)記多態(tài)性的影響，證實(shí)瓊脂糖凝膠電泳適合用于遺傳作圖和基因定位研究，而聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于遺傳多樣性和指紋圖譜研究。侯思宇等（2011）利用ISSR分子標(biāo)記分析棗樹(shù)品種遺傳多樣性時(shí)，發(fā)現(xiàn)5%聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率和多態(tài)性均高于1%瓊脂糖凝膠電泳，且前者可獲得更精細(xì)的棗樹(shù)品種間遺傳圖譜。葉春秀等（2014）比較兩種電泳方法對(duì)新陸早系列品種SSR分子標(biāo)記結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析效果好且結(jié)果與實(shí)際遺傳背景相近，而瓊脂糖凝膠電泳更適合前期的引物篩選。劉乃新等（2016）研究不同檢測(cè)方法對(duì)甜菜ISSR引物多態(tài)性的影響，發(fā)現(xiàn)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳適用指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析，2%瓊脂糖凝膠電泳適用于種子純度鑒定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)同時(shí)使用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)野生菰ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)比較兩種凝膠電泳對(duì)華東地區(qū)野生菰ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果，篩選出更優(yōu)檢測(cè)方法，旨在真實(shí)反映華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性特征，進(jìn)一步將該標(biāo)記及優(yōu)選檢測(cè)方法用于全國(guó)野生菰遺傳多樣性分析，為建立和完善菰植物種質(zhì)庫(kù)及合理開(kāi)發(fā)與利用菰資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

9個(gè)野生菰居群104份樣本采自華東地區(qū)的湖泊、濕地和公園里，同時(shí)詳細(xì)記錄各居群的經(jīng)度、緯度、海拔及樣本數(shù)量（表1）。Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、丙烯酰胺、瓊脂糖、硝酸銀、氫氧化鈉和甲醛購(gòu)自上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。主要設(shè)備儀器：PCR擴(kuò)增儀（Tgradient Thermocycler，Biometra）、高速離心機(jī)（Centrifuge 5804，Eppendorf）、凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood II，BIO-RAD）、電泳槽電泳儀（DYY-6B、DYC-280，北京六一儀器廠）和凝膠掃描儀（Epson Perfection V10，EPSON）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA提取及ISSR擴(kuò)增 參照周麗霞等（2013）的CTAB法提取菰基因組DNA，用ddH2O稀釋至濃度為20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＿x用的7條ISSR引物（吳國(guó)林等，2014）均由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：10×Buffer 2.0 μL，2 mmol/L dNTPs 5.0 μL，2 U/μL Taq DNA聚合酶2.0 μL，20 ng/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：94.0 ℃預(yù)變性3.0 min;94.0 ℃ 45 s，46.8～56.1 ℃ 45 s，72.0 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72.0 ℃延伸7.0 min，4 ℃保存。

1. 2. 2 凝膠電泳檢測(cè) 向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μL的6×Loading Buffer混勻后，用含核酸染料GelRed的2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（100 V，1.5 h），電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RED）下觀察并拍照記錄。同時(shí)，采用5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)（140 V，3 h），采用AgNO3染色法后分離和鑒定，用凝膠圖像掃描儀拍照，并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1. 2. 3 數(shù)據(jù)處理 以DL2000 DNA Marker為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用人工讀帶方式，在相同遷移率位置譜帶清晰可辨的記為“1”，缺失的記為“0”，在Excel 2007中構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣。參照蘇曉娜等（2018）的方法，采用POPGENE 1.32計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)百分率（PPB）、觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（He）、Shannon’s信息指數(shù)（I）、居群間基因多樣性（Ht）、居群內(nèi)基因多樣性（Hs）、居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）、居群間基因流（Nm）、遺傳相似系數(shù)（Gs）和遺傳距離（Gd）;利用ARLEQUIN 3.11計(jì)算居群間和居群內(nèi)遺傳變異所占比例;采用MEGA 4.0.2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù);以MVSP 3.1進(jìn)行主成分分析;并利用NTSYS 2.10e中的UPGMA法進(jìn)行聚類分析（Rohlf，1998）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 引物多態(tài)性分析比較

7條引物對(duì)104份野生菰DNA的擴(kuò)增結(jié)果表明，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在100～2000 bp，但不同ISSR引物或同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物的不同電泳檢測(cè)結(jié)果在譜帶總數(shù)、帶型和亮度等方面存在明顯差異。2%瓊脂糖凝膠電泳共檢測(cè)到譜帶63條，其中多態(tài)性譜帶40條，PPB為63.49%;5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳共檢測(cè)出譜帶132條，其中多態(tài)性譜帶103條，PPB為78.03%（表2）。對(duì)于7條引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，兩種電泳檢測(cè)方法獲得的PPB范圍分別為33.33%～88.89%和69.23%～95.00%（表3），其中，2%瓊脂糖凝膠電泳和5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)出的最高譜帶數(shù)分別為12條（引物Z89）和26條（引物Z88）。由于5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳具有更高分辨率，因此檢測(cè)到的各引物多態(tài)性也較2%瓊脂糖凝膠電泳好。

從居群分析結(jié)果可知，兩種電泳檢測(cè)方法均顯示HZH和PYH居群多態(tài)性較高，ZHZ居群多態(tài)性最低。其中，2%瓊脂糖凝膠電泳和5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)得出HZH、PYH、ZHZ居群的PPB分別為42.86%、34.92%、6.35%和47.73%、46.97%、6.06%。從引物Z73對(duì)部分野生菰樣本的擴(kuò)增結(jié)果可明顯看出，5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)出的多態(tài)性（圖2）高于2%瓊脂糖凝膠電泳（圖1），因而更易分辨出這31份野生菰樣本的遺傳差異。

2. 2 遺傳多樣性分析比較

He不僅反映一個(gè)物種等位基因的豐富度和均勻程度，還是衡量供試材料遺傳多樣性最常用的指標(biāo)。采用POPGENE 1.32對(duì)9個(gè)野生菰居群的遺傳參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示，Na=1.6349，Ne=1.3012，He=0.1871，I=0.2908;5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（表5）顯示，Na=1.7803，Ne=1.2762，He=0.1804，I=0.2914。兩種檢測(cè)方法分析結(jié)果基本一致，說(shuō)明華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性水平較高。

2. 3 遺傳分化比較

2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（表6）顯示，華東地區(qū)野生菰居群間Ht=0.1777，居群內(nèi)Hs=0.1080，Gst=0.3922，表明39.22%的遺傳分化存在于居群間，60.78%則存在于居群內(nèi);5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（表6）顯示，華東地區(qū)野生菰居群間Ht=0.1661，居群內(nèi)Hs=0.0816，Gst=0.5086，表明50.86%的遺傳分化存在于居群間，49.14%則存在于居群內(nèi)。Nm是基因間的相互交流引起居群內(nèi)部遺傳變異量增加，減少居群間分化。2%瓊脂糖凝膠電泳和5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（表6）顯示，華東地區(qū)野生菰居群的Nm分別為0.7750和0.4832，均小于1.0000，說(shuō)明遺傳漂變成為影響居群遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素。

分子變異分析（AMOVA）可用于判斷居群間或居群內(nèi)的變異方差分布情況。華東地區(qū)野生菰樣本的AMOVA分析結(jié)果（表7）與POPGENE 1.32分析得出的相關(guān)參數(shù)基本一致，兩種電泳檢測(cè)方法所得的野生菰居群間變異比例分別為32.06%和41.23%，居群內(nèi)變異分別為67.94%和58.77%，居群間和居群內(nèi)的變異均達(dá)極顯著水平（P<0.01）。

Gs和Gd是衡量居群間遺傳分化程度的兩個(gè)最重要指標(biāo)。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（表8）顯示，華東地區(qū)野生菰各居群間Gs和Gd分別介于0.8293～0.9775和0.0227～0.1872。其中，ZHZ居群與CX居群的Gd=0.0227，Gs=0.9775，表明兩個(gè)居群間的遺傳差異最小，親緣關(guān)系最近;PYH居群與ZHZ居群的Gd=0.1872，Gs=0.8293，表明兩居群間的遺傳差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（表9）顯示，華東地區(qū)野生菰各居群間Gs和Gd分別介于0.7679～0.9837和0.0165～0.2641。其中，ZHZ居群與CHH居群的Gd=0.0165，Gs=0.9837，表明兩居群間的遺傳差異最小，親緣關(guān)系最近;PYH居群與ZZ居群的Gd=0.2641，Gs=0.7679，表明兩居群間的遺傳差異最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2. 4 聚類分析比較

NTSYS 2.10e聚類分析是通過(guò)Similarity程序中的Qualitative data對(duì)原始數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行遺傳相似性系數(shù)計(jì)算，然后通過(guò)Clustering中SNAN程序的非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，最后借助Graphic中Tree Plot程序生成聚類分析圖。由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法的不同，導(dǎo)致華東地區(qū)野生菰聚類分析結(jié)果存在一定差異。在遺傳相似性系數(shù)閾值為0.885時(shí)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果將華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群分為兩大類（圖3），其中，第I類由ZZ、HZH、TAIH、CX、ZHZ、HZ和CHH 7個(gè)居群組成，第II類由SH和PYH 2個(gè)居群組成。在遺傳相似性系數(shù)閾值為0.850時(shí)，5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果也將華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群分為兩大類（圖4），其中，第I類由ZZ、SH、CX、HZ、CHH、ZHZ、HZH和TAIH 8個(gè)居群組成;第II類僅含PYH居群。

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)是基于共同祖先原則，用于描述生物傳代譜系的常用表達(dá)方式，可直觀反映分類群（物種或基因）間的親緣關(guān)系和進(jìn)化方向（韓鳳俠，2008）。借助MEGA 4.0.2的Neighbour-joining鄰接法，可將居群間遺傳距離轉(zhuǎn)化為系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)?；?%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示，華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群可明顯聚為兩大分支（圖5），其中，A分支先后分化出SH和PYH居群，而B支先后分化出CHH、TAIH、HZH、ZZ、CX、HZ和ZHZ居群?；?%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)也顯示，華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群分為兩大分支（圖6），但各自分化出的居群與基于2%瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果不同。其中，A支先后分化出CHH、ZHZ和PYH居群，B支則先后分化出CX、HZH、TAIH、HZ、SH和ZZ居群。

2. 5 主成分分析比較

采用MVSP 3.1對(duì)二元數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析（PCA），其中，基于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果表明，前3個(gè)主成分所含信息量占總信息量的46.326%，第一主成分（PC1）～第三主成分（PC3）所占比例分別為25.825%、11.352%和9.149%，華東地區(qū)野生菰居群內(nèi)各單株樣本聚集較近，但居群間樣本又存在相互交錯(cuò)，各居群無(wú)明顯區(qū)分性（圖7）;基于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)數(shù)據(jù)的主成分分析結(jié)果顯示，前3個(gè)主成分所含信息量占總信息量的46.575%，PC1～PC3所占比例分別為22.544%、16.011%和8.019%，除居群內(nèi)各單株樣本聚集較近外，居群間又被明顯區(qū)分開(kāi)（圖8）?？梢?jiàn)，華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群的兩種電泳檢測(cè)數(shù)據(jù)主成分分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。

3 討論

聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)ISSR-PCR產(chǎn)物檢測(cè)的分辨率和靈敏度均高于瓊脂糖凝膠電泳。李凌雨等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，聚丙烯酰胺凝膠電泳較瓊脂糖凝膠電泳更能真實(shí)地反映玉米自交系間的系譜關(guān)系;宋順華和鄭曉鷹（2005）通過(guò)分析不同電泳檢測(cè)方法對(duì)甘藍(lán)和大白菜品種多態(tài)性的影響，發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)多態(tài)率是瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)多態(tài)率的2倍。本研究通過(guò)分析華東地區(qū)9個(gè)野生菰居群104份樣本的ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明，2%瓊脂糖凝膠電泳共檢測(cè)到譜帶63條，其中多態(tài)性譜帶40條，PPB為63.49%，遺傳相似性范圍在0.8293～0.9775;5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳共檢測(cè)出譜帶132條，其中多態(tài)性譜帶103條，PPB為78.03%，遺傳相似性范圍在0.7679～0.9837?？梢?jiàn)，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)優(yōu)于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，能更真實(shí)地反映華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性。通常情況下，構(gòu)建遺傳多樣性圖譜及品種分析與鑒定等建議選擇使用聚丙烯酰胺凝膠電泳;但瓊脂糖凝膠電泳因操作簡(jiǎn)便、成本低，尤其對(duì)于多態(tài)性要求不高的大量ISSR分子標(biāo)記早期篩選仍是最常用的檢測(cè)方法。

PPB和He是評(píng)價(jià)物種遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)。本研究采用的5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)得知華東地區(qū)野生菰PPB為78.03%、He為0.1804，與本課題組前期采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)基于SSR分子標(biāo)記的我國(guó)華東地區(qū)野生菰種質(zhì)資源遺傳多樣性分析結(jié)果（PPB為89.06%，He為0.2450）（蘇曉娜，2017）基本一致。結(jié)合兩種分子標(biāo)記可更全面、準(zhǔn)確地揭示種質(zhì)遺傳特性，同時(shí)說(shuō)明SSR和ISSR分子標(biāo)記均適用于我國(guó)華東地區(qū)野生菰的遺傳多樣性分析。本研究有效彌補(bǔ)了華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性分子標(biāo)記研究方法的不足，鑒于ISSR分子標(biāo)記在菰屬植物材料中表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性和穩(wěn)定性，而適合更廣范圍的野生菰品種鑒定工作。華東地區(qū)野生菰居群遺傳關(guān)系存在明顯的地理相關(guān)性，即地理距離越近的居群，其遺傳距離越小，親緣關(guān)系越近。本研究的聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.850處，可將9個(gè)野生菰居群分為兩組，第I組由棗莊、上海、慈溪、杭州、巢湖、漳州、洪澤湖和太湖8個(gè)居群組成，而鄱陽(yáng)湖為第II組，證實(shí)采用ISSR分子標(biāo)記鑒別野生菰遺傳親緣關(guān)系具有可行性。華東地區(qū)野生菰的生長(zhǎng)繁殖及其遺傳演化受制于生活環(huán)境的水文條件變化，除受動(dòng)物遷徙及風(fēng)媒傳播影響外，種子和根莖還可通過(guò)縱橫交錯(cuò)的水體交流。此外，基于5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)也顯示華東地區(qū)野生菰居群可分為兩大分支，其中，A支先后分化出巢湖、漳州和鄱陽(yáng)湖居群;B支先后分化出慈溪、洪澤湖、太湖、杭州、上海和棗莊居群。由此得出的野生菰居群親緣及進(jìn)化關(guān)系，與各野生菰居群所處的地理關(guān)系基本吻合。

華東地區(qū)野生菰遺傳多樣性的科學(xué)評(píng)價(jià)可進(jìn)一步完善菰屬植物野生種質(zhì)資源信息。同時(shí)，本研究篩選出的ISSR分子標(biāo)記及其產(chǎn)物的最優(yōu)電泳檢測(cè)方法——聚丙烯酰胺凝膠電泳，可用于全國(guó)范圍野生菰及其他野生植物種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)研究，為我國(guó)野生植物資源收集、評(píng)估和利用打下基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

我國(guó)華東地區(qū)野生菰種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，居群間和居群內(nèi)變異顯著，基于ISSR分子標(biāo)記的野生菰遺傳多樣性采用5%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)可獲得更可靠的遺傳圖譜，而2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)更適合早期的ISSR分子標(biāo)記引物篩選。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）