雙單雜交技術(shù)選育長(zhǎng)根菇高品質(zhì)抗病新菌株

于浩　葛志豪　徐麗麗　郭立忠

摘要：【目的】利用雙單雜交育種技術(shù)選育長(zhǎng)根菇新菌株，并建立雙單雜交后代的快速準(zhǔn)確鑒定方法，以獲得活性成分含量高、抗病性強(qiáng)的長(zhǎng)根菇優(yōu)質(zhì)菌株?！痉椒ā坷秒p單雜交技術(shù)進(jìn)行長(zhǎng)根菇雜交育種，通過(guò)拮抗試驗(yàn)、細(xì)胞核染色觀察和SNP位點(diǎn)分析對(duì)雙單雜交后代進(jìn)行鑒別，以液體深層發(fā)酵和比色法測(cè)定雜合菌株的小奧德蘑酮產(chǎn)量，并通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)鑒定雜合菌株的木霉抗性?！窘Y(jié)果】通過(guò)對(duì)長(zhǎng)根菇親本菌株OuE進(jìn)行單孢分離，獲得14株單核菌絲后代，編號(hào)依次為OuE01～OuE14。將獲得的單核菌絲后代與親本雙核體菌株OuC進(jìn)行雙單雜交，經(jīng)拮抗試驗(yàn)和SNP位點(diǎn)分析共篩選獲得14株雙單雜交后代。經(jīng)過(guò)與兩個(gè)親本菌株（OuC和OuE）比較發(fā)現(xiàn)，雜交后代OuCE02、OuCE08和OuCE12的菌絲平均生長(zhǎng)速度分別為16.00、16.10和15.30 mm/d，均顯著高于兩個(gè)親本菌株（P<0.05）;雜交后代OuCE03、OuCE05、OuCE08和OuCE10的菌絲發(fā)酵液小奧德蘑酮含量較親本菌株OuC分別提高6.07%、47.66%、4.67%和15.42%;雜交后代OuCE01和OuCE08顯示出較親本菌株更強(qiáng)的木霉抗性。其中，雜交后代OuCE08在菌絲生長(zhǎng)速度、小奧德蘑酮產(chǎn)量和木霉抗性方面均優(yōu)于兩個(gè)親本菌株。【結(jié)論】雙單雜交是一種快速有效獲得食用菌新菌株的遺傳育種方法，通過(guò)該方法篩選出一株高產(chǎn)小奧德蘑酮、高抗木霉的長(zhǎng)根菇新菌株OuCE08。長(zhǎng)根菇雙單雜交后代快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定可先采用拮抗試驗(yàn)作為初篩手段，再利用SNP位點(diǎn)分析進(jìn)行復(fù)篩。

關(guān)鍵詞： 長(zhǎng)根菇;雙單雜交;小奧德蘑酮;木霉抗病性;SNP位點(diǎn)分析

中圖分類號(hào)： S646.19? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）12-2621-08

Breeding of high oudenone production and Trichoderma resistant Oudemansiella raphanipes strain by dikaryon-monokaryon mating

YU Hao， GE Zhi-hao， XU Li-li， GUO Li-zhong*

（Shandong Province Key Laboratory of Applied Mycology/College of Life Science， Qingdao Agriculture University， Qingdao， Shandong? 266109， China）

Abstract：【Objective】To breed new Oudemansiella raphanipes（also known as Hymenopellis raphanipes or O. radicata） strain by dikaryon-monokaryon mating， construct fast and accurate hybrid offspring identification methods， and produce high oudenone yield and high Trichoderma resistant cultivar. 【Method】Dikaryon-monokaryon mating was used to perform genetic breeding of O. raphanipes. Hybrid offsprings were identified by antagonism test， nucleus fluorescence microscope observation and single nucleotide polymorphism（SNP） analysis. Oudenone yield of heterozygous strains were detected by submerged fermentation and colorimetry， the resistance to Trichoderma was determined using plate confrontation test. 【Result】In this study， 14 monokaryotic strains were isolated from the basidiospores of dikaryotic strain OuE，and their numbers were OuE01-OuE14. Dikaryon-monokaryon matings were performed between monokaryotic strains and dikaryotic strain OuC. Fourteen hybrid dikaryon offsprings were identified by plate antagonism test and single nucleotide polymorphisms analysis. Among them， the average growth rates of hypha of OuCE02， OuCE08 and OuCE12 were 16.00， 16.10 and 15.30 mm/d， respectively， which were significantly higher than those of the parental strains（P<0.05）. The oudenone yield of hybrid offsprings OuCE03， OuCE05， OuCE08 and OuCE10 increased 6.07%， 47.66%， 4.67% and 15.42%， respectively， compared with parental strain OuC. OuCE01 and OuCE08 showed higher Trichoderma resistance than both parental strains. The growth rate， oudenone yield and Trichoderma resistance of OuCE08 were all better than the two parental strains. 【Conclusion】The rapid and accurate methods to identify dikaryon-monokaryon mating offsprings are constructed. A new O. raphanipes strain， OuCE08， is obtained， which grows fast， produces high yield of oudenone and has high Trichoderma resistance. This study proves that dikaryon-monokaryon mating offsprings can be firstly selec-ted by antagonism test and then verified by SNP analysis. This study provides a high quality cultivar for O. raphanipes production.

Key words： Oudemansiella raphanipes; dikaryon-monokaryon mating; oudenone; Trichoderma resistance; SNP loci analysis

0 引言

【研究意義】長(zhǎng)根菇（Oudemansiella raphanipes）屬于白蘑科（Tricholomataceae）小奧德蘑屬（Oudemansiella）食用真菌，其肉質(zhì)細(xì)嫩、柄脆可口、營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種可人工栽培的中高溫出菇型食用菌（楊祝良和臧穆，1993）。長(zhǎng)根菇在夏季出菇，耐保存，可彌補(bǔ)夏季食用菌供應(yīng)短缺，因此已成為當(dāng)前食用菌市場(chǎng)最受青睞的品種（戴玉成等，2010;Hao et al.，2016;Wang et al.，2018）。長(zhǎng)根菇含有多種生物活性物質(zhì)，其中小奧德蘑酮（Oudenone）為小奧德蘑屬真菌所特有，具有顯著的降血壓功效（Koizumi et al.，1982;Acharya et al.，2019;Gao et al.，2019）。長(zhǎng)根菇菌絲生長(zhǎng)速度較慢、栽培周期較長(zhǎng)，且生長(zhǎng)過(guò)程易受雜菌污染。木霉是長(zhǎng)根菇栽培過(guò)程中的主要競(jìng)爭(zhēng)性病原微生物，因其生長(zhǎng)迅速（朱兆香和莊文穎，2014），一旦污染即造成長(zhǎng)根菇產(chǎn)量嚴(yán)重下降。因此，培育生長(zhǎng)迅速、高產(chǎn)小奧德蘑酮、抗木霉能力強(qiáng)的長(zhǎng)根菇優(yōu)質(zhì)新品種對(duì)促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】與其他大宗食用菌相比，針對(duì)長(zhǎng)根菇的研究報(bào)道相對(duì)較少，且主要集中在培養(yǎng)基優(yōu)化和高產(chǎn)栽培技術(shù)等方面。唐利華等（2010）、陳林香（2018）對(duì)長(zhǎng)根菇覆土栽培的技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行探究;方少欽等（2015）研究表明，在我國(guó)蠶區(qū)利用桑枝資源栽培食用菌，特別是夏季栽培長(zhǎng)根菇具有良好的應(yīng)用前景;鐘祝爛和益志能（2017）對(duì)長(zhǎng)根菇的工廠化栽培技術(shù)進(jìn)行研究;張磊等（2018）對(duì)長(zhǎng)根菇的菌種進(jìn)行鑒定，并優(yōu)化其培養(yǎng)基;萬(wàn)魯長(zhǎng)等（2019）總結(jié)出北方地區(qū)長(zhǎng)根菇大棚地栽周年生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)。目前，有關(guān)長(zhǎng)根菇的育種研究在國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道。雜交育種是食用菌育種的重要手段之一，分為單單雜交和雙單雜交。其中，雙單雜交技術(shù)因可迅速產(chǎn)生遺傳多樣性豐富的雜交后代而受到廣泛關(guān)注（Pilotti et al.，2002）。自1999年以來(lái)，我國(guó)開展了一系列食用菌雙單雜交育種工作，闡明了雙單雜交的基本遺傳學(xué)現(xiàn)象（葉明等，2007），并獲得一系列食用菌新菌株（譚琦等，2000;王波等，2012;孫艷穎，2013）。雜交后代鑒定是雙單雜交技術(shù)的關(guān)鍵步驟，常用的鑒定方法有酯酶同工酶技術(shù)（Eiji et al.，1994）、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析（Carvalho et al.，1995）、單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）分析（Mah et al.，2011）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）分析（王春暉等，2013）及拮抗試驗(yàn)分析等。雖然雙單雜交后代鑒定方法有很多，但不同方法間的優(yōu)劣性尚缺乏系統(tǒng)研究，進(jìn)而影響雙單雜交工作的有效開展?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】長(zhǎng)根菇是一種重要的中高溫食用菌品種，其栽培規(guī)模持續(xù)擴(kuò)大，育種研究尚存在很大空白。雙單雜交是有效的食用菌遺傳育種手段，但至今國(guó)內(nèi)外尚無(wú)利用雙單雜交技術(shù)進(jìn)行長(zhǎng)根菇遺傳育種的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用雙單雜交育種技術(shù)選育長(zhǎng)根菇新菌株，并建立雙單雜交后代的快速準(zhǔn)確鑒定方法，旨在獲得活性成分含量高、抗病性強(qiáng)的長(zhǎng)根菇優(yōu)質(zhì)新菌株。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試長(zhǎng)根菇親本菌株OuC來(lái)源于廣東市售長(zhǎng)根菇，菌株OuE來(lái)源于北京市售長(zhǎng)根菇。經(jīng)檢測(cè)，菌株OuE菌絲體在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較快，而菌株OuC菌絲體發(fā)酵液中小奧德蘑酮含量較高，且其木霉抗性強(qiáng)于菌株OuE。木霉分離自污染的長(zhǎng)根菇栽培菌包，分離后通過(guò)形態(tài)觀察和ITS分析（田慧敏等，2014）確定為木霉。葡萄糖、磷酸二氫鉀（K2HPO4）和硫酸鎂（MgSO4）購(gòu)自萊陽(yáng)市康德化工有限公司，瓊脂粉、PCR試劑、異丙醇和無(wú)水乙醇購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，E.Z.N.A.TM Fungal DNA Mini Kit柱式試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，馬鈴薯購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。主要儀器設(shè)備：電熱恒溫培養(yǎng)箱DRD-9082（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），熒光顯微鏡XSP-BM21AY（上海光學(xué)儀器廠），高速冷凍離心機(jī)GTR22-1（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）。

PDA液體培養(yǎng)基（1 L）：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，pH自然。PDA固體培養(yǎng)基（1 L）：在PDA液體培養(yǎng)基中加入20.0 g瓊脂粉。PDF固體培養(yǎng)基（1 L）：黃豆12.5 g，葡萄糖20.0 g，酵母浸膏3.0 g，瓊脂粉20.0 g，pH自然。CM固體培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖20.0 g，蛋白胨5.0 g，MgSO4 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 0.46 g，瓊脂粉20.0 g，pH自然。WA固體培養(yǎng)基（1 L）：瓊脂粉20.0 g，pH自然。YEA固體培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖20.0 g，酵母浸膏20.0 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂粉20.0 g，pH自然。PBS緩沖液（1 L）：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.42 g，KH2PO4 0.27 g，pH 7.4。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 菌絲生長(zhǎng)測(cè)定 采用打孔法取直徑0.8 cm的菌種塊接種至新的PDA固體培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光靜置培養(yǎng)5 d。測(cè)定菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度，每組設(shè)3個(gè)平行。

1. 2. 2 菌株小奧德蘑酮含量測(cè)定 將供試菌株分別接種于250 mL三角瓶中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)（PDA液體培養(yǎng)基），裝瓶量100 mL，每瓶接種10塊直徑為0.8 cm的圓柱形菌種塊，于25 ℃下160 r/min搖床恒溫振蕩培養(yǎng)25 d。發(fā)酵液經(jīng)80目篩過(guò)濾后，4 ℃下8000 r/min離心2 min，收集上清液即為待測(cè)液。采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定待測(cè)液的小奧德蘑酮含量（李浩，2012）。

1. 2. 3 擔(dān)孢子收集與單孢分離 選用菌株OuE進(jìn)行擔(dān)孢子收集和單孢分離。取長(zhǎng)至八分熟的子實(shí)體，用75%酒精擦拭子實(shí)體表面，以無(wú)菌水沖洗3～4次。無(wú)菌條件下剪掉菌柄，將剩余子實(shí)體的菌褶朝下置于已滅菌且鋪有牛皮紙的培養(yǎng)皿上，并蓋上已滅菌的燒杯，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置7個(gè)子實(shí)體。將收集到的擔(dān)孢子置于培養(yǎng)皿中，用已過(guò)濾滅菌的鏈霉素（80 μg/mL）稀釋制備成孢子懸液。利用稀釋涂布法對(duì)制備好的孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋，制備成5個(gè)梯度的孢子懸浮液。每個(gè)梯度吸取200 μL，分別涂布于PDA、PDF、CM、WA和YEA等5種固體培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行。將萌發(fā)、無(wú)污染的菌落轉(zhuǎn)移至新鮮的PDA培養(yǎng)基中，進(jìn)行下一步鑒定工作。

1. 2. 4 單核菌絲鑒定 觀察索狀聯(lián)合：利用插片法將潔凈滅菌的蓋玻片以45°角插入待鑒定菌落邊緣，待菌絲爬滿插片后，取出進(jìn)行鏡檢觀察。存在索狀聯(lián)合的為雙核菌絲，無(wú)鎖狀聯(lián)合的則需進(jìn)一步鑒定。細(xì)胞核熒光染色觀察：在待觀察的玻片上滴加幾滴DAPI染液（1 μg/mL），染色20 min后用PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，用濾紙吸干水分，滴加熒光封片液（PBS緩沖液與甘油等體積混合），2 min后用熒光顯微鏡觀察。SNP位點(diǎn)分析：利用E.Z.N.A.TM Fungal DNA Mini Kit柱式試劑盒提取菌絲樣品的基因組DNA。參照李浩（2012）的方法設(shè)計(jì)引物（JE54-F：5'-TAGTTGCGTTGCTGTCCG-3';JE54-R：5'-ATCCG CCTTTGGTTGTTC-3'），以長(zhǎng)根菇基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增JE54基因片段并進(jìn)行SNP位點(diǎn)分析，將獲得的單一條帶送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序;然后利用BioEdit 7.2.1分析測(cè)序結(jié)果，以尋找SNP位點(diǎn)。

1. 2. 5 雙單雜交 在培養(yǎng)基中間接種單核體菌株后置于25 ℃培養(yǎng)3～4 d。在距離單核菌絲2～3 cm處接種雙核菌株OuC，然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。菌絲接觸后繼續(xù)培養(yǎng)5 d，從交界處至單核菌絲體一側(cè)的菌落邊界處依次挑取5個(gè)菌塊，轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA固體培養(yǎng)基上以獲得待檢測(cè)雙單雜交后代。

1. 2. 6 雜合子菌株鑒定 初篩：對(duì)雜交后代進(jìn)行菌絲形態(tài)觀察并淘汰不具備鎖狀聯(lián)合的后代。將具有鎖狀聯(lián)合的后代與親本菌株OuC在培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，若后代與親本間有明顯的拮抗線說(shuō)明是雜合子菌株，淘汰拮抗線不明顯的雜交后代。復(fù)篩：將初篩獲得的雜交后代進(jìn)行SNP位點(diǎn)分析。

1. 2. 7 抗病突變株篩選 采用菌絲對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)雙單雜交后代進(jìn)行抗木霉菌株篩選（陳艷露等，2013）：在培養(yǎng)基一側(cè)接種雙單雜交雜合子菌株，將培養(yǎng)基置于25 ℃培養(yǎng)3～4 d后，在距離單核菌絲4～5 cm處接種病原菌木霉菌株。將接種后的培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，分別在接種木霉后第3、5和10 d觀察雜合子菌株生長(zhǎng)情況，并測(cè)量菌落大小。每組設(shè)3個(gè)平行。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 8.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理，以SPSS 18.0中的Pearson雙側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，并應(yīng)用BioEdit進(jìn)行測(cè)序結(jié)果及SNP位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單孢分離結(jié)果

采用鐘罩法收集菌株OuE的擔(dān)孢子，然后稀釋涂布于5種培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示，PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出14個(gè)單菌落，PDF培養(yǎng)基上長(zhǎng)出12個(gè)單菌落，CM培養(yǎng)基上長(zhǎng)出8個(gè)單菌落，WA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出29個(gè)單菌落，YEA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出11個(gè)單菌落。以WA培養(yǎng)基上的單菌落數(shù)量最多。

通過(guò)鎖狀聯(lián)合觀察淘汰31個(gè)單菌落，對(duì)剩余的43個(gè)單菌落和親本菌株OuE進(jìn)行SNP位點(diǎn)分析及細(xì)胞核染色觀察。結(jié)果顯示，菌株OuE的菌絲具備鎖狀聯(lián)合，且細(xì)胞中兩個(gè)細(xì)胞核通常相距較近（圖1-A），可判斷為雙核菌絲;有20個(gè)單菌落菌絲中細(xì)胞核較分散（圖1-B），初步判斷這些菌落菌絲為單核菌絲。

對(duì)親本菌株OuE和剩余單菌落進(jìn)行JE54基因片段上的SNP位點(diǎn)分析。據(jù)DNA測(cè)序圖譜顯示，親本菌株OuE在第4個(gè)堿基（A/G）和第11個(gè)堿基（A/C）兩處存在SNP位點(diǎn)（圖2-A），而在單核菌絲OuE06中以上兩處不存在SNP位點(diǎn)（圖2-B）。通過(guò)SNP位點(diǎn)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有14株菌株能擴(kuò)增出目的條帶，且不具備SNP位點(diǎn)，因此確定這14株菌株的菌絲為單核菌絲，編號(hào)依次為OuE01～OuE14。

2. 2 雙單雜交結(jié)果

利用雙單雜交共獲得35株具備鎖狀聯(lián)合的雙核體菌株，將這35株菌株與兩個(gè)親本菌株（OuC和OuE）進(jìn)行拮抗試驗(yàn)（圖3），結(jié)果淘汰16株與親本菌株拮抗反應(yīng)不明顯的菌株，而剩余19株菌株中有5株與其他菌株間的拮抗反應(yīng)不明顯，故將其去除，最終共獲得14株雙單雜交后代。

對(duì)雙核親本、單核親本和雙單雜交后代的JF54基因片段SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示獲得的14株雙單雜交后代均存在SNP位點(diǎn)的改變，因此可確定為雜交后代。以親本雙核體菌株OuC與單核菌株OuE06的雜交后代OuCE06為例，在圖4-A中第4個(gè)堿基兩個(gè)親本分別為純合的C和G，而雜交后代為C/G的套峰;在圖4-B中第4個(gè)堿基親本雙核體菌株OuC 為A/T雜合，單核菌株OuE06為T，雜交后代仍為純合的T。說(shuō)明雜交后代OuCE06的兩個(gè)細(xì)胞核分別來(lái)自于OuC和OuE06兩個(gè)親本。

2. 3 雜交后代小奧德蘑酮含量測(cè)定結(jié)果

親本菌株和雜交后代的菌絲生長(zhǎng)速度如圖5所示。親本菌株OuC和OuE的菌絲平均生長(zhǎng)速度分別為8.39和9.09 mm/d。大部分雜交后代的菌絲平均生長(zhǎng)速度顯著高于兩個(gè)親本菌株（P<0.05，下同），其中，雜交后代OuCE02、OuCE08和OuCE12的菌絲平均生長(zhǎng)速度分別為16.00、16.10和15.30 mm/d，均顯著高于兩個(gè)親本菌株。14株雙單雜交后代菌株發(fā)酵液的小奧德蘑酮含量比較如圖6所示。雜交后代OuCE03、OuCE05、OuCE08和OuCE10的菌絲發(fā)酵液小奧德蘑酮含量均高于兩個(gè)親本菌株，與親本菌株OuC相比，其菌絲發(fā)酵液小奧德蘑酮含量分別提高6.07%、47.66%、4.67%和15.42%。綜上所述，雙單雜交產(chǎn)生的菌株后代遺傳多樣性豐富，其中雜合菌株OuCE08的菌絲生長(zhǎng)最迅速，且可產(chǎn)生高濃度的小奧德蘑酮。

2. 4 抗病性菌株篩選結(jié)果

利用對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)雙單雜交后代對(duì)木霉的抗性，結(jié)果顯示，對(duì)峙培養(yǎng)10 d后部分雜交后代如OuCE08（圖7-A）與木霉的拮抗現(xiàn)象明顯，長(zhǎng)勢(shì)與木霉均衡，表現(xiàn)出較好的木霉抗性;部分雜交后代如OuCE06（圖7-B）與木霉存在一定拮抗現(xiàn)象，可阻止木霉的完全侵入，但長(zhǎng)勢(shì)弱于木霉;部分雜交后代如OuCE10（圖7-C）對(duì)木霉的抵抗能力很差，菌絲生長(zhǎng)區(qū)域完全被木霉菌絲侵入。

由表1可知，14株雜交后代中以O(shè)uCE01和OuCE08的抗木霉能力最強(qiáng)，且強(qiáng)于兩個(gè)親本菌株（OuC和OuE）; OuCE06和OuCE13的抗木霉能力與具有較強(qiáng)木霉抗性的親本菌株OuC相近;其余10株雜交后代的抗木霉能力與親本菌株OuE相近。說(shuō)明雙單雜交能產(chǎn)生具有豐富遺傳特性的后代，可作為有效的育種手段用于篩選抗病長(zhǎng)根菇菌株。

3 討論

雜交是食用菌育種最常用、最有效的方法之一，能迅速將親本優(yōu)勢(shì)性狀集中到子代，可用優(yōu)秀性狀的顯性基因掩蓋性狀不佳的隱性基因（馬三梅等，2004;桂明英等，2006;陳娟和蘇開美，2008）。雜交育種包括單孢雜交、多孢雜交和雙單雜交（陳世通等，2013;周莉，2014）。其中，雙單雜交的目的性最強(qiáng)，僅需一個(gè)單倍體菌絲，能有效節(jié)省孢子分離的時(shí)間，具有簡(jiǎn)單、迅速、高效等優(yōu)勢(shì)（Pilotti et al.，2002）。高效篩選是食用菌雜交育種的關(guān)鍵步驟。SNP分子標(biāo)記技術(shù)可對(duì)不同親本菌株進(jìn)行標(biāo)記，并通過(guò)對(duì)雜交后代相同位點(diǎn)分析實(shí)現(xiàn)對(duì)雜交后代的鑒別和親本追溯。Nieuwenhuis等（2013）通過(guò)對(duì)8個(gè)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)，成功對(duì)60株野生裂褶菌菌株的親本進(jìn)行追溯;Xiang等（2016）將SNP位點(diǎn)分析成功應(yīng)用于茯苓雜交后代鑒定，并確立一套有效的雜交后代篩選方法。本研究利用SNP分子標(biāo)記技術(shù)成功鑒定了長(zhǎng)根菇的雜交后代，進(jìn)一步證實(shí)該技術(shù)是鑒別食用真菌雜交后代的有效手段。

選擇適宜的檢測(cè)引物是開展SNP分析的關(guān)鍵步驟。李浩（2012）使用4對(duì)引物對(duì)不同來(lái)源的長(zhǎng)根菇菌株進(jìn)行SNP位點(diǎn)分析，根據(jù)SNP位點(diǎn)分布進(jìn)行遺傳多樣性分析;并通過(guò)對(duì)雙孢長(zhǎng)根菇菌株和四孢長(zhǎng)根菇菌株進(jìn)行SNP位點(diǎn)分析，確定雙孢長(zhǎng)根菇為同核體，四孢長(zhǎng)根菇為異核體。本研究對(duì)李浩（2012）篩選出的4條引物進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)JE54基因片段擴(kuò)增條帶單一，測(cè)序結(jié)果表明有多個(gè)SNP位點(diǎn)適合進(jìn)行雜交后代檢測(cè)。SNP位點(diǎn)分析雖然準(zhǔn)確性高，但存在操作步驟繁瑣、成本高、周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)（Kwan et al.，2019）。本研究先通過(guò)拮抗試驗(yàn)篩選出與兩個(gè)親本菌株均具有明顯拮抗現(xiàn)象的菌株，再利用SNP位點(diǎn)分析對(duì)篩選出的菌株作進(jìn)一步鑒定，結(jié)果顯示篩選出的14株菌株均為真正的雜交后代?？梢姡L(zhǎng)根菇雙單雜交后代快速、準(zhǔn)確檢測(cè)的方法可先采用拮抗試驗(yàn)作為初篩手段，再利用SNP位點(diǎn)分析進(jìn)行復(fù)篩。

本研究利用長(zhǎng)根菇菌株OuE雜交產(chǎn)生的14種擔(dān)孢子萌發(fā)單核菌絲與親本雙核體菌株OuC進(jìn)行雙單雜交，結(jié)果表明，雜交后代OuCE02、OuCE08和OuCE12的菌絲生長(zhǎng)速度顯著高于兩個(gè)親本菌株，雜交后代OuCE03、OuCE05、OuCE08和OuCE10的菌絲體發(fā)酵液小奧德蘑酮含量高于兩個(gè)親本菌株，雜交后代OuCE01和OuCE08的抗木霉能力強(qiáng)于兩個(gè)親本菌株。其中，雜交后代OuCE08在菌絲生長(zhǎng)速度、小奧德蘑酮含量和木霉抗性方面均優(yōu)于兩個(gè)親本菌株，表明雙單雜交后代存在豐富的遺傳多樣性，有利于篩選出優(yōu)良性狀的新菌株，但雙單雜交的遺傳機(jī)理至今尚未清楚，有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

雙單雜交是一種快速有效獲得食用菌新菌株的遺傳育種方法，通過(guò)該方法篩選出一株高產(chǎn)小奧德蘑酮、高抗木霉的長(zhǎng)根菇新菌株OuCE08。長(zhǎng)根菇雙單雜交后代快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定可先采用拮抗試驗(yàn)作為初篩手段，再利用SNP位點(diǎn)分析進(jìn)行復(fù)篩。

參考文獻(xiàn)：

陳娟，蘇開美. 2008. 食用菌遺傳育種及種質(zhì)鑒定研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食用菌，27（5）：3-8. [Chen J，Su K M. 2008. Proceeding of heredity，breeding and idioplasm identification of edible fungi[J]. Edible Fungi of China，27（5）：3-8.]

陳林香. 2018. 長(zhǎng)根菇栽培技術(shù)[J]. 福建熱作科技. 43（1）：34-35. [Chen L X. 2018. Cultivation technology of Oudemansiella radicata[J]. Fujian Science & Technology of Tropical Crops，43（1）：34-35.]

陳世通，白建波，李夢(mèng)杰，李榮春. 2013. 香菇單孢雜交及雜合子鑒定的研究[J]. 中國(guó)食用菌，32（1）：45-46. [Chen S T，Bai J B，Li M J，Li R C. 2013. Study on monospore cross and identification of heterozygotes of Shiitake[J]. Edible Fungi of China，32（1）：45-46.]

陳艷露，周莉，黃麟淇，劉斌. 2013. 抗木霉平菇菌株的篩選及其生產(chǎn)性能評(píng)價(jià)[J]. 北方園藝，（17）：145-148. [Chen Y L，Zhou L，Huang L Q，Liu B. 2013. Screening and evalua-tion of Oyster mushroom strains resistant to Trichoderma disease[J]. Northern Horticulture，（17）：145-148.]

戴玉成，周麗偉，楊祝良，文華安，圖力古爾，李泰輝. 2010. 中國(guó)食用菌名錄[J]. 菌物學(xué)報(bào)，29（1）：1-21. [Dai Y C，Zhou L W，Yang Z L，Wen H A，Bau Tolgor，Li T H. 2010. A revised checklist of edible fungi in China[J]. Mycosystema，29（1）：1-21.]

方少欽，高云超，廖森泰，肖更生，鄒宇曉，施英，劉凡，劉軍，穆利霞，沈維治. 2015. 桑枝栽培長(zhǎng)根菇的試驗(yàn)研究[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，5（5）：76-80. [Fang S Q，Gao Y C，Liao S T，Xiao G S，Zou Y X，Shi Y，Liu F，Liu J，Mu L X，Shen W Z. 2015. Cultivation experiments of the edible mushroom Oudemansiella radicata using sawdust based substrate made of mulberry branch powder[J]. Journal of Agriculture，5（5）：76-80.]

桂明英，王剛，郭永紅，劉蓓，馬紹賓. 2006. 食用菌育種技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食用菌，25（5）：3-5. [Gui M Y，Wang G，Guo Y H，Liu B，Ma S B. 2006. Research advancement of breeding technique about edible fungi[J]. Edible Fungi of China，25（5）：3-5.]

李浩. 2012. 長(zhǎng)根菇生活史研究[D]. 長(zhǎng)沙：湖南師范大學(xué). [Li H. 2012. Study the life cycle of Oudemansiella radicata[D]. Changsha：Hunan Normal University.]

馬三梅，王永飛，亦如瀚. 2004. 食用菌育種的研究進(jìn)展[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），32（4）：108-112. [Ma S M，Wang Y F，Yi R H. 2004. Review of edible fungi breeding[J]. Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry（Natural Science Edition），32（4）：108-112.]

孫艷穎. 2013. 香菇、滑子菇新品種選育研究[D]. 石家莊：河北師范大學(xué). [Sun Y Y. 2013. Studies on the breeding of new varieties of Lentinula edodes and Pholiota nameko[D]. Shijiazhuang：Hebei Normal University.]

譚琦，潘迎捷，陳明杰，賀冬梅，汪昭月，嚴(yán)培蘭，馮志勇，郭倩，劉德云，陳有興. 2000. 香菇申香10號(hào)菌種的選育與推廣[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，7（3）：6-10. [Tan Q，Pan Y J，Chen M J，He D M，Wang Z Y，Yan P L，F(xiàn)eng Z Y，Guo Q，Liu D Y，Chen Y X. 2000. Strian selection and extention of Lentinula edodes shengxiang No.10[J]. Acta Edulis Fungi，7（3）：6-10.]

唐利華，高君輝，郭倩. 2010. 長(zhǎng)根菇林地覆土栽培技術(shù)[J]. 食用菌，（5）：52-53. [Tang L H，Gao J H，Guo Q. 2010. Soil covering cultivation technique of Oudemansiella ra-dicata in forest[J]. Edible Fungi，（5）：52-53.]

田慧敏，劉鐵志，連靜，李桂林，巴特爾. 2014. 基于形態(tài)特征及ITS序列對(duì)內(nèi)蒙古紅菇的分類鑒定[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，21（4）：15-19. [Tian H M，Liu T Z，Lian J，Li G L，Ba T E. 2014. Identification and classification of four Russula species from inner Mongolia based on morphology and ITS sequencing[J]. Acta Edulis Fungi，21（4）：15-19.]

萬(wàn)魯長(zhǎng)，李曉博，趙敬聰，張甲生，李瑞琴，郭惠東，楊鵬，劉軍，韓建東. 2019. 北方地區(qū)長(zhǎng)根菇大棚地栽周年生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)[J]. 食藥用菌，27（2）：135-138. [Wan L Z， Li X B， Zhao J C， Zhang J S， Li R Q， Guo H D， Yang P， Liu J， Han J D. 2019. Annual production technique of Oudemansiella radicata in greenhouses in northern areas of China[J]. Edible and Medicinal Mushrooms， 27（2）：135-138.]

王波，祁麗萍，鮮靈. 2012. 金針菇雙單雜交的遺傳分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，25（5）：1805-1810. [Wang B，Qi L P，Xian L. 2012. Di-monad breeding and genetic analysis of Flammulina velutipes[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，25（5）：1805-1810.]

王春暉，尹永剛，胡汝曉，彭運(yùn)祥. 2013. 基于ISSR和RAPD標(biāo)記的八株灰樹花栽培菌株遺傳多樣性分析[J]. 食用菌學(xué)報(bào)，20（4）：1-5. [Wang C H，Yin Y G，Hu R X，Peng Y X. 2013. Genetic diversity of eight Grifola forndosa cultivars analyzed using ISSR and RAPD markers[J]. Acta Edulis Fungi，20（4）：1-5.]

楊祝良，臧穆. 1993. 我國(guó)西南小奧德蘑屬的分類[J]. 真菌學(xué)報(bào)，12（1）：16-27. [Yang Z L，Zang M. 1993. Classification of the genus Oudemansiella Speg. in southwest China[J]. Acta Mycologica Sinica，12（1）：16-27.]

葉明，葉崇軍，陳輝，王文敏. 2007. 香菇雙單雜交菌株富鐵及其培養(yǎng)條件研究[J]. 食品科學(xué)，28（1）：275-278. [Ye M，Ye C J，Chen H，Wang W M. 2007. Study on optimization of cultivation conditions in iron-enriched strains of di-mon mating in Lentinula edodes[J]. Food Science，28（12）：275-278.]

張磊，徐麗麗，何翠萍，郭立忠. 2018. 長(zhǎng)根菇菌種鑒定及生長(zhǎng)條件優(yōu)化[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，24（5）：14-19. [Zhang L，Xu L L，He C P，Guo L Z. 2018. Identification of Oudemansiella radicata and its growth conditions optimization[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin，24（5）：14-19.]

鐘祝爛，益志能. 2017. 長(zhǎng)根菇工廠化栽培技術(shù)[J]. 食用菌，（2）：51-53. [Zhong Z L，Yi Z N. 2017. Industrial cultivation of Oudemansiella radicata[J]. Edible Fungi，（2）：51-53.]

周莉. 2014. 平菇單孢雜交及抗病新菌株選育[D]. 南寧：廣西大學(xué). [Zhou L. 2014. Monospore cross breeding and screening of new strains resisitant to disease of Oyster mushroom[D]. Nanning：Guangxi University.]

朱兆香，莊文穎. 2014. 木霉屬研究概況[J]. 菌物學(xué)報(bào)，33（6）：1136-1153. [Zhu Z X，Zhuang W Y. 2014. Current understanding of the genus Trichoderma（Hypocreales，Ascomycota）[J]. Mycosystema，33（6）：1136-1153.]

Acharya K，Nandi S，Dutta A K. 2019. Microanatomical and physicochemical characterization and antioxidative activity of methanolic extract of Oudemansiella canarii（Jungh.） H?hn[J]. Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences，16（1）：76-81.

Carvalho D B，Smith M L，Anderson J B. 1995. Genetic exchange between diploid and haploid mycelia of Armilla-ria gallica[J].Mycological Research，99（36）：641-647.

Eiji T，Kenji Y，Yuri M，Kenjiro K. 1994. Nuclear selection and nuclear substitution in fully compatible demonm ma-tings in Pleurotus ostreatus[J]. Mycoscience， 35（3）：239-243.

Gao Z，Liu X C，Wang W S，Yang Q H，Dong Y H，Xu N，Zhang C，Song X L，Ren Z Z，Zhao F L，Z L J，Jia L. 2019. Characteristic anti-inflammatory and antioxidative effects of enzymatic-and acidic-hydrolysed mycelium polysaccharides by Oudemansiella radicata on LPS-induced lung injury[J]. Carbohydrate Polymers，204：142-151.

Hao Y J，Zhao Q，Wang S X，Yang Z. 2016. What is the radicate Oudemansiella cultivated in China[J]. Phytotaxa，286（1）：1-12.

Koizumi S，Nagatsu T，Iinuma H，Ohno M，Takeuchi T，Umezawa H. 1982. Inhibition of phenylalanine hydroxylase，a pterin-requiring monooxygenase，by oudenone and its derivatives[J]. The Journal of Antibiotics，35（4）：458-462.

Kwon O C，Lee C S，Park Y J. 2019. SNP and SCAR mar-kers for specific discrimination of antler-shaped Ganoderma lucidum[J]. Microorganisms，7（1）：12.

Mah J T L，Low E S H，Lee E. 2011. In silico SNP analysis and bioinformatics tools：A review of the state of the art to aid drug discovery[J]. Drug Discovery Today，16（17-18）：800-809.

Nieuwenhuis B P S，Nieuwhof S，Aanen D K. 2013. On the asymmetry of mating in natural populations of the mushroom fungus Schizophyllum commune[J]. Fungal Genetics and Biology，56（5）：25-32.

Pilotti C A，Sanderson F R，Aitken E A B. 2002. Sexuality and interactions of monokaryotic and dikaryotic mycelia of Ganoderma boninense[J]. Mycological Research，106（11）：1315-1322.

Wang Y F，Jia J X，Ren X X，Li B H，Zhang Q. 2018. Extraction，preliminary characterization and in vitro antioxidant activity of polysaccharides from Oudemansiella radicata mushroom[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 120（Part B）：1760-1769.

Xiang X Z，Wang X X，Bian Y B，Xu Z Y. 2016. Development of crossbreeding high-yield-potential strains for commercial cultivation in the medicinal mushroom Wolfiporia cocos（Higher Basidiomycetes）[J]. Journal of Natural Me-dicines，70（3）：645-652.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

優(yōu) 秀 青 年 學(xué) 者 論 壇

于浩（1985-），博士，副教授，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士生導(dǎo)師，畢業(yè)于上海交通大學(xué)微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。主要從事食用菌遺傳育種及食用菌生長(zhǎng)發(fā)育與抗病、抗逆分子機(jī)理研究工作。主持、參與國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目、山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目等13項(xiàng)。在國(guó)內(nèi)外期刊上發(fā)表論文40余篇，其中以第一作者或通訊作者在《Journal of Biological Chemistry》《Applied and Environmental Microbiology》《Applied Microbiology and Biotechnology》《Journal of Bacteriology》等SCI期刊上發(fā)表學(xué)術(shù)論文16篇。申報(bào)國(guó)家專利9項(xiàng)，獲國(guó)家發(fā)明專利3項(xiàng)。