高粱不同類型胚性和非胚性愈傷組織的生理生化差異

季艷麗　程云偉　陳發(fā)菊　張德春　周超

摘要：? 植物體細胞胚胎發(fā)生過程中伴隨著復雜的生理生化變化，為進一步揭示胚性愈傷組織的再生潛力，該研究以高粱Sb19未成熟胚誘導產(chǎn)生的兩種胚性愈傷組織和一種非胚性愈傷組織為材料，通過測定各愈傷組織中可溶性蛋白、游離脯氨酸和可溶性糖的含量，采用方差分析法對高粱體細胞胚胎發(fā)生過程中不同類型愈傷組織的生理生化指標進行了差異比較研究。結果表明：（1）高粱兩種胚性愈傷組織中可溶性蛋白、游離脯氨酸和可溶性糖的含量均顯著高于非胚性愈傷組織，表明胚性愈傷組織中的代謝活性高于非胚性愈傷組織，能夠為體細胞胚胎發(fā)生提供更多的物質能量基礎。（2）兩種類型胚性愈傷組織之間生理生化差異顯著，其中，Ⅱ型胚性愈傷組織中可溶性蛋白和游離脯氨酸含量均顯著高于I型胚性愈傷組織，相反，Ⅱ型胚性愈傷組織中可溶性糖含量顯著低于I型胚性愈傷組織，這種生理生化差異在一定程度上影響了后期的分化。該研究結果為愈傷組織的胚胎發(fā)生能力與生化代謝的關系提供理論依據(jù)。

關鍵詞： 高粱， 胚性愈傷組織， 非胚性愈傷組織， 可溶性蛋白， 游離脯氨酸， 可溶性糖

中圖分類號：? Q945.6文獻標識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2019）12-1613-06

作者簡介： 季艷麗（1994-），女，湖北隨州人，碩士研究生，主要從事植物遺傳育種與發(fā)育研究，（E-mail）1975891532@qq.com。

Abstract：? There are complex physiological and biochemical changes in the process of plant somatic embryogenesis. In order to reveal the regenerative potential of embryogenic callus， we determined the content of soluble protein， free proline and soluble sugar in two kinds of embryogenic calluses and a non-embryonic callus which were from the induction of Sb19 Sorghum bicolor immature embryos. The differences of physiological and biochemical parameters between different types of callus in S. bicolor somatic embryogenesis were compared by variance analysis. The results were as follows： （1） The contents of soluble protein， free proline and soluble sugar in two kinds of embryogenic callus were significantly higher than that of non-embryogenic callus， which indicates that the metabolic activity in embryogenic callus is higher than that in non-embryonic callus， and embryogenic callus can provide more material energy basis for somatic embryogenesis. （2） The physiological and biochemical differences between the two types of embryogenic callus were also significant. Among them， the contents of soluble protein and free proline in Type Ⅱ embryogenic callus were significantly higher than that of Type I embryogenic callus. In contrast， the content of soluble sugar in Type Ⅱ embryogenic callus was significantly lower than that of Type I embryogenic callus. We draw a conclusion that the differences of physiological and biochemical affect the differentiation on a certain degree. This study provides a theoretical basis for the relationship between embryogenic ability and biochemical metabolism of callus.

Key words： Sorghum bicolor， embryogenic callus， non-embryonic callus， soluble protein， free proline， soluble sugar

高粱（Sorghum bicolor）是世界上五大谷類作物之一，具有較強的耐旱性，能夠較好地適應半干旱氣候，具有比玉米更高的水利用效率（Roby et al.， 2017），在食品保障和可再生能源開發(fā)中發(fā)揮著獨特的作用（Mullet et al.， 2014; De et al.， 2017）。目前，全球糧食、能源危機日益嚴重，發(fā)展高粱生產(chǎn)，將有助于緩解這些危機。建立高效的高粱再生體系和遺傳轉化體系是高粱分子育種的基礎。但是，高粱體細胞胚胎發(fā)生當前面臨的最大問題就是胚性愈傷組織再生能力的保持，其次是基因型和褐化問題。近年來，關于高粱愈傷組織繼代培養(yǎng)后再生能力下降的研究多有報道（Liu et al.， 2015; Li et al.， 2017），但是未見對其再生率下降機理的研究。同時，在對其他禾本科植物如水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織形態(tài)逐漸由胚性向非胚性轉化，從而導致愈傷組織胚性的喪失（都曉龍等，2016）。因此，如何使體細胞轉變?yōu)榫吲咝阅芰Φ募毎潜３钟鷤M織分化能力的關鍵。

植物體細胞胚胎發(fā)生過程中伴隨著復雜的生理變化。其中，蛋白質是胚胎發(fā)育的重要代謝物組之一，在胚胎發(fā)生初期激活細胞代謝以建立胚胎發(fā)生能力（Cangahuala-Inocente et al.， 2014）。王慧純等（2017）發(fā)現(xiàn)連香樹胚性愈傷組織中可溶性蛋白含量顯著高于非胚性愈傷組織，并表明胚性愈傷組織蛋白質的積累為體胚發(fā)生提供物質基礎。脯氨酸在調節(jié)細胞形態(tài)和分化中起重要作用（Nanjo et al.， 1999）。孟姣等（2015）報道栓皮櫟胚性愈傷組織中游離脯氨酸含量均顯著高于非胚性愈傷組織，表明了脯氨酸在體細胞胚胎發(fā)生中的重要性?？扇苄蕴窃谂咛グl(fā)育早期也具有重要作用，它不僅為細胞發(fā)育提供能源物質，構成碳骨架，而且具有信號傳導的功能（趙江濤等，2006）。李華（2010）對珍珠黃楊的研究顯示，胚性愈傷組織中可溶性糖含量高于非胚性愈傷組織，并表明可溶性糖能夠為體細胞胚胎的發(fā)生提供能量和物質基礎。因此，探究高粱胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織生理生化差異對高粱體細胞胚胎發(fā)生機理的研究具有重要意義。

本研究以高粱 Sb19未成熟胚誘導產(chǎn)生的兩種胚性愈傷組織和一種非胚性愈傷組織為材料，測定不同愈傷組織中可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量，分析高粱兩種胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織生理生化特性的差異，以期為愈傷組織的胚胎發(fā)生能力與生化代謝的關系提供理論基礎。

1材料與方法

1.1 材料

參考彭祥（2018）的方法，采集Sb19花后14 d的未成熟種子，經(jīng)消毒后將未成熟胚剝離出來，將未成熟胚正面朝上放置在含1.0 mL·L-1 B5有機質、1.0 g·L-1 L-Pro、1.0 g·L-1 Asn、1.0 g·L-1 KH2PO4、1.0 g·L-1 PVP、2.5 mg·L-1 CuSO4·5H2O、2.0 mg·L-1 2，4-D、30.0 g·L-1蔗糖和8 g·L-1瓊脂，pH為5.8的MS培養(yǎng)基上，置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)30 d后， 得到三種愈傷組織（圖1）。其中，注： A. I型胚性愈傷組織; B. Ⅱ型胚性愈傷組織; C. 非胚性愈傷組織。

I型胚性愈傷組織呈黃色，色澤鮮艷，呈細胞團狀;Ⅱ型胚性愈傷組織呈白色顆?；蝰薨櫊?，質地較硬;非胚性愈傷組織呈透明、水漬狀，質地稀軟。

1.2 方法

1.2.1 可溶性蛋白含量的測定愈傷組織中可溶性蛋白的提?。悍Q取0.30 g的愈傷組織鮮樣，用5 mL蒸餾水研磨成勻漿，于25 mL容量瓶中定容，放置30 min以充分提取，離心，上清液即為樣品的蛋白提取液。采用考馬斯亮藍G-250法（王孝平和邢樹禮，2009）測定各愈傷組織提取液中可溶性蛋白的含量。

1.2.2 游離脯氨酸含量的測定愈傷組織中游離脯氨酸的提取：稱取0.3 g的愈傷組織鮮樣，加5 mL 3%的磺基水楊酸溶液，沸水浴中提取10 min，提取時要時常搖動，冷卻后過濾，濾液即為樣品的脯氨酸提取液。采用酸性茚三酮法（王學奎，2006）測定各愈傷組織提取液中游離脯氨酸的含量。

1.2.3 可溶性糖含量的測定愈傷組織中可溶性糖的提取：稱取0.3 g的愈傷組織鮮樣，用1 mL水研磨成勻漿后轉入試管中，并用5 mL蒸餾水分次洗滌，洗滌液轉入試管中，沸浴提取10 min，冷卻后過濾，將濾液定容于50 mL容量瓶中，即為樣品的可溶性糖提取液。采用蒽酮比色法（丁雪梅等，2014）測定各愈傷組織提取液中可溶性糖的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組樣品重復取樣3次，使用Excel 2010計算各指標含量，在SPSS19.0中采用單因素ANOVA法分析不同愈傷組織生理指標的差異，并采用 Duncan 法進行多重比較，使用Origin 9.0作圖。檢驗顯著性概率設置為α=0.05。

2結果與分析

2.1 可溶性蛋白含量的差異

植物的可溶性蛋白中大部分是具有特異性作用的酶類，是重要的滲透調節(jié)物質和營養(yǎng)物質，其含量是了解植物細胞總代謝的一個重要指標，其積累與胚胎發(fā)育有關（Jiménez， 2001）。高粱不同類型胚性和非胚性愈傷組織可溶性蛋白含量的差異較大（圖2），高粱兩種胚性愈傷組織的可溶性蛋白含量均顯著高于非胚性愈傷組織，且Ⅱ型胚性愈傷組織的可溶性蛋白含量顯著高于I型胚性愈傷組織。

2.2 游離脯氨酸含量的差異

游離脯氨酸是細胞質中滲透調節(jié)的重要有機溶質，即使在沒有應激情況下，對細胞形態(tài)和分化的調節(jié)也起重要的作用（Nanjo et al.， 1999）。高粱不同類型胚性和非胚性愈傷組織游離脯氨酸含量的差異較大（圖3），兩種胚性愈傷組織的游離脯氨酸含量均顯著高于非胚性愈傷組織，且Ⅱ型胚性愈傷組織的游離脯氨酸含量顯著高于I型胚性愈傷組織。

可溶性糖在植物胚胎發(fā)育的早期階段具有重要作用，是碳骨架合成和信號傳導的主要能量來源（趙江濤等， 2006）。高粱不同類型胚性和非胚性愈傷組織可溶性糖含量的差異較大（圖4），兩種胚性愈傷組織的可溶性糖含量均顯著高于非胚性愈傷組織，且I型胚性愈傷組織的可溶性糖含量顯著高于Ⅱ型胚性愈傷組織。

3討論與結論

體細胞胚胎發(fā)生的實質是基因表達調控的結果，蛋白質是基因表達的產(chǎn)物，因此在體胚發(fā)生過程中必然伴隨著蛋白質含量的變化（崔凱榮等，2001）。高粱兩種胚性愈傷組織的可溶性蛋白含量均顯著高于非胚性愈傷組織，說明高粱胚性愈傷組織代謝活動旺盛，高含量的可溶性蛋白能夠為胚性細胞的分化奠定分子基礎。趙舒野（2013）對胡桃楸體細胞胚發(fā)生過程生理生化特性的研究發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織中的可溶性蛋白和可溶性糖含量始終高于非胚性愈傷組織，并表明胚性愈傷組織代謝較旺盛，能夠從培養(yǎng)基中獲得營養(yǎng)物質并積累，從而為后期分化做準備。

胚性愈傷組織中游離脯氨酸的積累與體細胞胚胎發(fā)生有重要聯(lián)系（Fatima et al.， 2011）。高粱兩種胚性愈傷組織游離脯氨酸含量均顯著高于非胚性愈傷組織，說明愈傷組織中游離脯氨酸含量的高低可能會影響組織分化。張永華等（2007）在對番茄花藥組織培養(yǎng)的研究中也表明游離脯氨酸含量與苗分化有關。孫政等（2017）研究了楸樹胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的生理生化差異，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織中游離脯氨酸含量高于非胚性愈傷組織，并表明具有較高含量游離脯氨酸的愈傷組織其體胚發(fā)生能力也較強。

可溶性糖是植物胚胎發(fā)育過程中的主要能量來源（Pescador et al.， 2008），能夠為蛋白質的合成提供能源物質（孫政等，2017）。高粱兩種胚性愈傷組織可溶性糖含量均顯著高于非胚性愈傷組織，說明高粱胚性愈傷組織代謝速率高于非胚性愈傷組織，為后期的分化提供能源物質。鄒玉霞等（2018）在對瘤毛獐牙菜愈傷組織生理生化差異的研究中發(fā)現(xiàn)，胚性愈傷組織中的可溶性糖含量是非胚性愈傷組織的2.5倍，表明高含量的可溶性糖和可溶性蛋白能夠為后期細胞分化做準備。

高梁兩種胚性愈傷組織的生理生化指標均有差異。其中，I型胚性愈傷組織的可溶性蛋白和游離脯氨酸含量顯著低于Ⅱ型胚性愈傷組織，而可溶性糖含量顯著高于Ⅱ型胚性愈傷組織。彭祥（2018）對這兩種胚性愈傷組織的研究發(fā)現(xiàn)，I型胚性愈傷組織易分化成根，Ⅱ型胚性愈傷組織易分化成苗。我們認為兩種愈傷組織生理生化的差異一定程度上影響了后續(xù)的分化。王海波和范云六（2006）在對小麥的組織培養(yǎng)中表明，可以通過控制外源因子（如培養(yǎng)基、溫度、光照等），對培養(yǎng)物生理生化過程進行調控進而影響愈傷組織狀態(tài)。因此，我們是否可以通過跟蹤愈傷組織中生理生化的變化，對愈傷組織狀態(tài)進行調控使其能夠實現(xiàn)長期繼代而不喪失分化能力，這值得我們進一步探討。

參考文獻：

CANGAHUALA-INOCENTE GC， SILVEIRA V， CAPRESTANO CA， et al.， 2014. Dynamics of physiological and biochemical changes during somatic embryogenesis of Acca sellowiana [J]. In Vitro Cell Dev Biol-Plant， 50（2）： 166-175.

CUI KR， XING GS， ZHOU GK， et al.， 2001. The biochemical base of somatic embryogenesis [J]. Chin Bull Life Sci， 13（1）： 28-33. [崔凱榮， 邢更生， 周功克， 等， 2001. 體細胞胚發(fā)生的生化基礎 [J]. 生命科學， 13（1）： 28-33.]

DE ML， PINHEIRO SS， MARTINO HS， et al.， 2017. Sorghum （Sorghum bicolor L.）： Nutrients， bioactive compounds， and potential impact on human health [J]. Crc Crit Rev Food Sci Nutr， 57（2）： 372-390.

DING XM， ZHANG XJ， ZHAO Y， et al.， 2014. Improvement of test method for determination of soluble sugar content by anthrone colorimetry [J]. Heilongjiang Anim Sci Vet Med， 467（23）： 230-233.? [丁雪梅， 張曉君， 趙云， 等， 2014. 蒽酮比色法測定可溶性糖含量的試驗方法改進 [J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 467（23）： 230-233.]

DU XL， SUN CY， ZHANG MP， et al.， 2016. Effects of transgenerational times on rice （Jijing88） callus physio-biochemistry indexes and the cell morphology [J]. J Anhui Agric Sci， 44（5）：155-158.? [都曉龍， 孫春玉， 張美萍， 等， 2016. 繼代次數(shù)對吉粳88愈傷組織生理生化指標及細胞形態(tài)的影響 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 44（5）：155-158.]

FATIMA S， MUJIB A， SAMAJ J， 2011. Anti-oxidant enzyme responses during in vitro embryogenesis in Catharanthus roseus [J]. J Pomol Hortic Sci， 86（6）： 569-574.

JIMNEZ V， 2001. Regulation of in vitro somatic embryogenesis with emphasis on to the role of endogenous hormones [J]. Braz J Plant Physiol， 13（2）： 196-223.

LI G， WANG L， LIU Y， et al.， 2017. Construction of an efficient tissue culture system for sorghum using mature embryos [J]. Pakistan J Bot， 49（3）： 995-1000.

LI H， 2010. Study on embryogenic callus induction of Buxus sinica var. parvifolia [D]. Nanjing： Nanjing Forest Univer-sity： 36-38.? [李華， 2010. 珍珠黃楊胚性愈傷組織誘導的研究 [D]. 南京： 南京林業(yè)大學： 36-38.]

LIU G， GILDING EK， GODWIN ID， 2015. A robust tissue culture system for sorghum? [Sorghum bicolor （L.） Moench] [J]. S Afr J Bot， 98（2015）： 157-160.

MENG J， ZHANG CX， SUN L， et al.， 2015. Biochemical cha-racteristic variations of embryogenic and non-embryogenic callus of Quercus variabilis? [J]. J NW For Univ， 30（5）： 106-110.? [孟姣， 張存旭， 孫琳， 等， 2015. 栓皮櫟胚性和非胚性愈傷組織生化特性研究 [J]. 西北林學院學報， 30（5）： 106-110.]

MULLET J， MORISHIGE D， MCCORMICK R， et al.， 2014. Energy sorghum — A genetic model for the design of C4 grass bioenergy crops [J]. J Exp Bot， 65（13）： 3479-3489.

NANJO T， KOBAYASHI M， YOSHIBA Y， et al.， 1999. Biological functions of proline in morphogenesis and osmotolerance revealed in antisense transgenic Arabidopsis thaliana [J]. Plant J， 18（2）：185-193.

PENG X， 2018. Research in establishment of sorghum （Sorghum bicolor L. Moench） regeneration system and Agrobacterium-mediated genetic transformation [D]. Yichang： China Three Gorges University： 16-28.? [彭祥， 2018. 高粱再生體系建立及其農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化研究 [D]. 宜昌： 三峽大學： 16-28]

PESCADOR R， KERBAUY GB， KRAUS JE， et al.， 2008. Changes in soluble carbohydrates and starch amounts during somatic and zygotic embryogenesis of Acca sellowiana （Myrtaceae）? [J]. In Vitro Cell Dev Biol-Plant， 44（4）： 289-299.

ROBY MC， SALAS FERNANDEZ MG， HEATON EA， et al.， 2017. Biomass sorghum and maize have similar water-use-efficiency under non-drought conditions in the rain-fed Midwest U.S [J]. Agric For Meteorol， 247（2017）： 434-444.

SUN Z， CHEN FJ， GAO H， et al.， 2017. Physiological and biochemical differences of embryogenic callus and non-embryogenic callus in Catalpa bungei? [J]. Mol Plant Breed， 15（11）： 4642-4646.? [孫政， 陳發(fā)菊， 高晗， 等， 2017. 楸樹胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織的生理生化差異 [J]. 分子植物育種， 15（11）： 4642-4646.]

WANG HB， FAN YL， 2006. Researching the mechanism in plant in vitro culture via ‘communication’ experiment and to establish the methods widely used for tissue culture of wheat [J]. Acta Agron Sin， 32（7）： 964-971.? [王海波， 范云六， 2006. 用“對話”試驗探索植物組織培養(yǎng)機制并建立適用性廣的小麥組織培養(yǎng)方法 [J]. 作物學報， 32（7）： 964-971.]

WANG HC， WEI HY， LIU JZ， et al.， 2017. Physiological and biochemical differences and isoenzymes analysis of embryogenic callus and non-embryogenic callus in Cercidiphyllum japonicum? [J]. Genom Appl Biol， 37（10）： 4449-4454.? [王慧純， 韋虹宇， 劉金熾， 等， 2017. 連香樹胚性與非胚性愈傷組織生理生化差異及同工酶分析 [J]. 基因組學與應用生物學， 37（10）： 4449-4454.]

WANG XK， 2006. Principles and techniques of plant physiolo-gical and biochemical experiments [M]. Beijing： Higher Education Press： 167-169.? [王學奎， 2006. 植物生理生化實驗原理和技術 [M]. 北京： 高等教育出版社： 167-169.]

WANG XP， XING SL， 2009. Determination of protein quantitation using the method of coomassie brilliant blue? [J]. Tianjin Chem Ind， 23（3）： 40-42.? [王孝平， 邢樹禮， 2009. 考馬斯亮藍法測定蛋白含量的研究 [J]. 天津化工， 23（3）： 40-42.]

ZHANG YH， XIN JH， YUAN YW， 2007. Study on the change of proline content in tomato anther callus induction [J]. N Hortic， （6）： 15-16. [張永華， 辛建華， 苑育文， 2007. 番茄花藥愈傷組織誘導中脯氨酸含量變化的研究 [J]. 北方園藝， （6）： 15-16.]

ZHAO JT， LI XF， LI H， et al.， 2006. Research on the role of the soluble sugar in the regulation of physiological metabolism in higher plant [J]. J Anhui Agric Sci， 34（24）： 6423-6425.? [趙江濤， 李曉峰， 李航， 等， 2006. 可溶性糖在高等植物代謝調節(jié)中的生理作用 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 34（24）： 6423-6425.]

ZHAO SY， 2013. The physiological and biochemical characteristics of somatic embryogenesis in Juglans mandshurica [D]. Harbin： Northeast Forest University： 7-15.? [趙舒野， 2013. 胡桃楸體胚發(fā)生過程中生理生化特性的研究 [D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學： 7-15.]

ZOU YX， MA YT， MAO SN， et al.， 2017. Induction and phy-siological-biochemical characteristic study of callus of Swertia pseudochinensis Hara [J]. Pharm Clin Chin Mat Med， 49（3）： 14-17.? [鄒玉霞， 馬云桐， 毛勝楠， 等， 2018. 瘤毛獐牙菜愈傷組織誘導及生理生化特性研究 [J]. 中藥與臨床， 49（3）： 14-17.]