北京主栽西瓜品種標(biāo)準(zhǔn)樣品SSR標(biāo)記指紋構(gòu)建與應(yīng)用

吳明生 趙海艷 彭瑞迪 律寶春

摘? ?要：基于毛細(xì)管電泳技術(shù)，利用24對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記引物構(gòu)建了13個(gè)北京地區(qū)主栽西瓜品種標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA指紋，并通過(guò)北京市農(nóng)作物品種標(biāo)準(zhǔn)樣品信息管理系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)指紋信息的共享和應(yīng)用，為這些西瓜品種的鑒定和品種權(quán)保護(hù)提供了技術(shù)支撐，并為規(guī)范北京西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展保駕護(hù)航。

關(guān)鍵詞：西瓜;主栽品種;標(biāo)準(zhǔn)樣品;SSR標(biāo)記;指紋構(gòu)建;應(yīng)用

西瓜作為北京市優(yōu)勢(shì)經(jīng)濟(jì)作物，在京郊農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。但是近年來(lái)，西瓜品種“多、亂、雜”現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，優(yōu)良品種套牌侵權(quán)行為時(shí)有發(fā)生，不僅擾亂了種業(yè)市場(chǎng)，危及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，也打擊了育種者的積極性，并影響著種子產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

供試的13個(gè)西瓜品種均為北京地區(qū)主要栽培品種，包括京秀、航興1號(hào)、航興3號(hào)、北農(nóng)天驕2號(hào)、暑寶6號(hào)、京欣1號(hào)、京欣2號(hào)、京欣3號(hào)、京欣無(wú)籽1號(hào)、紅小帥、黃小玉、黑美人和黑晶，所有品種的標(biāo)準(zhǔn)樣品種子由北京市農(nóng)作物品種標(biāo)準(zhǔn)樣品庫(kù)提供。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ?DNA提取

每份試驗(yàn)材料取50粒種子混合研磨，之后從其中取100 mg粉末置于1.5 mL離心管中，采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取西瓜基因組DNA。

1.2.2? ?SSR引物設(shè)計(jì)

24對(duì)西瓜多態(tài)性SSR標(biāo)記引物參照吳明生等[1]，所有引物采用熒光標(biāo)記，由美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司合成，引物信息見(jiàn)表1。

1.2.3? ?PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為：1×Taq Buffer，MgCl2 2.5 mol/L，dNTPs 0.15 mol/L每種，引物0.25 μmol/L每種，Taq 聚合酶0.1 U，DNA模板50 ng，總體積20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、58 ℃退火35 s、72 ℃延伸45 s，共36個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.4? ?電泳與數(shù)據(jù)分析

通過(guò)毛細(xì)管電泳儀（ABI 3500XL）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，分子量?jī)?nèi)標(biāo)為L(zhǎng)iz600，利用ABI GeneMapper 5.0軟件對(duì)采集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行片段分析。

1.2.5? ?遺傳聚類分析

SSR擴(kuò)增分離結(jié)果采用0、1統(tǒng)計(jì)方法，在同一分子量上，“有帶”記為1，“無(wú)帶”記為0。通過(guò)NTSYS-pc

Version 2.0軟件，按照非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法（UPGMA）完成遺傳聚類。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?引物分組及多重電泳

為了提高指紋數(shù)據(jù)采集的效率，采用8重毛細(xì)管電泳技術(shù)，即將24對(duì)引物分成3組，8對(duì)引物為一組（即引物Panel），采用四色熒光（FAM、VIC、PET、NED）對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)記，確保同一組中的相同熒光標(biāo)記的引物之間擴(kuò)增片段大小區(qū)間不重疊（表1），這樣就可以將每組引物擴(kuò)增的產(chǎn)物混合在一起電泳。同時(shí)通過(guò)Gene Mapper軟件對(duì)每對(duì)引物的等位基因進(jìn)行命名，設(shè)置每個(gè)等位基因讀值區(qū)間（即Bin，結(jié)果未顯示），利用Gene Mapper軟件對(duì)采集的原始指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行快速分析，自動(dòng)確定每個(gè)位點(diǎn)的基因型。

2.2? ?標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋采集

標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋采集通過(guò)雙人比對(duì)的方式，即兩人分別取50粒種子，樣品粉碎、DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳及指紋信息讀取都單獨(dú)進(jìn)行。當(dāng)兩人采集的指紋信息比對(duì)完全一致的，則直接記錄為該品種的指紋信息;對(duì)于不一致的指紋信息，需要查找原因，進(jìn)行再次測(cè)試確認(rèn)，直到結(jié)果一致。13個(gè)西瓜品種最終采集指紋數(shù)據(jù)信息是312個(gè)（圖1），采集成功率100%，其中一次測(cè)試就確認(rèn)的信息282個(gè)，占比90.4%;再次測(cè)試確認(rèn)的30個(gè)，占比9.6%，主要集中在P4號(hào)引物和P23號(hào)引物，共計(jì)18個(gè)，占再次確認(rèn)的60%。

2.3? ?品種近似性分析

根據(jù)“0、1”規(guī)則，利用采集的指紋信息，通過(guò)NTSYS-pc Version 2.0軟件對(duì)13個(gè)品種進(jìn)行遺傳聚類和近似性分析（圖2），結(jié)果顯示京欣2號(hào)和京欣無(wú)籽1號(hào)最為近似，近似系數(shù)達(dá)到0.97，差異2個(gè)位點(diǎn)，其余品種間差異位點(diǎn)都在6個(gè)以上，說(shuō)明北京主栽西瓜品種間的遺傳背景較為廣泛，具有較好的多樣性。

2.4? ?指紋信息共享應(yīng)用

為了推進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋信息的共享應(yīng)用，將所有品種的指紋數(shù)據(jù)及峰型圖錄入北京市農(nóng)作物品種標(biāo)準(zhǔn)樣品信息管理系統(tǒng)（軟件證書登記號(hào)：3442753），用戶可以利用系統(tǒng)查詢相關(guān)品種的指紋信息，并可以將自己所做樣品的指紋信息與系統(tǒng)里的標(biāo)準(zhǔn)樣品指紋信息進(jìn)行比對(duì)，以此分析樣品的真?zhèn)?，從而為品種鑒定和品種權(quán)保護(hù)提供技術(shù)支撐。

3? ?討論

DNA標(biāo)記指紋技術(shù)在玉米、水稻等主要農(nóng)作物品種鑒定上得到廣泛應(yīng)用[2-4]，為其品種權(quán)保護(hù)提供了重要的技術(shù)保障，有效遏制了品種權(quán)侵權(quán)、假冒違法行為。然而像西瓜、番茄、辣椒等非主要農(nóng)作物，指紋鑒定技術(shù)研究相對(duì)較少，目前也沒(méi)有權(quán)威已知品種指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，品種鑒定更多的還是依賴于田間種植鑒定，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且時(shí)效性差。

在沒(méi)有相關(guān)成熟技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的條件下，為更好地開(kāi)展北京市優(yōu)良西瓜品種快速鑒定與品種權(quán)保護(hù)工作，本研究在前期引物篩選的基礎(chǔ)上，利用征集的標(biāo)準(zhǔn)樣品構(gòu)建了北京市主要栽培西瓜品種的SSR指紋，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)指紋信息的共享和比對(duì)，為西瓜品種真實(shí)性快速鑒定提供了重要的輔助作用。下一步將根據(jù)品種推廣的情況，采集更多優(yōu)良西瓜品種的指紋信息，同時(shí)將指紋鑒定結(jié)果與田間種植鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)標(biāo)記引物進(jìn)一步優(yōu)化，提高品種鑒定的準(zhǔn)確性。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 吳明生，牛茜，田雅欄.西瓜品種SSR標(biāo)記鑒定引物的篩選與分析[J].作物雜志，2014（5）：38-42.

[ 2 ] 王鳳格，楊揚(yáng)，易紅梅，等.中國(guó)玉米審定品種標(biāo)準(zhǔn)SSR指紋庫(kù)的構(gòu)建[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（1）：1-14.

[ 3 ] 陸徐忠，倪金龍，李莉，等.利用SSR分子指紋和商品信息構(gòu)建水稻品種身份證[J].作物學(xué)報(bào)，2014（5）：823-829.

[ 4 ] 匡猛，楊偉華，許紅霞.中國(guó)棉花主栽品種DNA指紋圖譜構(gòu)建及SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（1）：20-27.

（收稿日期：2019-08-14）