柱前衍生HPLC/FLD-APCI/MS法同時(shí)測(cè)定藏藥懸鉤木中6種三萜酸類(lèi)成分的含量

馬志良　賽桑杰　多杰

中圖分類(lèi)號(hào) R284.1;R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）16-2243-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.16

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定藏藥懸鉤木中山楂酸、科羅索酸、樺木酸、路路通酸、齊墩果酸、熊果酸等6種三萜酸類(lèi)成分含量的方法。方法：采用柱前衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)/質(zhì)譜聯(lián)用法。選擇2-（7H-二苯并[a，g]咔唑）乙基對(duì)甲苯磺酸酯為熒光衍生化試劑。色譜柱為Hypersil C18，流動(dòng)相為5%乙腈水溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為300 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 395 nm，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL;采用大氣壓化學(xué)電離源、正離子模式，噴霧壓力為60 psi，干燥氣流量為9 L/min，干燥氣溫度為350 ℃，氣化溫度為450 ℃，毛細(xì)管電壓為3 500 V。結(jié)果：山楂酸、科羅索酸、樺木酸、路路通酸、齊墩果酸、熊果酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍均為0.025～6.4 μg/mL（r≥0.999 6）;定量限分別為5.11、4.78、4.42、4.22、4.29、4.51 ng/mL，檢測(cè)限分別為1.42、1.27、1.30、1.28、1.16、1.22 ng/mL;精密度試驗(yàn)的RSD 均小于5%，穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2%（路路通酸未檢出）;加樣回收率分別為97.90%～100.55%（RSD=1.00%，n=6）、97.95%～102.95%（RSD=1.74%，n=6）、96.00%～101.20%（RSD=2.00%，n=6）、93.25%～104.20%（RSD=4.25%，n=6）、92.20%～103.30%（RSD=3.58%，n=6）、97.80%～103.50%（RSD=2.03%，n=6）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、可靠，專(zhuān)屬性好，可用于同時(shí)測(cè)定藏藥懸鉤木中6種三萜酸類(lèi)成分的含量。

關(guān)鍵詞 懸鉤木;三萜酸;山楂酸;科羅索酸;樺木酸;路路通酸;齊墩果酸;熊果酸;柱前衍生化;高效液相色譜-熒光檢測(cè)/質(zhì)譜聯(lián)用;含量測(cè)定

Content Determination of 6 Kinds of Triterpene Acid in Tibetan Medicine Rubus biflorus by Pre-column Derivatization HPLC/FLD-APCI /MS

MA Zhiliang1，2，SAI Sangjie1，2，DUO Jie1，2（1. State Key Laboratory of Tibetan Medicine Research and Development/Qinghai Province Key Laboratory of Tibetan Medicine Research and Development， Xining 810016， China; 2. Qinghai Tibetan Medicine Research Institute， Xining 810016， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for content determination of 6 kinds of triterpene acids such as haw acid， corosolic acid， betula acid， betulonic acid， oleanolic acid and ursolic acid in Tibetan medicine Rubus biflorus. METHODS： Pre-column devrivatization HPLC-FLD-APCI/MS method was adopted. 2-（7H-dibenzo[a，g]carbazol-7-yl） ethyl-4-methylbenzene- sulfonate was used as the pre-column derivatization reagent.Hypersil C18 column was used with the mobile phase consisted of 5% acetonitrile water solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The excitation wavelength of fluorescence was 300 nm and the emission wavelength was 395 nm. The column temperature was 35 ℃， and sample size was 10 μL. Under atmospheric-pressure chemical ionization （APCI） source in positive-ion mode， pressure was 60 psi， the drying gas flow rate was 9 L/min， the dry gas temperature was 350 ℃， the gasification temperature was 450 ℃， and the capillary voltage was 3 500 V. RESULTS： The linear range of haw acid，corosolic acid，betula acid，betulonic acid，oleanolic acid and ursolic acid were 0.025-6.4 μg/mL（r≥0.999 6）. The quantitative limits were 5.11， 4.78， 4.42， 4.22， 4.29， 4.51 ng/mL; and detection limits were 1.42， 1.27， 1.30， 1.28， 1.16， 1.22 ng/mL， respectively. RSD of precision test was less than 5%， stability and repeatability tests were all less than 2%（no betulonic acid detected）. The recovery rates were 97.90%-100.55%（RSD=1.00%，n=6）， 97.95%-102.95%（RSD=1.74%，n=6）， 96.00%-101.20%（RSD=2.00%，n=6）， 93.25%-104.20%（RSD=4.25%，n=6）， 92.20%-103.30%（RSD=3.58%，n=6）， 97.80%-103.50%（RSD=2.03%，n=6）， respectively. CONCLUSIONS： The method is accurate， reliable and exclusive， and can be used for simultaneous determination of 6 kinds of triterpene acids in Tibetan medicine R. biflorus.

KEYWORDS? ?Rubus biflorus; Triterpene acid; Haw acid; Corosolic acid; Betula acid; Betulonic acid; Oleanolic acid; Ursolic acid; Pre-column derivation; HPLC-FLD-APCI/MS; Content determination

藏藥懸鉤木收載于《醫(yī)學(xué)四續(xù)》[1]、《月王藥診》[2]和《晶珠本草》[3]等典籍中，為常用藏藥之一，藏文譯音為“干扎嘎日”，為薔薇科懸鉤子屬植物粉枝莓（Rubus biflorus Buch.-Ham. ex Smith）的干燥、去皮莖或枝，分布于我國(guó)陜西、甘肅、四川、青海、西藏等地[4-5]。《晶珠本草》中記載：“懸鉤木根苦，莖微甘苦，皮微辛，葉苦澀，果實(shí)甜如蜜，根、莖、葉、果治隆熱病和痰病，尤其對(duì)肺病特效，也治熱性時(shí)疫，葉子可清膽病”[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，懸鉤木中含有多種生物活性成分，如黃酮類(lèi)、二萜類(lèi)、三萜及三萜酸類(lèi)、鞣質(zhì)類(lèi)等成分[6-8]，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗過(guò)敏及保肝等作用[9-10]。三萜酸類(lèi)成分為其特征成分，具有抗人類(lèi)免疫缺陷病毒、抗腫瘤、降血脂、抗氧化和抗菌等作用[11-12]。然而，目前對(duì)于懸鉤木的質(zhì)量控制存在一定的局限性，如《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》中僅有其性狀鑒別，未見(jiàn)有其他相關(guān)規(guī)定[13];《青海省藏藥標(biāo)準(zhǔn)》中也未設(shè)有含量測(cè)定項(xiàng)或理化鑒別項(xiàng)[14]。因懸鉤木中的三萜酸類(lèi)成分不具有熒光性，采用衍生化可以使三萜酸類(lèi)成分與衍生化試劑的熒光團(tuán)結(jié)合，以提高檢測(cè)靈敏度，故為更好地控制懸鉤木的質(zhì)量，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[15]，采用柱前衍生高效液相色譜-熒光檢測(cè)/質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC/FLD- APCI/MS）同時(shí)測(cè)定了藏藥懸鉤木中山楂酸、科羅索酸、樺木酸、路路通酸、齊墩果酸、熊果酸等6種三萜酸類(lèi)成分的含量，旨在為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型離子阱液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括G1311A型四元梯度泵、G1322A型在線真空脫氣機(jī)、G1321A型熒光檢測(cè)器、G1316A型自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）;MS204TS型、MS403TS型電子分析天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司];KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)：110709-201808，純度：91.1%）、熊果酸對(duì)照品（批號(hào)：110742-201823，純度：99.9%）、路路通酸對(duì)照品（批號(hào)：111735-201602，純度：96.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;山楂酸對(duì)照品（批號(hào)：4373-41-5，純度：>98%）、科羅索酸對(duì)照品（批號(hào)：4547-24-4，純度：>98%）、樺木酸對(duì)照品（批號(hào)：472-15-1，純度：>98%）均購(gòu)自北京萬(wàn)佳首化生物科技有限公司;2-（7H-二苯并[a，g]咔唑）乙基對(duì)甲苯磺酸酯（DBCETS，衍生化試劑，曲阜師范大學(xué)生命有機(jī)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制）;乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

懸鉤木藥材采自青海、甘肅和西藏等地（批號(hào)：20170801、20170802、20170803、20170804、20170805、20170806），經(jīng)青海省藏醫(yī)藥研究院多杰研究員鑒定為薔薇科植物粉枝莓（Rubus biflorus Buch.-Ham.ex Smith）。取藥材將其根、莖、葉分離后晾干，分別粉碎后過(guò)40目篩，室溫貯存，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：5%乙腈水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，60%B→75%B;15～30 min，75%B→90%B;30～35 min，90%B→100%B），洗脫時(shí)間40 min;流速：1.0 mL/min;熒光激發(fā)波長(zhǎng)：300 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：395 nm;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。在該色譜條件下，所有待測(cè)成分理論板數(shù)均不低于3 000，分離度均大于1.5，空白溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，詳見(jiàn)圖1。

2.1.2 質(zhì)譜條件 大氣壓化學(xué)電離源（APCI），正離子模式;噴霧壓力：60 psi;干燥氣流量：9 L/min;干燥氣溫度：350 ℃;氣化溫度：450 ℃;毛細(xì)管電壓：3 500 V。在該質(zhì)譜條件下，三萜酸類(lèi)成分（以齊墩果酸為例）衍生物的一、二級(jí)質(zhì)譜圖及相關(guān)裂解模式見(jiàn)圖2。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取山楂酸、科羅索酸、樺木酸、路路通酸、齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品各適量，分別置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度均為2.0 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述單一對(duì)照品貯備液各1 mL，置于100 mL量瓶中，加乙腈定容，搖勻，制得質(zhì)量濃度均為20 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取藥材樣品（莖）40 mg，置于10 mL玻璃試管中，加乙醇5 mL，水浴超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理30 min，以3 000 r/min離心5 min;取下層殘?jiān)?，加乙? mL，水浴超聲;合并2次超聲提取液，置于10 mL玻璃試管中，氮?dú)饬飨麓蹈珊?，加乙? mL復(fù)溶，即得供試品溶液。

2.2.3 空白溶液 以乙腈為空白溶液。

2.2.4 衍生化試液 精密稱取DBCETS 23.25 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，制得濃度為5.0×10-3 mol/L的DBCETS溶液，于4 ℃保存，備用。

2.3 衍生化處理

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液50 μL，置于2 mL安瓿瓶中，加入干燥催化劑（K2CO3）30 mg、“2.2.4”項(xiàng)下衍生化試液150 μL、二甲基甲酰胺100 μL，封口后于90 ℃水浴反應(yīng)30 min;待反應(yīng)結(jié)束后，加乙腈300 μL稀釋?zhuān)?jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定。DBCETS與三萜酸類(lèi)成分（以樺木酸為例）的衍生反應(yīng)見(jiàn)圖3。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加乙腈稀釋?zhuān)频觅|(zhì)量濃度為0.025、0.1、0.4、1.6、6.4 μg/mL的系列線性關(guān)系工作溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，用乙腈倍比稀釋?zhuān)础?.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，山楂酸、科羅索酸、樺木酸、路路通酸、齊墩果酸、熊果酸的定量限分別為5.11、4.78、4.42、4.22、4.29、4.51 ng/mL，檢測(cè)限分別為1.42、1.27、1.30、1.28、1.16、1.22 ng/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，山楂酸、科羅索酸、樺木酸、路路通酸、齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為2.55%、3.20%、2.72%、4.30%、2.10%、3.30%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（莖，批號(hào)：20170801）適量，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，分別于室溫下放置0、3、6、9、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，山楂酸、科羅索酸、樺木酸、齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為1.48%、1.01%、1.43%、1.11%、1.72%（n=5），路路通酸未檢出，表明供試品溶液于室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取藥材樣品（莖，批號(hào)：20170801）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中6種成分的含量。結(jié)果，山楂酸、科羅索酸、樺木酸、齊墩果酸、熊果酸的平均含量分別為106.9、112.0、236.4、2 513.5、2 572.6 μg/g，RSD分別為 1.65%、1.59%、1.53%、1.22%、1.43%（n=6），路路通酸未檢出，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取藥材樣品（莖，批號(hào)：20170801）約0.04 g，共6份，分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算含量及加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 耐用性試驗(yàn)

取藥材樣品（莖，批號(hào)：20170801）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件[分別改變不同色譜柱（Agilent Hypersil C18、Agilent Hypersil BDS C8、Agilent Hypersil BDS C18）、流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、柱溫（30 、35、40 ℃）等條件]進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品中各成分的含量。結(jié)果表明，各成分含量的RSD均小于3%，本方法可滿足試驗(yàn)要求，耐用性良好。

2.11 樣品含量測(cè)定

取各批藥材樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，再按“2.1”項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中6種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

有研究認(rèn)為，三萜酸類(lèi)成分本身并無(wú)共軛體系，因此采用紫外-分光光度法很難準(zhǔn)確地測(cè)定其含量[15-16]。此外，由于熊果酸與齊墩果酸、山楂酸與科羅索酸互為同分異構(gòu)體，采用液相、氣相等色譜法很難將這兩對(duì)同分異構(gòu)體分離。而有研究發(fā)現(xiàn)，采用柱前衍生熒光標(biāo)記技術(shù)可增大同分異構(gòu)體間的差異，從而實(shí)現(xiàn)其在液相色譜上的分離[15]。為此，本研究參考上述文獻(xiàn)，采用HPLC/FLD-APCI/MS法對(duì)懸鉤木中6種三萜酸類(lèi)成分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，該方法靈敏度高、選擇性強(qiáng)。

本研究考察了不同色譜柱（Agilent Hypersil C18、Agi- lent Hypersil BDS C8、Agilent Hypersil BDS C18、 Agilent Spherisorb C18）的分離效果，結(jié)果顯示，以Agilent HypersilC18為色譜柱時(shí)的分離度最好。同時(shí)，對(duì)甲醇-水、乙腈-水等不同流動(dòng)相體系進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇為流動(dòng)相時(shí)柱壓較高、基線偏移較大，而以5%乙腈水溶液-乙腈洗脫效果最好、基線平穩(wěn)，因此選擇5%乙腈水溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

含量測(cè)定結(jié)果顯示，懸鉤木各部位中三萜酸類(lèi)成分含量存在明顯差異，懸鉤木莖中齊墩果酸和熊果酸含量較高，分別為2 732.5、2 598.3 μg/g，其次為懸鉤木葉，而懸鉤木根中含量最低;懸鉤木莖中的山楂酸、樺木酸和科羅索酸含量相對(duì)較高，在101.5～262.7 μg/g之間。而路路通酸在懸鉤木各部位中均未檢出。這可能與所采集懸鉤木藥材的生長(zhǎng)環(huán)境等因素有關(guān)[8]。

綜上所述，本研究方法準(zhǔn)確、可靠，專(zhuān)屬性好，可用于同時(shí)測(cè)定藏藥懸鉤木中6種三萜酸類(lèi)成分的含量。

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（收稿日期：2019-03-19 修回日期：2019-06-28）

（編輯：陳 宏）