龍膽藥材中龍膽苦苷、馬錢酸含量測(cè)定與其外觀性狀的相關(guān)性及質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究

劉戰(zhàn)　侯曉琳　宿瑩　吳曉燕　孫金　姜雨昕　翁麗麗

中圖分類號(hào) R282 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）16-2237-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.15

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定龍膽藥材中龍膽苦苷、馬錢酸含量的方法，并考察其含量與外觀性狀的相關(guān)性及進(jìn)行質(zhì)量等級(jí)劃分。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Ascentis Express C18，流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm，進(jìn)樣量為1 μL。以藥材長(zhǎng)度、須根數(shù)及根直徑為指標(biāo)，考察龍膽藥材的外觀性狀特征;采用SPSS 21.0軟件分析藥材中龍膽苦苷、馬錢酸含量與其外觀性狀的相關(guān)性;采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行k-均值聚類分析，并建立龍膽藥材的質(zhì)量等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果：龍膽苦苷、馬錢酸檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.5～3.0 mg/mL（r=0.999 9）、0.05～0.50 mg/mL（r=0.999 9）;定量限分別為0.295、0.289 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.082、0.081 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的 RSD均小于2%;加樣回收率分別為97.56%～102.23%（RSD=1.56%，n=6）、97.58%～102.67%（RSD=1.86%，n=6）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，藥材中龍膽苦苷、馬錢酸含量與其長(zhǎng)度、須根數(shù)、根直徑均呈正相關(guān)，且對(duì)含量的影響程度大小依次為須根數(shù)>長(zhǎng)度>根直徑。聚類分析結(jié)果顯示，54批龍膽藥材可分聚為2類，S4～S6、S13、S17～S23、S25、S28、S31～S34聚為一類;S1～S3、S7～S12、S14～S16、S24、S26、S27、S29、S30、S35～S54聚為一類。質(zhì)量等級(jí)劃分結(jié)果顯示，54批龍膽藥材可分為2個(gè)等級(jí)，其結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致。結(jié)論：所建含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性較好，可用于同時(shí)測(cè)定龍膽藥材中龍膽苦苷、馬錢酸的含量;龍膽藥材須根數(shù)越多、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、根直徑越粗，馬錢酸和龍膽苦苷的含量越高，藥材質(zhì)量越好。

關(guān)鍵詞 龍膽;龍膽苦苷;馬錢酸;高效液相色譜法;外觀性狀;相關(guān)性;聚類分析;質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

Correlation Study of the Contents of Gentiopicrin and Loganic Acid with Appearance Traits of Gentiana scabra and Its Quality Gradation Criterion

LIU Zhan，HOU Xiaolin，SU Ying，WU Xiaoyan，SUN Jin，JIANG Yuxin，WENG Lili（College of Pharmacy， Changchun University of TCM， Changchun 130117， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for the content determination of gentiopicrin and loganic acid in Gentiana scabra， and to investigate the correlation of their contents with appearance traits and quality gradation criterion. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Ascentis Express C18 column with mobile phase consisted of 0.1% phosphoric acid-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and detection wavelength was set at 240 nm. The sample size was 1 μL. Taking the length， number and diameter of fibrous roots as indexes， the appearance and morphological characteristics of G. scabra were studied. The relationship of gentiopicrin and loganic acid content with the appearance property of medicinal material was analyzed by SPSS 21.0 software. k-mean clustering analysis was carried out by using SPSS 21.0 software， and gradation standard for G. scabra was established preliminarily. RESULTS： The linear range of gentiopicrin and loganic acid were 0.5-3.0 μg/mL （r=0.999 9） and 0.05-0.50 μg/mL （r=0.999 9）. The limit of quantification of gentiopicrin and loganic acid were 0.295， 0.289 μg/mL; the detection limit were 0.082， 0.081 μg/mL; RSDs of precision， stability， repeatability tests were all lower than 2%; the recovery rates were 97.56%- 102.23% （RSD=1.56%， n=6） and 97.58%-102.67% （RSD=1.86%， n=6）. Correlation results showed that there was a significant positive correlation of the length of G. scabra， the number of roots， root diameter， with the contents of gentiopicrin and loganic acid. The order of affecting content was the number of roots >length >root diameter. k-means clustering analysis showed that 54 batches of G. scabra was divided into two categories; S4-S6，S13，S17-S23，S25，S28，S31-S34 were clustered into a category; S1-S3， S7-S12， S14-S16， S24， S26，S27，S29， S30，S35-S54 were clustered into the other category. The results of gradation showed that 54 batches of G. scabra could be divided into two grades， and the results were consistent with the cluster analysis. CONCLUSIONS： Established method is simple and stable， and can be used for simultaneous determination of gentiopicrin and loganic acid in G. scabra. The more fibrous roots， the longer the length， the thicker the root， the higher the content of gentiopicroside and loganic acid， the better the quality of G. scabra.

KEYWORDS? ?Gentiana scabra; Gentiopicrin; Loganic acid; HPLC; Appearance trait; Correlation; Cluster analysis; Quality gradation criterion

龍膽為龍膽科（Gentianaceae）植物條葉龍膽（Gentiana manshurica Kitag.）、龍膽（Gentiana scabra Bunge.）、三花龍膽（Gentiana triflora Pall.）或堅(jiān)龍膽（Gentiana rigescens Franch.）的干燥根及根莖[1]。龍膽是一種使用歷史悠久的常見中藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性苦，寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉肝膽火之功效[2]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，除具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、健胃、保護(hù)或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用外，還可用于治療心腦血管系統(tǒng)疾病[3]。龍膽苦苷、馬錢酸是龍膽的標(biāo)志性成分，具有利膽、抗炎、健胃、降壓等作用[4]，其中龍膽苦苷也是2015年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]收載的用于評(píng)價(jià)龍膽質(zhì)量的指標(biāo)性成分。

龍膽主要分布于黑龍江、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古等省，具有重要的藥用價(jià)值[4]。2012年開始，吉林省開展了一項(xiàng)全省范圍的中藥資源普查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受生態(tài)環(huán)境破壞及不合理采挖等多種因素影響，野生龍膽資源已日漸減少[5]。目前市場(chǎng)上的龍膽藥材大多為人工種植，但由于地理環(huán)境及種植規(guī)范程度的不同，其質(zhì)量良莠不齊。此外，市場(chǎng)上所謂的藥材質(zhì)控“標(biāo)準(zhǔn)”也未在2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中收錄，且大部分龍膽藥材及飲片不分等級(jí)和質(zhì)量全部混合統(tǒng)裝，導(dǎo)致藥材市場(chǎng)中部分藥材商品品別、規(guī)格、等級(jí)混亂，難以實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)[6]。近年來，有學(xué)者對(duì)中藥材的質(zhì)量與其外觀性狀的關(guān)系進(jìn)行了研究，如蔡廣知等[7]研究發(fā)現(xiàn)，甘草藥材的質(zhì)量與其直徑呈正相關(guān);張歡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，金銀花藥材的質(zhì)量與其外觀色度呈正相關(guān)。雖然《中藥材商品規(guī)格等級(jí)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了龍膽的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]，但考察指標(biāo)較少，也未結(jié)合有效成分進(jìn)行分析，存在一定的局限性[10]。為此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定龍膽藥材中龍膽苦苷、馬錢酸的含量，并比較了54批龍膽藥材樣品中上述成分含量與其外觀性狀的相關(guān)性，以建立龍膽藥材的等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，旨在為篩選優(yōu)良種質(zhì)資源提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Prominence-ILC-2030型HPLC儀，包括四元泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外-可見光檢測(cè)器、柱溫箱、色譜工作站（日本Shimadzu公司）;JA2603B型千分之一電子天平（上海天美天平儀器有限公司）;FA1004B型萬分之一電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）;KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;DHG-9053A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;FST-Ⅲ-20s型超純水機(jī)（上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)：110770-201716，純度：97.6%）;馬錢酸對(duì)照品（批號(hào)：111865-201704，純度：97.4%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供;乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水

1.3 藥材

54批龍膽藥材（編號(hào)：S1～S54），經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定教研室翁麗麗教授鑒定為龍膽科植物龍膽（Gentiana scabra Bunge.）的干燥根及根莖。藥材樣品來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Ascentis Express C18（50 mm×3.0 mm，2.7 μm）;流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）;流速：0.4 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm;進(jìn)樣量：1 μL。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取龍膽苦苷對(duì)照品、馬錢酸對(duì)照品適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成龍膽苦苷、馬錢酸質(zhì)量濃度分別為1.0、0.2 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末（過四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液 以甲醇為陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，各成分基線分離良好，分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于3 000，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無干擾。

2.1.6 線性關(guān)系考察 取龍膽苦苷對(duì)照品、馬錢酸對(duì)照品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成龍膽苦苷質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL、馬錢酸質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg/mL的系列線性關(guān)系工作溶液，取適量按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。

2.1.7 定量限與檢測(cè)限考察 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，倍比稀釋，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以信噪比為10 ∶ 1、3 ∶ 1計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果，龍膽苦苷、馬錢酸的定量限分別為0.295、0.289 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.082、0.081 μg/mL。

2.1.8 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷、馬錢酸峰面積的RSD分別為1.64%、1.25%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取 “2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S35）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷、馬錢酸峰面積的RSD分別為0.56%、1.04%（n=8），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材樣品粉末（編號(hào)：S35）適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中龍膽苦苷、馬錢酸的含量。結(jié)果，龍膽苦苷、馬錢酸的平均含量為5.23、0.88 mg/g，RSD分別為1.34%、0.99%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的藥材樣品粉末（編號(hào)：S35）適量，共6份，精密稱定，加入一定量的混合對(duì)照品粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

2.1.12 樣品含量測(cè)定 取54批藥材樣品粉末適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中龍膽苦苷、馬錢酸的含量，結(jié)果見表5。

2.2 龍膽藥材外觀性狀特征

以藥材長(zhǎng)度、須根數(shù)及根直徑為指標(biāo)，考察龍膽藥材的外觀性狀特征。

2.2.1 藥材長(zhǎng)度 54批藥材樣品每批隨機(jī)選取5根完整的藥材，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量根莖至根末端的長(zhǎng)度，以x±s表示，結(jié)果見表6。

2.2.2 須根數(shù) 54批藥材樣品每批隨機(jī)選取5根完整的藥材，數(shù)須根數(shù)，以x±s表示，結(jié)果見表6。

2.2.3 根直徑 54批藥材樣品每批隨機(jī)選取5根完整的藥材，采用游標(biāo)卡尺測(cè)量根上（根莖）、中（簇生根中部）、下（簇生根尾部）3處直徑，以x±s表示，結(jié)果見表6。

2.3 藥材樣品有效成分含量與外觀性狀的相關(guān)性分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)藥材中龍膽苦苷、馬錢酸含量與其長(zhǎng)度、須根數(shù)、根直徑進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05表示相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表7。

由表7可知，藥材中龍膽苦苷、馬錢酸含量與其長(zhǎng)度、須根數(shù)、根直徑均呈正相關(guān)，相關(guān)性具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），且影響含量的外觀性狀特征指標(biāo)的順序依次為須根數(shù)>長(zhǎng)度>根直徑，提示龍膽藥材須根數(shù)越多、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、直徑越粗，則龍膽苦苷和馬錢酸含量越高。

2.4 聚類分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)龍膽苦苷、馬錢酸含量、藥材長(zhǎng)度、須根數(shù)、根直徑的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并進(jìn)行k-均值聚類分析，詳見圖2。由圖2可知，54批藥材樣品可聚為2類：S4～S6、S13、S17～S23、S25、S28、S31～S34聚為一類;S1～S3、S7～S12、S14～S16、S24、S26、S27、S29、S30、S35～S54聚為一類。

2.5 質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)建立及劃分

在參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]的基礎(chǔ)上，根據(jù)有效成分含量與藥材樣品外觀性狀的相關(guān)性及聚類分析結(jié)果建立藥材質(zhì)量等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（見表8），并對(duì)54批藥材樣品進(jìn)行等級(jí)劃分。結(jié)果顯示，54批藥材樣品可劃分為2個(gè)等級(jí)：S4～S6、S13、S17～S23、S25、S28、S31～S34為一級(jí);S1～S3、S7～S12、S14～S16、S24、S26、S27、S29、S30、S35～S54為二級(jí)。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，其部分典型外觀特征見圖3（選取部分不同等級(jí)龍膽藥材中較典型的外觀特征圖片）。

3 討論

本研究考察了0.1%磷酸水溶液-甲醇、0.1%磷酸水溶液-乙腈等不同流動(dòng)相體系的分離效果，結(jié)果表明，以0.1%磷酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相時(shí)的洗脫和分離效果最好，故選擇0.1%磷酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。同時(shí)又對(duì)供試品的提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加熱回流法與超聲提取法的提取率相當(dāng)，但考慮到操作的簡(jiǎn)便性，故選擇提取方法為超聲提取。

《本草圖經(jīng)》曰：龍膽“宿根黃白色，下抽根十余本”[11]?！?00味常用中藥材的經(jīng)驗(yàn)鑒別》中描述龍膽以“根條粗大飽滿、長(zhǎng)條順直，根上有環(huán)紋，質(zhì)柔軟，色黃或黃棕，不帶莖枝，味極苦者為佳”[12]。《中華藥?！分忻枋觥耙愿鶙l粗長(zhǎng)，黃色或黃棕色、無碎斷者為佳，根條細(xì)短或者根條少，色紅黃者質(zhì)次;龍膽根通常二十余條，三花龍膽根約十五條，條葉龍膽根通常小于十條”[13]?！督鹗涝兴幉膫鹘y(tǒng)鑒別經(jīng)驗(yàn)》中描述“以東北三省所產(chǎn)的三種龍膽質(zhì)量為優(yōu)，并以根條粗長(zhǎng)，黃色或黃棕色者為佳”[14]。這表明龍膽在古代作藥用時(shí)須根數(shù)十余根者為佳。有研究發(fā)現(xiàn)，龍膽草莖色、葉色等性狀與龍膽苦苷等有效成分含量具有相關(guān)性[15];堅(jiān)龍膽的根直徑、根長(zhǎng)、須根數(shù)與有效成分含量均呈正相關(guān)[16 ]。本研究的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，藥材中龍膽苦苷、馬錢酸含量與其須根數(shù)、長(zhǎng)度、根直徑均呈正相關(guān)，且對(duì)含量的影響程度大小順序?yàn)轫毟鶖?shù)>長(zhǎng)度>根直徑。這提示，龍膽藥材的須根數(shù)越多、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、根直徑越粗，則龍膽苦苷和馬錢酸的含量越高，藥材質(zhì)量越好，這也初步驗(yàn)證了龍膽藥材的傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別結(jié)果[11-14]。聚類分析結(jié)果顯示，54批樣品可聚為2類，S4～S6、S13、S17～S23、S25、S28、S31～S34聚為一類;S1～S3、S7～S12、S14～S16、S24、S26～S27、S29～S30、S35～S54聚為一類，該結(jié)果與等級(jí)劃分結(jié)果一致。

由于種植龍膽的地區(qū)存在儀器檢測(cè)不方便、含量測(cè)定的可操作性低等現(xiàn)象，故本研究通過龍膽藥材外觀性狀與其有效成分含量的相關(guān)性及聚類分析結(jié)果，建立了龍膽藥材質(zhì)量等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，旨在應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)直接通過龍膽藥材的外觀性狀初步判斷其質(zhì)量?jī)?yōu)劣，也為其生產(chǎn)及商品流通過程中的初步品控提供了依據(jù)。

綜上所述，所建含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性較好，可用于同時(shí)測(cè)定龍膽藥材中龍膽苦苷、馬錢酸的含量;龍膽藥材須根數(shù)越多、長(zhǎng)度越長(zhǎng)、根直徑越粗，則馬錢酸和龍膽苦苷的含量越高、藥材質(zhì)量越好。

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（收稿日期：2019-01-23 修回日期：2019-06-05）

（編輯：陳宏）