健脾益腎丸指標(biāo)成分的含量測(cè)定及其對(duì)CRF模型大鼠鈣磷代謝和炎癥因子的影響

江霞　陳秋谷　郭麗琴　胡兆流　黃詩(shī)瑩　王佛長(zhǎng)　鄭平　易鐵鋼　張尚斌　李順民　陳劍平

中圖分類號(hào) R961.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）16-2193-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.07

摘 要 目的：建立健脾益腎丸（JYP）中黃芪甲苷、大黃素、大黃酚的含量測(cè)定方法，并探討JYP對(duì)慢性腎衰竭（CRF）模型大鼠鈣磷代謝和炎癥因子等相關(guān)指標(biāo)的影響。方法：采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。黃芪甲苷以及大黃素、大黃酚的色譜柱分別為Agilent Zorbax SB-C18、Agilent TC C18，流動(dòng)相分別為乙腈-水（36 ∶ 64，V/V）、甲醇-0.1%磷酸溶液（75 ∶ 25，V/V），檢測(cè)器分別為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器和二極管陣列檢測(cè)器（后者檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm），柱溫分別為30、25 ℃，流速均為1.0 mL/min，進(jìn)樣量分別為20、10 μL。將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、尿毒清組（1.80 g/kg）和JYP低、中、高劑量組（1.71、3.43、6.85 g/kg），每組10只。除正常組外，其余組大鼠均采用5/6腎切除方法復(fù)制CRF模型。造模4個(gè)月后，正常組和模型組大鼠均灌胃相應(yīng)體積水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)12周。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)大鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、甲狀旁腺激素（PTH）和炎癥因子[白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）]含量，采用甲基百里香酚藍(lán)比色法和磷鉬酸法檢測(cè)其血鈣、血磷含量，采用Pearson檢驗(yàn)考察炎癥因子與鈣磷代謝相關(guān)指標(biāo)（血鈣、血磷、PTH）的相關(guān)性。結(jié)果：黃芪甲苷、大黃素、大黃酚檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為54.537～381.759、2.960～20.720、6.318～44.223 μg/mL（r>0.999），定量限分別為0.010、0.288、0.216 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.003、0.096、0.072 μg/mL，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于3.0%，加樣回收率為97.18%～102.33%（RSD<3%，n=9）。造模后（給藥前），模型組和各給藥組大鼠血清Scr、BUN含量均較正常組顯著升高（P<0.01）;給藥后，各給藥組大鼠上述指標(biāo)均較模型組和同組給藥前顯著降低（P<0.01）。與正常組比較，模型組大鼠血鈣含量顯著降低，IL-6、TNF-α含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，JYP中、高劑量組大鼠血鈣含量均顯著升高，尿毒清組PTH含量，JYP中、高劑量組PTH、IL-6含量以及各給藥組TNF-α含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;但JYP對(duì)大鼠血磷含量無(wú)顯著影響，且其血清炎癥因子與鈣磷代謝相關(guān)指標(biāo)均無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）。結(jié)論：本含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于JYP中黃芪甲苷、大黃素、大黃酚的含量測(cè)定。JYP可改善CRF模型大鼠的腎功能，緩解其鈣代謝紊亂，并抑制其炎癥因子的表達(dá)。

關(guān)鍵詞 健脾益腎丸;黃芪甲苷;大黃素;大黃酚;含量測(cè)定;高效液相色譜法;慢性腎衰竭;鈣磷代謝;炎癥因子;大鼠

Content Determination of Indicator Components in Jianpi Yishen Pills and the Effects on Calcium， Phosphorus Metabolism and Inflammatory Factors in CRF Model Rats

JIANG Xia1，2，CHEN Qiugu2，GUO Liqin1，HU Zhaoliu2，HUANG Shiying2，WANG Fochang2，ZHENG Ping2，YI Tiegang2，ZHANG Shangbin2，LI Shunmin2，CHEN Jianping2（1. Dept. of Pharmacy， Guangzhou Hospital of TCM， Guangzhou 510130， China; 2. Shenzhen Key Lab of Hospital TCM Preparation， Shenzhen Hospital of TCM， Guangdong Shenzhen 518033， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for the content determination of astragaloside Ⅳ， emodin and chrysophanol in Jianpi yishen pills （JYP） and to investigate the effects of JYP on calcium， phosphorus metabolism and inflammatory factors in chronic renal failure （CRF） model rats. METHODS： HPLC method was adopted. The determination of astragaloside Ⅳ， emodin and chrysophanol was perform on Agilent Zorbax SB-C18， Agilent TC C18 column， respectively; mobile phase consisted of acetonitrile-water （36 ∶ 64， V/V） and methanol-0.1% phosphoric acid solution （75 ∶ 25， V/V）; the detectors were evaporative light-scattering detector and diode-array detector （detection wavelength of 254 nm）; the column temperatures were set at 30 ℃and 25 ℃ at the flow rate of 1.0 mL/min; the sample sizes were 20 and 10 μL. SD rats were randomly divided into normal group， model group， Niaoduqing group （1.80 g/kg） and JYP low-dose， medium-dose and high-dose groups （1.71， 3.43， 6.85 g/kg）， with 10 rats in each group. Except for normal group， CRF model of other groups were established by 5/6 nephrectomy in other groups. Four months after modeling， normal group and model group were given constant volume of water intragastrically; admi- nistration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 12 weeks. The levels of serum creatinine （Scr）， urea nitrogen （BUN）， parathyroid hormone （PTH） and inflammatory factors （IL-6， TNF-α） were measured by ELISA. Methyl thymol blue colorimetric method and phosphomolybdic acid method were used to detect the contents of blood calcium and phosphorus. Correlation of inflammatory factors with related calcium and phosphorus metabolism indexes （blood calcium， blood phosphorus， PTH） were investigated with Pearson assay. RESULTS： The linear range of astragaloside Ⅳ， emodin and chrysophanol were 54.537-381.759， 2.960-20.720， 6.318-44.223 μg/mL， respectively. The limits of quantitation were 0.010， 0.288， 0.216 μg/mL; the limits of detection were 0.003， 0.096， 0.072 μg/mL. RSDs of precision， reproducibility and stability tests were all lower than 3.0%. The recoveries were 97.18%-102.33%（RSD<3%，n=9）. After modeling （before medication）， serum contents of Scr and BUN in model group and administration group were increased significantly， compared with normal group （P<0.01）. After medication， above indexes of administration group were decreased significantly， compared with model group and the same group before medication （P<0.01）. Compared with normal group， the content of blood calcium were decreased significantly， while the contents of IL-6 and TNF-α were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the content of blood calcium were increased significantly in JYP medium-dose and high-dose groups， while serum content of PTH in Niaoduqing group， serum contents of PTH and IL-6 in JYP medium-dose and high-dose groups as well as serum content of TNF-α in administration group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. JYP had no significant effect on blood phosphorus in rats， and there was no correlation of inflammatory factors with related calcium and phosphorus metabolism indexes （P>0.05）. CONCLUSIONS： The established content determination method is simple， specific and sensitive， and can be used for content determination of astragaloside Ⅳ， emodin and chrysophanol in JYP. JYP can improve renal function of CRF model rats， relieve calcium metabolism disorder and inhibit the expression of inflammatory factors.

KEYWORDS? ?Jianpi yishen pills; Astragaloside Ⅳ; Emodin; Chrysophanol; Content determination; HPLC; Chronic renal failure; Calcium and phosphorus metabolism; Inflammatory factors; Rat

慢性腎衰竭（Chronic renal failure，CRF）是各種慢性腎?。–KD）進(jìn)行性進(jìn)展的終末階段，可造成腎單位受損和腎功能不全，從而誘發(fā)以鈣磷代謝紊亂，水、電解質(zhì)、酸堿平衡異常以及內(nèi)分泌失調(diào)為主要特征的臨床綜合征[1]。2012年流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)CRF的發(fā)病率逐年攀升，已成為危害公眾健康的常見嚴(yán)重疾病之一[2]。目前，臨床常用的血液透析、腹膜透析以及化學(xué)藥治療等方式雖療效較好，但毒副作用明顯，且容易誘發(fā)患者微炎癥狀態(tài)、貧血等并發(fā)癥，加之治療費(fèi)用昂貴，故其臨床應(yīng)用受到一定限制[3]。中醫(yī)藥治療CRF立足于整體觀，可調(diào)節(jié)患者臟腑功能，具有多靶點(diǎn)、多層次、雙向調(diào)節(jié)的綜合治療作用，可有效防止和延緩CRF的發(fā)生與發(fā)展[4]，故篩選并開發(fā)療效確切、作用持久且毒副作用小的中藥制劑對(duì)CRF的治療具有重要意義。

健脾益腎丸（Jianpi yishen pills，JYP）是深圳市中醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）經(jīng)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐總結(jié)并研制的中藥復(fù)方制劑，由黃芪、大黃、山藥、丹參、白術(shù)、豆蔻、酒蓯蓉、炙甘草等8味藥材組成，具有健脾益腎、通腑泄?jié)?、活血化瘀的功效[5]。該藥治療CRF療效確切，且無(wú)明顯不良反應(yīng)[6]。前期的初步質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究?jī)H對(duì)該方中黃芪、甘草、大黃、酒蓯蓉等4味藥材進(jìn)行了薄層色譜鑒別，并參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）“丸劑”項(xiàng)下相應(yīng)檢查項(xiàng)進(jìn)行了檢查[7-8]，尚無(wú)法滿足現(xiàn)代制劑生產(chǎn)和產(chǎn)品檢驗(yàn)工作的相關(guān)要求。為了更好地提高JYP的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保其臨床用藥的有效性和安全性，本研究在前期質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)JYP的制備工藝，建立了君藥黃芪和使藥大黃指標(biāo)成分含量測(cè)定的高效液相色譜法（HPLC），并初步探討了該方對(duì)CRF模型大鼠鈣磷代謝和炎癥因子等指標(biāo)的影響，以期為完善JYP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、闡明其治療CRF的具體機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

20A型HPLC儀、ELSD-LT Ⅱ型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、SPD-M20A型二極管陣列（PDA）檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）;Varioskan Flash型全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀、TSU300型超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;BS224S型萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）;J3000型動(dòng)物電子秤（德國(guó)G&G公司）;DD-2型高頻電刀（北京東方神健醫(yī)療器械有限公司）;3K30型離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）。

1.2 藥品與試劑

JYP及其缺黃芪陰性對(duì)照樣品、缺大黃陰性對(duì)照樣品（即按處方工藝制備的缺相應(yīng)藥材的對(duì)照樣品）均由我院制劑室自制，批號(hào)分別為20180615、20180625、20180620，規(guī)格均為0.05 g;尿毒清顆粒[陽(yáng)性對(duì)照，康臣藥業(yè)（內(nèi)蒙古）有限責(zé)任公司，批號(hào)：20130628，規(guī)格：每袋5 g];黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201717，純度：96.9%）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-201512，純度：98.7%）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201621，純度：99.2%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、甲狀旁腺激素（PTH）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)試劑盒（天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為385171104、569171102、468171104）;鈣、磷測(cè)試盒以及血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20171022、20170913、20171024、20171027）;乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 健脾益腎丸指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.1.1 黃芪甲苷含量測(cè)定 由于JYP中的君藥黃芪采用水煎煮提取，故針對(duì)此工藝路線，本研究建立了黃芪所含指標(biāo)成分黃芪甲苷[9]的含量測(cè)定方法，以保證其成品質(zhì)量的穩(wěn)定均一。

（1）色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（漂移管溫度：55 ℃，氮?dú)鈮毫Γ?60 kPa），流動(dòng)相為乙腈-水（36 ∶ 64，V/V），柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

（2）溶液的制備：①取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。②取JYP樣品適量，粉碎，精密稱定10 g，加入甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過，殘?jiān)眉状枷礈?次，每次20 mL;合并洗滌液，蒸干，殘?jiān)盟?0 mL溶解，用經(jīng)水飽和的正丁醇振搖萃取4次，每次40 mL;合并正丁醇萃取液，用經(jīng)正丁醇飽和的水洗滌3次，每次40 mL，再用1%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次40 mL;合并洗滌液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL量瓶中，搖勻，即得供試品溶液。③取缺黃芪陰性對(duì)照樣品10 g，精密稱定，按上述供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照溶液。

（3）專屬性試驗(yàn)：精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，對(duì)照品溶液和供試品溶液在相同位置有同一色譜峰，且陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，表明本方法專屬性良好，詳見圖1。

（4）線性關(guān)系以及定量限和檢測(cè)限考察：取黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為0.779 1 mg/mL的貯備液。精密吸取上述貯備液0.07、0.14、0.28、0.35、0.42、0.49 mL，置于1 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為54.537、109.074、218.148、272.685、327.222、381.759 μg/mL的線性對(duì)照品溶液，按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（μg/mL）的自然對(duì)數(shù)（x）為橫坐標(biāo)、峰面積的自然對(duì)數(shù)（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=1.225 4x+8.057 3（r=0.999 7），表明黃芪甲苷檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為54.537～381.759 μg/mL。另以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1測(cè)得定量限、檢測(cè)限分別為0.010、0.003 μg/mL。

（5）精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率考察：①取“2.1.1（2）”項(xiàng)下供試品溶液適量，按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，考察方法精密度。②取同一批JYP樣品適量，按“2.1.1（2）”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，考察重復(fù)性。③取上述重復(fù)性試驗(yàn)的同一份供試品溶液，分別于室溫下放置0、3、6、9、12、18 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，考察樣品穩(wěn)定性。④取JYP樣品4份，分別由兩位研究者按前述方法制備供試品溶液，以同一儀器進(jìn)樣測(cè)定，考察中間精密度。⑤取9份已知含量的JYP樣品5 g，精密稱定，分別按質(zhì)量比1 ∶ 0.5、1 ∶ 1、1 ∶ 1.5加入黃芪甲苷對(duì)照品適量，再按前述方法制得低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)中黃芪甲苷含量（以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算）的RSD均小于2.0%;低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液的平均加樣回收率分別為101.80%、100.37%、101.51%，RSD分別為2.13%、2.08%、1.23%。

（6）樣品含量測(cè)定：取JYP樣品10 g，平行3份，按“2.1.1（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得黃芪甲苷的平均含量為0.102 mg/g;按公式[轉(zhuǎn)移率=JYP樣品中黃芪甲苷的含量/（黃芪藥材中黃芪甲苷的含量×每克JYP中黃芪藥材的質(zhì)量）×100%]計(jì)算得轉(zhuǎn)移率為47.13%[其中，按2015年版《中國(guó)藥典》（一部）“黃芪”項(xiàng)下黃芪甲苷含量測(cè)定方法[10]測(cè)得黃芪藥材中黃芪甲苷的含量為0.402 mg/g，每克JYP中含黃芪藥材0.538 4 g]。

2.1.2 大黃素和大黃酚含量測(cè)定 由于JYP中的大黃、白術(shù)[2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中無(wú)含量測(cè)定指標(biāo)成分]、豆蔻（含量測(cè)定指標(biāo)成分桉油精具有揮發(fā)性，穩(wěn)定性欠佳）等藥味均經(jīng)粉碎后入藥，故針對(duì)此工藝路線，本研究建立了大黃所含指標(biāo)成分大黃素、大黃酚[11]的含量測(cè)定方法，以保證其成品質(zhì)量的穩(wěn)定均一。

（1）色譜條件：色譜柱為Agilent TC C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)器為PDA檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液（75 ∶ 25，V/V），柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

（2）溶液的制備：①取大黃素、大黃酚對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，制得質(zhì)量濃度分別為12、24 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。②取JYP樣品適量，粉碎，精密稱定1.5 g，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過;精密量取續(xù)濾液5 mL，揮去溶劑，殘?jiān)?%鹽酸溶液10 mL，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h;放冷，置分液漏斗中，用三氯甲烷振搖萃取3次，每次10 mL;合并三氯甲烷萃取液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状紡?fù)溶并定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得供試品溶液。③取缺大黃陰性對(duì)照樣品1.5 g，精密稱定，按上述供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照溶液。

（3）專屬性試驗(yàn)：精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1.2（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，對(duì)照品溶液和供試品溶液在相同位置有同一色譜峰，且陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，表明本方法專屬性良好，詳見圖2。

（4）線性關(guān)系以及定量限和檢測(cè)限考察：取大黃素、大黃酚對(duì)照品各適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.118 4、0.180 5 mg/mL的單一貯備液。精密吸取上述大黃素貯備液0.25、0.50、1.00、1.25、1.50、1.75 mL，大黃酚貯備液0.35、0.70、1.40、1.75、2.10、2.45 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得大黃素質(zhì)量濃度分別為2.960、5.920、11.840、14.800、17.760、20.720 μg/mL，大黃酚質(zhì)量濃度分別為6.318、12.635、25.270、31.588、37.905、44.223 μg/mL的混合線性對(duì)照品溶液，按“2.1.2（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以待測(cè)物質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得大黃素、大黃酚的回歸方程分別為y=43 557.7x-29 724.5（r=0.999 1）、y=59 374.6x-70 701.2（r=0.999 6），表明大黃素、大黃酚檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.960～20.720、6.318～44.223 μg/mL。另以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1測(cè)得大黃素、大黃酚的定量限分別為0.288、0.216 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.096、0.072 μg/mL。

（5）精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率考察：①取“2.1.2（2）”項(xiàng)下供試品溶液適量，按“2.1.2（1）”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，考察方法精密度。②取同一批JYP樣品，按“2.1.2（2）”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，考察重復(fù)性。③取上述重復(fù)性試驗(yàn)的同一份供試品溶液，分別于室溫下放置0、1、2、3、6、9、12、18、24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，考察樣品穩(wěn)定性。④取JYP樣品4份，分別由兩位研究者按前述方法制備供試品溶液，以同一儀器進(jìn)樣測(cè)定，考察中間精密度。⑤取9份已知含量的JYP樣品0.75 g，精密稱定，分別按質(zhì)量比1 ∶ 0.5、1 ∶ 1、1 ∶ 1.5加入大黃素、大黃酚對(duì)照品適量，再按前述方法制得低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)中大黃酚、大黃素含量（以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算）的RSD均小于3.0%;大黃素低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液的加樣回收率分別為99.78%、98.91%、97.18%，RSD分別為1.55%、0.76%、0.51%;大黃酚低、中、高質(zhì)量濃度樣品溶液的加樣回收率分別為98.29%、102.33%、98.94%，RSD分別為1.02%、0.32%、0.70%。

（6）樣品含量測(cè)定：取JYP樣品1.5 g，平行3份，按“2.1.2（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得大黃素和大黃酚的含量分別為0.341、0.770 mg/g，兩者總含量為1.111 mg/g;按“2.1.1（6）”項(xiàng)下公式計(jì)算得轉(zhuǎn)移率為97.90%[其中，按2015年版《中國(guó)藥典》（一部）“大黃”項(xiàng)下總蒽醌含量測(cè)定方法[10]測(cè)得藥材中大黃素和大黃酚的總含量為6.322 mg/g，每克JYP中含大黃藥材0.179 5 g]。

2.2 JYP對(duì)CRF模型大鼠鈣磷代謝和炎癥因子等指標(biāo)的影響

2.2.1 分組 所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，然后隨機(jī)分為正常組、模型組、尿毒清組以及JYP低、中、高劑量組，每組10只，雌雄各半。

2.2.2 給藥劑量確定 按照《中藥藥理研究方法學(xué)》中的“體表面積比換算法”[12]換算，分別以尿毒清1.80 g/kg（按成人臨床等效劑量的1倍換算而得）以及JYP 1.71、3.43、6.85 g/kg（分別按成人臨床等效劑量的1/4、1/2、1倍換算而得）作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥劑量。

2.2.3 模型復(fù)制 采用5/6腎切除方法復(fù)制大鼠CRF模型[13-14]：腹腔注射10%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，從右背部切開腹腔，用靜脈夾夾住腎蒂后，使用高頻電刀切除2/3右腎，止血后復(fù)位腎臟;2周后同法切除左腎。正常組大鼠僅以相同步驟打開腹腔，暴露腎臟后復(fù)位，避免牽拉腎臟。造模4個(gè)月后，正常組和模型組大鼠均灌胃相應(yīng)體積水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（20 mL/kg，均以水為溶劑），每日1次，連續(xù)12周。

2.2.4 相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)及統(tǒng)計(jì)分析 分別于造模后（給藥前）和末次給藥后1 h取各組大鼠血液并分離血清，采用ELISA法以酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中Scr、BUN（給藥前及給藥后）以及PTH、炎癥因子（給藥后）含量，分別采用甲基百里香酚藍(lán)比色法和磷鉬酸法檢測(cè)其血鈣、血磷含量（給藥后）。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書操作。采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK或Dunnett’s T3法，相關(guān)性分析采用Pearson法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表1、表2。

由表1可見，造模后（給藥前），模型組和各給藥組大鼠血清Scr、BUN含量均較正常組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。給藥后，模型組大鼠血清Scr、BUN含量均較正常組顯著升高，但各給藥組大鼠血清Scr、BUN含量均較模型組和同組給藥前顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

由表2可見，與正常組比較，模型組大鼠血鈣含量顯著降低，IL-6、TNF-α含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，JYP中、高劑量組大鼠血鈣含量均顯著升高;尿毒清組大鼠血清PTH含量，JYP中、高劑量組PTH、IL-6含量以及各給藥組TNF-α含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。但JYP對(duì)大鼠血磷含量的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2.5 炎癥因子與鈣磷代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析 由于CRF患者除鈣磷代謝紊亂等臨床癥狀外，通常還伴隨不同程度的微炎癥狀態(tài)[15]，故本研究采用Pearson檢驗(yàn)考察了各給藥組大鼠血清炎癥因子與鈣磷代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，各給藥組大鼠的炎癥因子IL-6、TNF-α與血鈣、血磷、PTH的相關(guān)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表3。

3 討論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)成分的選擇及方法的優(yōu)化

現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪甲苷、大黃素和大黃酚具有良好的免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥因子表達(dá)、抑制腎組織纖維化、改善腎功能等作用[16-18];同時(shí)，三者作為黃芪、大黃的指標(biāo)成分，含量較高，性質(zhì)穩(wěn)定[9，11]，故結(jié)合JYP的制劑工藝，本研究選取君藥黃芪中的黃芪甲苷作為水提工藝路線的質(zhì)控指標(biāo)，使藥大黃中的大黃素和大黃酚作為粉碎入藥工藝路線的質(zhì)控指標(biāo)，建立其含量測(cè)定方法，以完善JYP的質(zhì)量控制體系。

本研究參照文獻(xiàn)[19]建立了黃芪甲苷的含量測(cè)定方法，發(fā)現(xiàn)若以氨水作為洗滌溶劑，制得的供試品溶液黏度較大，且色譜圖基線不平、峰面積波動(dòng)大、峰形及分離度較差，故將氨水更換為1%氫氧化鈉溶液，其余條件不變。結(jié)果，黃芪甲苷可達(dá)到較理想的分離效果，且峰形較好，色譜圖基線平穩(wěn)，黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率高，可用于樣品中黃芪甲苷含量的測(cè)定。

此外在研究過程中，筆者發(fā)現(xiàn)黃芪的另一有效活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷與酒蓯蓉中松果菊苷的極性相似，干擾較大，而變換流動(dòng)相、色譜柱、柱溫、流速、供試品制備方法均無(wú)法將兩者有效分離，故本研究暫未將毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為水提工藝路線的質(zhì)控指標(biāo)。

同時(shí)，筆者在建立粉碎入藥工藝路線指標(biāo)成分的含量測(cè)定方法時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于處方中有多數(shù)藥材均經(jīng)粉碎后入藥，導(dǎo)致測(cè)定大黃總蒽醌時(shí)雜質(zhì)較多，干擾嚴(yán)重，且除雜操作易導(dǎo)致總蒽醌成分損失，故本研究?jī)H選擇了大黃總蒽醌中含量相對(duì)較高且性質(zhì)較為穩(wěn)定的大黃素和大黃酚作為該工藝路線的質(zhì)控指標(biāo)。

方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本研究建立的兩種HPLC法簡(jiǎn)便、快速，可用于黃芪甲苷、大黃素、大黃酚的定量分析。在后續(xù)研究中，本課題組將進(jìn)一步優(yōu)化毛蕊異黃酮葡萄糖苷和總蒽醌的含量測(cè)定方法，以期進(jìn)一步完善JYP的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性藥物的選擇

經(jīng)臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，尿毒清顆粒是一種有效的中藥復(fù)方制劑，在我國(guó)臨床已有20多年的應(yīng)用歷史，對(duì)CRF具有良好的療效[20]，故本研究選擇尿毒清顆粒作為陽(yáng)性對(duì)照。本研究結(jié)果顯示，尿毒清顆?？娠@著降低CRF模型大鼠血清Scr、BUN含量，改善其腎功能，下調(diào)其血清PTH的含量，抑制炎癥因子TNF-α的表達(dá)，與已有文獻(xiàn)的結(jié)果[20]基本一致。

3.3 JYP對(duì)CRF模型大鼠相關(guān)指標(biāo)的影響

JYP是基于國(guó)醫(yī)大師鄧鐵濤教授“五臟相關(guān)學(xué)說(shuō)”理論[21]，并結(jié)合我院治療慢性腎衰竭20余年的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而得的有效復(fù)方制劑。該方重用黃芪益氣健脾升陽(yáng)運(yùn)樞為君藥;白術(shù)、山藥健脾補(bǔ)腎，以助腎臟氣化為臣藥;肉蓯蓉溫腎扶陽(yáng)、潤(rùn)腸通便，豆蔻溫中化濕行氣，共為佐藥;丹參活血祛瘀，大黃消癥散結(jié)、蕩滌腸胃、推陳致新，共為使藥，可開啟脾胃升降之樞，通腑瀉濁，清解血分之毒;炙甘草健脾并調(diào)和諸藥;諸藥合用，攻補(bǔ)兼施，共奏健脾益腎、活血化濁之功[5]。本研究初步探討了JYP對(duì)CRF模型大鼠Scr、BUN、鈣磷代謝以及炎癥因子等相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，造模后（給藥前），模型組和各給藥組大鼠血清Scr、BUN含量均較正常組顯著升高，提示大鼠腎功能受到損傷，模型復(fù)制成功。給藥后，模型組大鼠血清Scr、BUN含量均較正常組顯著升高，而各給藥組大鼠血清Scr和BUN含量均較模型組和同組給藥前顯著降低，提示JYP可降低CRF模型大鼠血清Scr、BUN含量，改善其腎功能。

本研究結(jié)果還顯示，與正常組比較，模型組大鼠血鈣含量顯著降低，IL-6、TNF-α含量均顯著升高，提示CRF可導(dǎo)致大鼠體內(nèi)鈣代謝紊亂、炎癥因子表達(dá)增加。與模型組比較，JYP中、高劑量組大鼠血鈣含量均顯著升高，尿毒清組大鼠血清PTH含量，JYP中、高劑量組PTH、IL-6含量以及各給藥組TNF-α含量均顯著降低，提示JYP可減輕大鼠體內(nèi)鈣代謝紊亂，并抑制炎癥因子的表達(dá)。但本研究并未發(fā)現(xiàn)JYP對(duì)大鼠血磷含量的影響，其具體機(jī)制有待后續(xù)研究予以探索。

由于CRF患者在疾病的不同階段中伴有不同的微炎癥癥狀[15]，故本研究進(jìn)一步考察了炎癥因子含量與鈣磷代謝相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，炎癥因子IL-6、TNF-α與鈣磷代謝相關(guān)指標(biāo)無(wú)顯著相關(guān)性，這與已有文獻(xiàn)的結(jié)果[22]基本一致。但值得注意的是，也有研究得出了不同的結(jié)論，如吳金慶[23]研究發(fā)現(xiàn)，CKD 4～5期患者血清鈣磷乘積與炎癥因子（IL-6、超敏C反應(yīng)蛋白）有關(guān)，而在CKD 1～3期患者中卻未發(fā)現(xiàn)類似相關(guān)性。由此可見，本研究結(jié)論尚有待進(jìn)一步確證。

綜上所述，本研究建立的HPLC法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可用于JYP中黃芪甲苷、大黃素、大黃酚的含量測(cè)定以及JYP的質(zhì)量控制;JYP可改善CRF模型大鼠的腎功能，緩解其鈣代謝紊亂，并抑制炎癥因子的表達(dá)。

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（收稿日期：2018-12-23 修回日期：2019-06-11）

（編輯：張?jiān)拢?/p>