光裸方格星蟲纖溶酶對急性血瘀模型大鼠血液流變性異常及血管內(nèi)皮損傷的改善作用研究

黃媛恒 黃曉亮 覃斐章 李福森 龐麗君 李映新

摘 要 目的：研究光裸方格星蟲纖溶酶（SNFE）對急性血瘀模型大鼠血液流變性異常及血管內(nèi)皮損傷的改善作用。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、阿司匹林組（100 mg/kg）和SNFE低、高劑量組（2 500、5 000 U/kg），每組10只，每天灌胃1次，連續(xù)給藥7 d，第6天給藥后1 h，除對照組外，其余各組大鼠均皮下注射鹽酸腎上腺素0.8 mg/kg，再以冰水浴復(fù)制急性血瘀模型。次日給藥后2 h腹主動(dòng)脈采血，使用全自動(dòng)血流變儀測定全血黏度（高、中、低切變率）、血漿黏度、紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)等血液流變學(xué)指標(biāo)，酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿中一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素1（ET-1）含量及其比值，蘇木精-伊紅（HE）染色觀察主動(dòng)脈血管內(nèi)皮的損傷程度。結(jié)果：與對照組比較，模型組大鼠的高、中、低切變率的全血黏度以及血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、ET-1含量均顯著升高，紅細(xì)胞變形指數(shù)、NO含量和NO/ET-1比值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，SNFE高劑量組大鼠的高、中、低切變率的全血黏度以及血漿黏度、紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、ET-1含量均顯著降低，紅細(xì)胞變形指數(shù)、NO含量和NO/ET-1比值均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;SNFE低劑量組大鼠僅紅細(xì)胞變形指數(shù)和NO/ET-1比值均顯著增加，ET-1含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。血管內(nèi)皮染色圖顯示，與對照組比較，模型組大鼠主動(dòng)脈各層結(jié)構(gòu)松散無序，內(nèi)膜缺損不完整，空泡增加，內(nèi)皮損傷明顯;各給藥組大鼠內(nèi)皮也均有不同程度損傷，但損傷程度均較模型組輕。結(jié)論：SNFE對急性血瘀模型大鼠的血液流變性異常和血管內(nèi)皮損傷均有改善作用。

關(guān)鍵詞 光裸方格星蟲纖溶酶;急性血瘀模型;血液流變性;血管內(nèi)皮;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effects of fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus （SNFE） on hemorheology disorder and vascular endothelium injury in naked acute blood stasis model rats. METHODS： SD rats were randomly divided into control group， model group， aspirin group （100 mg/kg） and SNFE high-dose and low-dose groups （2 500， 5 000? ? ?U/kg）， with 10 rats in each group. They were given relevant medicine intragastrically once a day， for consecutive 7 d. One hour after the 6th day of administration， except for control group， other groups were given adrenaline hydrochloride 0.8 mg/kg subcutaneously， and then the acute blood stasis model was induced by ice-water bath. Blood was collected from abdominal aorta 2 h after the next day. Blood rheological parameters such as whole blood viscosity （high， medium and low shear rate）， plasma viscosity， hematocrit， erythrocyte aggregation index and erythrocyte deformability index were measured by automatic rheometer. The contents of NO and ET-1 in plasma and their ratio were determined by ELISA， and the damaged degree of vascular endothelium were observed by HE staining. RESULTS： Compared with control group， whole blood viscosity of high， medium and low-shear rate， plasma viscosity， erythrocyte aggregation index and ET-1 content were increased significantly in model group， while erythrocyte deformability index， NO content and NO/ET-1 ratio were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， whole blood viscosity of high， medium and low-shear rate， plasma viscosity， hematocrit， erythrocyte aggregation index and ET-1 content were decreased significantly in SNFE high-dose groups. Erythrocyte deformability index， NO content and NO/ET-1 ratio were increased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. In SNFE low-dose group， erythrocyte deformability index and NO/ET-1 ratio were increased significantly， while ET-1 content was decreased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. Vascular endothelial staining showed that compared with control group， the structure of aorta layers in model group was loose and disordered， the endothelial defect was incomplete， the vacuoles increased， and the endothelial damage was obvious. The endothelium of rats in each administration group was damaged to varying degrees， but the degree of injury was lighter than in model group. CONCLUSIONS： SNFE can improve hemorheological abnormalities and vascular endothelial injury in rats with acute blood stasis.

KEYWORDS? ?Naked fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus; Acute blood stasis model; Hemorheology; Vascular endothelium; Rats

光裸方格星蟲（Sipunculus nudus）俗稱“沙蟲”，為星蟲門科海洋無脊椎軟體動(dòng)物，分布于無污染的淺海或潮間帶的泥沙中，在我國以廣西北部灣產(chǎn)量最大，質(zhì)量最優(yōu)。方格星蟲性平，味甘、咸，肉質(zhì)鮮美脆嫩，營養(yǎng)豐富，是食補(bǔ)中的佳品[1]。據(jù)報(bào)道，方格星蟲蟲體含有多糖、氨基酸、脂肪酸等多種成分，有延緩衰老、抗疲勞、提高免疫力、抗輻射、抗病毒、護(hù)肝、提高記憶力等作用[2-3]。本課題組前期從方格星蟲的內(nèi)臟中提取出一種纖維蛋白溶解酶——方格星蟲纖溶酶（SNFE），其為絲氨酸蛋白酶，具有良好的溶栓和抗凝血活性，且該纖溶酶無溶血作用和致出血活性，其作為一種潛在的抗血栓藥物，表現(xiàn)出良好的開發(fā)前景[4-6]。

血瘀證是由機(jī)體內(nèi)氣機(jī)逆亂、氣血運(yùn)行不暢所致的瘀積凝滯，或離開經(jīng)脈的血液無法及時(shí)消散以致停留一處所致的多種病癥的總稱，臨床表現(xiàn)為瘀血內(nèi)阻所引起疼痛、腫塊、舌紫、脈澀、出血等各種癥候，為中醫(yī)常見病癥[7]。血瘀證主要特點(diǎn)為血流不暢，《實(shí)用血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)》[8]中也以血液流變、凝血、纖溶、微循環(huán)檢測提示血液瘀滯作為血瘀證診斷的一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。研究表明，血瘀證涉及多個(gè)復(fù)雜的病理生理變化，不僅與血液流變改變有關(guān)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血脂代謝異常也有著密切的聯(lián)系[9-11]。本研究通過大鼠皮下注射大劑量腎上腺素加冰水浴刺激引起“暴怒”和“寒邪”，造成急性血瘀模型，研究SNFE對該模型血液流變異常及血管內(nèi)皮損傷的影響，并測定血漿中舒血管因子——一氧化氮（NO）及縮血管因子——內(nèi)皮素1（ET-1）的含量，初步探討SNFE活血化瘀及抗血栓的機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

SA9000 全自動(dòng)血流變儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）;TGL-16A冷凍離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）;Spectramax Plus384連續(xù)波長酶標(biāo)儀（美國MD公司）;BHS光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

SNFE（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，批號(hào)：20180916，經(jīng)纖維蛋白平板法測定活性為50 U/mg）;阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：BJ27607，規(guī)格：0.1 g）;鹽酸腎上腺素注射液（廣州明興制藥廠，批號(hào)：161201，規(guī)格：1 mL ∶ 1 mg）;伊紅染液（韓國Biosharp公司，批號(hào)：XH184601）;蘇木精染液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：329D0312）;NO、ET-1酶聯(lián)免疫試劑盒（美國R&D Systems 公司，批號(hào)：335566、221475）;水合氯醛為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，♀（有研究表明♀大鼠的血流變指標(biāo)變化較♂大鼠更為明顯[12]），體質(zhì)量為（200±20） g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2014-0003。本實(shí)驗(yàn)操作符合廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)章規(guī)定。

2 方法

2.1 血瘀模型建立

將SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、阿司匹林組和SNFE高、低劑量組，每組10只。SNFE高、低劑量組大鼠分別給予5 000、2 500 U/kg的SNFE（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劑量為2 500 U/kg時(shí)血瘀模型大鼠的血流變指數(shù)發(fā)生改變，因此以該劑量為SNFE的低劑量，高劑量為低劑量的2倍）;阿司匹林組大鼠給予100 mg/kg的阿司匹林[12-13]，對照組和模型組大鼠均給予生理鹽水，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d，第6天藥后1 h，除對照組外，其余各組大鼠皮下注射0.8 mg/kg的鹽酸腎上腺素，2 h后將大鼠放入冰水中游泳5 min，取出大鼠擦干皮毛，2 h后再次皮下注射0.8 mg/kg的鹽酸腎上腺素，建立血瘀模型[12-13]。

2.2 血液流變學(xué)指標(biāo)測定

造模次日末次給藥后2 h，用10%水合氯醛（3? ? ?mL/kg）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，采用肝素抗凝采血管采血5 mL，使用全自動(dòng)血流變儀測定各組大鼠的全血黏度（高、中、低切變率：200/s、50/s、1/s）、血漿黏度、紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞聚集指數(shù)以及紅細(xì)胞變形指數(shù)。

2.3 血漿中NO和ET-1的含量測定

肝素抗凝管采血完畢后，換乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管繼續(xù)采血約2 mL，以3 000 r/min離心15 min，取血漿至EP管放置，-80 ℃冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定各組大鼠血漿中NO和ET-1的含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用酶標(biāo)儀測定吸光度，數(shù)據(jù)處理采用ELISACalc軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并擬合曲線，計(jì)算含量。

2.4 主動(dòng)脈血管病理形態(tài)學(xué)觀察

采血完畢后，處死大鼠，分離并摘取心臟主動(dòng)脈，用生理鹽水漂洗后保存于10%中性福爾馬林，常規(guī)石蠟包埋、制作切片并進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察血管內(nèi)膜及主動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)的完整程度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s表示 ，組間比較采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血液流變學(xué)指標(biāo)變化

與對照組比較，模型組大鼠的高、中、低切變率的全血黏度以及血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均顯著升高，紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），提示造模成功。與模型組比較，SNFE高劑量組大鼠的高、中、低切變率的全血黏度以及血漿黏度、紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均顯著降低，紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;SNFE低劑量組大鼠的血漿黏度顯著降低，紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;阿司匹林組大鼠的高、低切變率的全血黏度以及血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞變形指數(shù)均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），其余指標(biāo)無明顯變化（P>0.05）。各組大鼠全血黏度的測定結(jié)果見表1，血漿黏度、紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞聚集指數(shù)及紅細(xì)胞變形指數(shù)的測定結(jié)果見表2。

3.2 血漿中NO和ET-1含量變化

與對照組比較，模型組大鼠血漿中NO 含量和NO/ET-1比值顯著降低，ET-1含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，SNFE高劑量組大鼠血漿中NO 含量和NO/ET-1比值顯著升高，ET-1含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;SNFE低劑量組和阿司匹林組大鼠血漿中ET-1含量顯著降低，NO/ET-1值顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組大鼠血漿中NO、ET-1含量的測定結(jié)果見表3。

3.3 血管內(nèi)皮形態(tài)變化

對照組大鼠主動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)緊湊，內(nèi)膜光滑完整。模型組大鼠主動(dòng)脈各層結(jié)構(gòu)松散無序，內(nèi)膜缺損不完整，空泡增加，內(nèi)皮損傷明顯。SNFE高、低劑量組大鼠內(nèi)皮結(jié)構(gòu)基本完整，但主動(dòng)脈壁各層結(jié)構(gòu)變松散及出現(xiàn)空泡，其中低劑量組松散程度及內(nèi)膜、血管壁層損傷更嚴(yán)重，但均較模型組輕。阿司匹林組大鼠血管內(nèi)膜及結(jié)構(gòu)完整，空泡少，損傷程度小。各組大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮的染色圖見圖1。

4 討論

血液流動(dòng)狀態(tài)改變、血液性質(zhì)改變以及血管內(nèi)皮損傷是血栓形成的三個(gè)重要誘因[14]，血液黏滯性增加、血液濃稠、流動(dòng)性變差引起血流緩慢、停滯或者渦旋的形成，激活凝血因子，最終導(dǎo)致血栓性疾病的發(fā)生。血瘀證是一種血液運(yùn)行不暢、停滯瘀積所引起的疾病，其血液具備濃、凝、黏、聚，即血栓性血液的突出特點(diǎn)，可引起微循環(huán)障礙以及血栓形成。實(shí)際上，血栓性疾病就屬于中醫(yī)學(xué)血證中的“瘀血證”，研究表明，許多活血化瘀藥具有抗血栓作用[15]。

在血瘀證的診斷依據(jù)中，血液流變學(xué)檢查是實(shí)驗(yàn)室診斷最常用也是最為成熟的方法，其考察血液成分的流動(dòng)性及變形能力，可以反映影響血流的各種因素通過不同途徑產(chǎn)生的同一效應(yīng)，即血液流動(dòng)性、黏滯性、變形性及凝固性的改變[15]，也常作為檢測血瘀模型動(dòng)物建模成功與否的重要指標(biāo)。

目前，血瘀證動(dòng)物模型復(fù)制方法主要根據(jù)寒邪、郁怒、氣虛、外傷等血瘀的病因病機(jī)，其中郁怒和寒邪被認(rèn)為是急性血瘀形成的主要病因。通過大劑量注射腎上腺素加冰水浴刺激引起“暴怒”和“寒邪”是制備大鼠急性血瘀模型常用的方法[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠全血黏度及血漿黏度升高反映血液的黏滯性（黏）增大，致使血液的流動(dòng)性變差;紅細(xì)胞聚集指數(shù)增加（聚），致使血栓栓塞及中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)增加;紅細(xì)胞比容是反映血液濃稠度的指標(biāo)，其值越大則血液越“濃”;紅細(xì)胞變形指數(shù)是決定高切率下全血黏度的關(guān)鍵因素，紅細(xì)胞變形指數(shù)降低，高切變率全血黏度增高。與對照組比較，模型組大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)改變表明了其血液變黏、稠、聚，流動(dòng)性變差，提示急性血瘀造模成功。SNFE可以逆轉(zhuǎn)模型大鼠上述血液流變學(xué)指標(biāo)的改變，尤其以高劑量最為明顯，說明SNFE有糾正血液高黏滯狀態(tài)、改善微循環(huán)的作用。

有研究表明，血管內(nèi)皮損傷與血瘀證及血栓的發(fā)生、發(fā)展及發(fā)病機(jī)制有關(guān)[9-10，16]。血管內(nèi)皮能分泌多種血管活性物質(zhì)，在正常生理?xiàng)l件下，這些血管活性物質(zhì)之間存在動(dòng)態(tài)平衡，維持正常血管內(nèi)皮功能，當(dāng)血管內(nèi)皮損傷、功能紊亂，可造成 NO/ET-1、前列環(huán)素/血栓素A2、組織纖溶酶原激活劑/組織纖溶酶原激活劑抑制物失衡，導(dǎo)致血管壁炎癥反應(yīng)，血液成分及血液流變學(xué)指標(biāo)的改變[17]。其中，NO是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放的最重要的舒血管因子，可擴(kuò)散至血管壁平滑肌細(xì)胞激活鳥氨酸環(huán)化酶，介導(dǎo)環(huán)磷酸烏苷（cGMP）調(diào)控的血管舒張，此外，還具有抑制血小板聚集、抑制單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞、抑制平滑肌細(xì)胞增殖等作用[18]。ET是迄今為止已知的最強(qiáng)縮血管活性物質(zhì)，主要通過激活鈣通道、增加鈣內(nèi)流介導(dǎo)血管平滑肌收縮，缺血、缺氧、血栓素等刺激可以增加ET-1的合成和釋放，發(fā)揮促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和血栓形成的作用[19]。血瘀證研究表明[20]，NO降低和ET-1升高可能是血瘀證的病理基礎(chǔ)之一。因此，通過對主動(dòng)脈血管進(jìn)行HE染色及測定血漿中NO、ET-1含量觀察血管內(nèi)皮功能可以初步探討SNFE活血化瘀的作用機(jī)制。HE染色結(jié)果表明，模型組大鼠主動(dòng)脈各層結(jié)構(gòu)松散無序，尤其是血管內(nèi)膜缺損不完整，損傷較重;與模型組比較，SNFE高、低劑量組大鼠血管內(nèi)膜損傷程度有所減輕。血漿中NO和ET-1的含量測定結(jié)果表明，SNFE高、低劑量組大鼠血漿中ET-1含量以及NO/ET-1比值均明顯高于模型組，提示SNFE可能通過維持NO和ET-1的合成分泌平衡，保護(hù)血管內(nèi)皮，改善急性血瘀癥血液流變性，發(fā)揮活血化瘀的作用。

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（收稿日期：2019-06-13 修回日期：2019-08-05）

（編輯：鄒麗娟）