地衣芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯中生長條件優(yōu)化

丁康寧 張夢潔 張艾伽 張旭

摘要：地衣芽孢桿菌有調(diào)節(jié)動物腸道內(nèi)微生態(tài)平衡、增強機體的抵抗力、保護動物健康等重要的作用。試驗研究了NaC1質(zhì)量分數(shù)、pH值和溫度對營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中地衣芽孢桿菌生長狀態(tài)的影響。結(jié)果表明：地衣芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯中的最佳生長條件為，NaC1質(zhì)量分數(shù)范圍為1%，pH值為8.0，最適生長溫度為37℃。

關(guān)鍵詞：地衣芽孢桿菌;營養(yǎng)肉湯;生長條件

中圖分類號：TQ464 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.006

0 引言

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種常見的革蘭氏陽性菌。該菌能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，包括多糖、蛋白質(zhì)、非肽類物質(zhì)等，它們能促進飼料中營養(yǎng)素降解，提高飼料利用率[1]。此外地衣芽孢桿菌還能產(chǎn)生多種活性酶，這些酶可以促使細胞營養(yǎng)物質(zhì)的釋放，消除飼料中的抗營養(yǎng)物質(zhì)[2]。在不良環(huán)境中，地衣芽孢桿菌可以形成芽孢，經(jīng)受顆粒飼料加工和儲存中一系列惡劣環(huán)境。因此，地衣芽孢桿菌被我國農(nóng)業(yè)部2003年318號公告《飼料添加劑品種目錄》批準使用為飼料級菌株[3]。

試驗研究了地衣芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中不同溫度、不同NaC1質(zhì)量分數(shù)以及不同pH值條件下的生長特性，探索地衣芽孢桿菌的最優(yōu)生長條件，可以為更好的篩選地衣芽孢桿菌益生菌，研發(fā)益生菌制劑提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基為杭州百思生物科技有限公司產(chǎn)品。蛋白胨、牛肉浸膏、NaC1、HC1、NaOH、瓊脂等為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗菌株

地衣芽孢桿菌菌種為本實驗室保存，分離于60日齡櫻桃谷鴨的小腸。

2 方法

2.1 制備種子液

從保存菌種的斜面培養(yǎng)基上挑取菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。挑取扁平、邊緣整齊、表面光滑、粘稠，呈乳白色的菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。取該培養(yǎng)物，用無菌的生理鹽水將其稀釋至10～10cfu/mL，即為種子液。

2.2 平板菌落計數(shù)

在無菌操作下，將地衣芽孢桿菌待測樣品10倍梯度稀釋，吸取0.2mL不同稀釋梯度的培養(yǎng)液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，每個梯度做2個平行，然后放置于培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。48h后記錄每個平板中菌落數(shù)量，并且計算出菌落總數(shù)。

2.3 溫度對地衣芽孢桿菌生長的影響

取7支相同規(guī)格試管，每支試管加入9.8mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，121℃滅菌15min。待冷卻后每支試管接種0.2mL種子液，分別置于10、15、20、25、30、37、45℃搖床中，180r/min振蕩培養(yǎng)12h。每支試管各取1mL培養(yǎng)液，梯度稀釋后進行平板菌落計數(shù)。

2.4 NaC1質(zhì)量分數(shù)對地衣芽袍桿菌生長的影響

配制NaC1質(zhì)量分數(shù)分別為0.5%、1%、3%、5%、7%、9%、12%的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。取7支相同規(guī)格試管，每個質(zhì)量分數(shù)的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分別取9.8mL裝于試管，121℃滅菌15min。待冷卻后每支試管接種0.2mL種子液，置于37℃搖床中，180r/min蕩培養(yǎng)24h。每支試管各取1mL培養(yǎng)液，梯度稀釋后進行平板菌落計數(shù)。

2.5 pH值對地衣芽袍桿菌生長的影響

配制營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，用1mol/L的HC1和1mol/L的NaOH將pH值分別調(diào)整為2、4、5、7、8、9、11。取7支相同規(guī)格試管，每個pH值營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分別取9.8mL裝于試管，121℃滅菌15min。待冷卻后每支試管接種0.2mL種子液，置于37℃搖床中，180r/min振蕩培養(yǎng)24h。每支試管各取1mL培養(yǎng)液，梯度稀釋后進行平板菌落計數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 溫度對地衣芽孢桿菌生長的影響

從10～37℃，地衣芽孢桿菌的生長狀態(tài)呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，而當(dāng)37～45℃時，地衣芽孢桿菌的生長狀態(tài)呈現(xiàn)下降趨勢，見圖1。其中在10～25℃范圍內(nèi)生長較為緩慢，在25～30℃范圍中生長良好，最優(yōu)生長溫度為30～37℃;而當(dāng)溫度到達45℃左右，地衣芽孢桿菌的生長狀態(tài)幾乎停止。由此可知，地衣芽孢桿菌的最適生長溫度為37℃，見表1。

3.2 NaCI質(zhì)量分數(shù)對地衣芽孢桿菌生長的影響

地衣芽孢桿菌的生長狀態(tài)隨著NaC1質(zhì)量分數(shù)的增高而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，見圖2。NaC1質(zhì)量分數(shù)在0.5%～3%間生長較為良好，在3%～7%，地衣芽孢桿菌的生長一般，在7%～12%生長狀態(tài)不良。由此可知，地衣芽孢桿菌最適NaC1質(zhì)量分數(shù)為1%，見表2。

3.3 pH值對地衣芽孢桿菌生長的影響

APH值2.0～8.0范圍內(nèi)，地衣芽孢桿菌的生長隨著pH值的增大而呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢;而在PF3值為8.0～11.0范圍內(nèi)，其生長狀態(tài)開始下降。其中在pH值為2.0～3.0，地衣芽孢桿菌基本不生長，pH值為4.0～5.0時生長逐漸開始增快，pH值在5.0～9.0范圍內(nèi)生長狀態(tài)較好，pH為8.0時達到最大值。pH值大于9.0以后生長受到抑制，至pH值11.0時幾乎停止生長。由此可知，地衣芽孢桿菌最適生長pH值為8.0。見圖3、表3。

4 討論

隨著人們生活水平的提高和對健康的重視，益生菌作為綠色飼料添加劑越來越受到人們的青睞，益生菌的開發(fā)和應(yīng)用必將對我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起到積極作用[4]。地衣芽孢桿菌是一種安全、有效、抗逆性強、營養(yǎng)要求低的一種益生菌。試驗討論了營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中不同的溫度、NaC1質(zhì)量分數(shù)、不同pH值條件對地衣芽孢桿菌生長狀況的影響，便于我們對益生菌制劑的研發(fā)。

5 結(jié)論

隨著溫度的上升，地衣芽孢桿菌的生長狀態(tài)不斷上升，超過37℃后，地衣芽孢桿菌的生長狀態(tài)呈現(xiàn)下降趨勢。而當(dāng)溫度到達45℃左右，生長狀態(tài)幾乎停止。由此可知，地衣芽孢桿菌對溫度的耐受性較高。隨著NaC1質(zhì)量分數(shù)增加，地衣芽孢桿菌的生長狀態(tài)呈現(xiàn)下降趨勢。NaC1質(zhì)量分數(shù)在0一3%范圍內(nèi)生長最好，超過10%后，生長狀態(tài)幾乎停止。由此可知，地衣芽孢桿菌對NaC1的耐受性較高。隨著pH值的上升，地衣芽孢桿菌的生長狀態(tài)不斷上升。pH值超過8.0后，地衣芽孢桿菌的生長狀態(tài)呈現(xiàn)下降趨勢。最適pH值的范圍為5.0～9.0，而當(dāng)pH值大于11，生長狀態(tài)幾乎停止。地衣芽孢桿菌對酸堿的耐受性較高。由此可見，地衣芽孢桿菌對培養(yǎng)基要求不高，易于培養(yǎng)，這與劉巖[5]等的研究結(jié)果一致。

參考文獻

[1]楊陽，張付云，蒼桂璐，等.地衣芽胞桿菌生物活性物質(zhì)應(yīng)用研究進展[J].生物技術(shù)進展，2013，3（1）：22-26.

[2]曹煜成，李卓佳，馮娟，等.地衣芽孢桿菌胞外產(chǎn)物消化活性的研究[J].熱帶海洋學(xué)報，2005（6）：6-12.

[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告.[J].湖南飼料，2006（5）：5-6.

[4]廖智慧，陳志軍，趙曉靜，等.復(fù)合益生菌制劑應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版），2019（2）：26-27.

[5]劉巖，儀淑敏，勵建榮，等.地衣芽孢桿菌在營養(yǎng)肉湯中生長模型的建立[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2014，33（10）：1025-1030.

基金項目：大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃201713573059X;動物藥品創(chuàng)新與制備“創(chuàng)客”虛擬班（項目編號：2017ck008）

作者簡介：丁康寧（1997-），女，本科生在讀，研究方向：動物益生菌。

通信作者：張旭（1984-），男，河南商城人，實驗師，研究方向：動物微生物和益生菌飼料添加劑。