牛結(jié)核γ-干擾素ELISPOT檢測方法建立

摘要：研究通過制備牛外周血單核細胞，并對檢測技術(shù)各因素優(yōu)化和準確性進行驗證，建立了牛結(jié)核γ-干擾素ELISPOT檢測方法，同時形成該平臺相應(yīng)的操作規(guī)范。結(jié)果表明，在細胞數(shù)量為1.25×10個，牛單核細胞培養(yǎng)時間24h，植物血凝素的濃度為200μg/mL的條件下，該牛結(jié)核γ-干擾素ELISPOT檢測體系較為穩(wěn)定，為后續(xù)研究者基于ELISPOT技術(shù)建立更多穩(wěn)定的檢測體系提供了重要理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：ELISPOT;牛結(jié)核病&γ干擾素

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.18.004

0 引言

牛結(jié)核病是一種人畜共患病，它主要是由于結(jié)核分枝桿菌或者牛分枝桿菌引起的，此疾病對公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生了嚴重的危害，同時也阻礙畜牧業(yè)的生產(chǎn)和發(fā)展，目前牛結(jié)核病已經(jīng)被國家列為二類動物疫病。此疾病的傳染源包括帶菌人體和病畜，對于人畜的危害方式主要是通過呼吸道和消化道的感染，細菌進入健康人畜身體后即可發(fā)生感染現(xiàn)象，成年牛通常是因為與病牛、病人的直接接觸感染此病，犢牛較多是因為食用病牛奶感染。

1 ELISPOT技術(shù)介紹

免疫學檢測手段具有較好的前景，其中結(jié)核菌素皮膚試驗（tuberculin skin test，TST）是20世紀快速檢測活動性以及潛伏性結(jié)核感染（latent tuberculosis infection，LTBI）的唯一手段[14]。TST應(yīng)用很廣泛，它出現(xiàn)至今已有100多年，其特異性較差和敏感性較高，因此檢測結(jié)果具有高假陽性率。

近年隨著γ-干擾素釋放試驗（interferon gamma releaseassay，IGRA）的出現(xiàn)和不斷發(fā)展，逐漸已被運用在結(jié)核病的診斷，該試驗涉及到了酶聯(lián)免疫斑點試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT），此方法有良好檢測特性，是結(jié)核病診斷的一種新手段。ELISPOT是一種細胞免疫學檢測方法，它是在單細胞水平上，基于高通量檢測機體分泌的抗體或細胞因子，進而得到檢測的結(jié)果，它是屬于ELISA檢測技術(shù)的一種延伸。利用特定酶的顯色反應(yīng)，通過抗體分泌的固定細胞因子，使對應(yīng)位點產(chǎn)生清晰斑點，進而通過顯微鏡觀察，利用人工計數(shù)斑點或著ELISPOT分析儀對結(jié)果進行計數(shù)。

2 材料與方法

2.1 試驗動物

進行牛外周血單個核細胞分離制備的健康奶牛選擇于上海奶牛研究所實驗?zāi)翀觥?/p>

進行牛結(jié)核病檢測的32頭試驗用奶牛血取自上海地區(qū)某奶牛場。

2.2 牛外周血單核細胞制備

無菌采取5mL健康奶牛尾靜脈血加入含肝素鈉的采血管，在采集血液后顛倒混勻得到抗凝血。將2mL抗凝血與滅菌PBS1：1稀釋后，再將4mL稀釋牛血緩緩加入含3mL牛淋巴細胞分離液的無菌離心管中，形成明顯界面，在室溫下400g離心20min，可見外周血單個核細胞存在于云霧狀層中，用滅菌滴管吸取淋巴細胞層至干凈的離心管中，加入滅菌PBS，將細胞混勻后，于室溫200g離心10min，重復(fù)2次。棄去上清培養(yǎng)液，加入完全1640培養(yǎng)基重懸沉淀細胞，取10μL細胞懸液加入細胞計數(shù)儀下進行計數(shù)。

2.3 牛結(jié)核γ-擾素ELISPOT檢測方法建立

2.3.1 ELISPOT操作步驟的確定

使用包被液稀釋的捕獲抗體MT17.1加入96孔濾膜板，100μL/孔，4℃無菌過夜包被;棄包被液，使用含有滅菌PBS洗板4次;加入含10%胎牛血清的完全1640培養(yǎng)基，200μL/孔，室溫孵育封閉30min;棄封閉液，使用PBS洗板1次，將96孔濾膜板直接用于檢測或置4℃保存。在上述包被的96孔濾膜板中加入50μL刺激原，并設(shè)立對照組，然后每孔加入50μL牛外周血淋巴細胞懸液，將96孔濾膜板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～48h;將96孔濾膜板取出，棄培養(yǎng)上清，使用PBS洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入用0.5%胎牛血清的PBS稀釋的牛γ干擾素檢測抗體MT307-biotin，100μL/孔，置于室溫孵育2h;用PBS洗板5次，洗板后甩干，加入1：1000稀釋的親和素-辣根過氧化物酶結(jié)合物，100μL/孔，置于37℃孵育1h;每孔加入100μL底物液TMB，放置于室溫避光顯色。在96孔濾膜板中加入純凈水終止反應(yīng)，去除液體，室溫下晾干;將96孔濾膜板放入ELISPOT儀中，對實驗結(jié)果進行掃描計數(shù)和分析。

2.3.2 ELISPOT方法的判定標準的建立

本研究中中牛結(jié)核γ干擾素曰，ISP07方法的判定標準：若牛型PPD刺激孔中斑點數(shù)減去PBS對照孔中的斑點數(shù)以及牛型PPD刺激孔中斑點數(shù)減去禽型PPD刺激孔中斑點數(shù)都大于或等于6個，則可以判定為陽性;若牛型PPD刺激孔中斑點數(shù)減去PBS對照孔中的斑點數(shù)或牛型PPD刺激孔中斑點數(shù)減去禽型PPD刺激孔中斑點數(shù)小于6個，則可以判定為陰性。

2.3.3 最佳細胞數(shù)量的確定

將細胞數(shù)用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，每孔加入100μL，含細胞數(shù)量分別為1.25×10/孔、2.5×10/孔、1.25×10孔，將96孔濾膜板置于37℃、5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h。其他步驟均按照2.3.1中操作程序。

2.3.4 牛單核細胞培養(yǎng)時間優(yōu)化

將3塊培養(yǎng)板放在37℃、5% CO培養(yǎng)箱中，反應(yīng)時間分別為12、24，48h，試驗操作步驟參照2.3.1進行。

2.3.5 植物血凝素濃度優(yōu)化

將植物血凝素的濃度分別用無菌PBS液稀釋至200、20、2μg/mL，試驗操作步驟參照2.3.1進行。

2.4 ELISPOT和ELISA技術(shù)同步檢測牛結(jié)核病無菌采集32份奶牛尾靜脈血，將抗凝血加入到24孔細胞培養(yǎng)板，每頭?？鼓盅b3孔，1.5mL/孔，各孔分別加入相應(yīng)的刺激原100μL（PBS、Avian PPD、Bovine PPD），充分混勻，CO培養(yǎng)箱中孵育24h，吸取200μL上層血漿作為待檢樣品用于牛結(jié)核外周血IFN-γ釋放試驗的檢測，參照BOVIGAMTM Mycobacterium bovisGammaInterferon Test Kit for cattle說明書進行。

在96孔濾膜板中分別加入2.5μg/mL的捕獲牛γ干擾素抗體MT17.1，100μL/孔，4℃過夜包被。棄包被液，進行洗滌和封閉后備用。對上述奶牛場30頭奶牛分別無菌采取3mL尾靜脈血加入含肝素鈉的抗凝管，進行牛外周血單個核細胞的制備和計數(shù)。在上述包被的96孔濾膜板中分別加入50μL培養(yǎng)液至每個對照孔、50μL10μg/mL的禽型PPD、50μL10μg/mL的牛型PPD至每個檢測孔。分別加入50μL每頭牛的外周血單個核細胞懸液至培養(yǎng)液對照孔、禽型PPD和牛型PPD檢測孔，將96孔濾膜板置于37℃、5% COz培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h;將96孔濾膜板取出，棄培養(yǎng)上清，使用PBS洗板5次，5min/次，洗板后甩干。加入用0.5%胎牛血清的PBS稀釋的牛γ-干擾素檢測抗體MT307-biotin（0.25μg/mL），100μL/孔，置于室溫孵育2h;用PBS洗板5次，洗板后甩干，加入1：1000稀釋的親和素-辣根過氧化物酶結(jié)合物，100μL/孔 ，置于37℃孵育1h;每孔加入100μL底物液TMB，放置于室溫避光顯色。在96孔濾膜板中加入純凈水終止反應(yīng)，去除液體，室溫下晾干;將96孔濾膜板放入ELISPOT儀中，對實驗結(jié)果進行掃描計數(shù)和分析。

3 結(jié)果

3.1 最佳細胞數(shù)量確定結(jié)果

將細胞數(shù)用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，每孔加入50μL培養(yǎng)基與50μL牛外周血單個核細胞懸液[1]，含細胞數(shù)量分別為1.25×10/孔、2.5×10/孔、1.25×10孔。將96孔濾膜板置于37℃、5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h。其他步驟均按照2.3.1中操作程序。結(jié)果所得斑點數(shù)分別為69、116、142，見圖1、表1，隨著細胞數(shù)量增加斑點數(shù)也明顯增多。1.25×10孔形成的斑點數(shù)目過多，背景連片無法區(qū)分特異性與非特異性斑點，故選用1.25×10孔的細胞數(shù)量。見表1。

3.2 牛單核細胞培養(yǎng)時間優(yōu)化結(jié)果

將3塊培養(yǎng)板放在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，反應(yīng)時間分別為12、24、48h，試驗操作步驟參照2.3.1進行。結(jié)果分別為112、175、232，見圖2、表2，結(jié)果孵育24h效果最佳，斑點清晰，形態(tài)良好[2]。

3.3 植物血凝素濃度優(yōu)化結(jié)果

將植物血凝素的濃度分別用無菌PBS液稀釋至200、20、2μg/mL，試驗操作步驟參照2.3.1進行。結(jié)果分別為270、54、24，見表3，選用200μg/mL作為試驗最佳濃度。

3.4 ELISPOT和ELISA技術(shù)同步檢測牛結(jié)核病結(jié)果

ELISPOT方法與BOVIGAMTM ELISA試劑盒同步檢測牛結(jié)核病，并對所得到結(jié)果進行比較如下。

4 討論

酶聯(lián)免疫斑點檢測技術(shù)是近年發(fā)展起來，它是一種基于檢測細胞因子的免疫學方法。ELISPOT方法是將ELISA技術(shù)與細胞培養(yǎng)結(jié)合，而構(gòu)建的一種新型檢測技術(shù)，它是在單細胞培養(yǎng)水平上，體外檢測特異性抗體分泌細胞。此項技術(shù)可以對細胞因子分泌量進行快速和便捷的定量，目前在免疫學抗原特異性T細胞領(lǐng)域的研究中，已成為國際公認的一項主流免疫學檢測技術(shù)。同時，ELISPOT檢測技術(shù)也會在動物研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，具有廣泛的應(yīng)用前景[3]。但該技術(shù)還未形成標準化程序，對細胞數(shù)量、濃度和培養(yǎng)時間等條件的優(yōu)化還未構(gòu)成完整的體系。因此，在檢測研究實踐中，通過對檢測技術(shù)各因素優(yōu)化和準確性進行驗證，并總結(jié)操作過程的注意事項，為后續(xù)研究者建立穩(wěn)定的ELISPOT檢測體系提供一定的理論依據(jù)。

5 結(jié)論

本研究通過制備牛外周血單核細胞，進一步優(yōu)化最佳細胞數(shù)量、牛單核細胞培養(yǎng)時間和植物血凝素的濃度，從而建立了牛結(jié)核γ-干擾素ELISPOT檢測體系。運用ELISPOT技術(shù)和ELISA試劑盒對此檢測體系進行評價，并形成了該檢測平臺相應(yīng)的操作規(guī)范（SOP）。結(jié)果顯示，當細胞數(shù)量為1.25×10，牛單核細胞培養(yǎng)時間24h，植物血凝素的濃度為200μg/mL的條件下，該ELISPOT檢測體系較為穩(wěn)定，這為后續(xù)研究者進行牛結(jié)核疾病的檢測奠定了科學的理淪基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]萬康林.中國結(jié)核病流行新特點及挑戰(zhàn)[J].疾病監(jiān)測.2008，23（I1）：667-670.

[2]潘福寶，袁曉娟.牛結(jié)核病的研究概況[J].今日畜牧獸醫(yī)，2019，35（4）：74.

[3]李正波.牛結(jié)核病的診斷與防治[J].農(nóng)村百事通，2018（21）：29-30.

作者簡介：楊顯超（1985-），男，漢族，江西九江人，獸醫(yī)師，研究方向：動物疫病防控與獸醫(yī)流行病學。