柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的電磁裂解水提取工藝優(yōu)化

王仁廣 楊凈堯 張欣舒 邱智東 陳新 賈艾玲

摘 要 目的：建立同時(shí)測定柴胡水提液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d含量的方法，并優(yōu)化其電磁裂解水提取工藝。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為SB-C18，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量為10 μL。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、物料粒度、料液比為考察因素，柴胡皂苷a與柴胡皂苷d的總提取率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并與超聲法和煎煮法進(jìn)行比較。結(jié)果：柴胡皂苷a、柴胡皂苷d檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為50.70～202.80 μg/mL（r=0.999 9）、50.50～202.00 μg/mL（r=0.999 9）;定量限分別為0.16、0.13 μg/mL，檢測限分別為0.05、0.04 μg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD均小于2%;加樣回收率分別為98.23%～102.47%（RSD=1.80%，n=6）、98.84%～102.06%（RSD=1.60%，n=6）。最優(yōu)提取工藝為以水提取1次，提取時(shí)間2.50 min、藥材過80目篩、料液比1 ∶ 28（g/mL）。3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，最優(yōu)工藝所得柴胡皂苷a與柴胡皂苷d的平均總提取率為8.42 mg/g，高于超聲法（8.34 mg/g）和煎煮法（8.06 mg/g），且提取時(shí)間更短。結(jié)論：所建含量測定方法簡便、準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測定柴胡水提液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量;優(yōu)化所得電磁裂解水提取的工藝穩(wěn)定、可行。

關(guān)鍵詞 柴胡;柴胡皂苷a;柴胡皂苷d;高效液相色譜法;Box-Behnken響應(yīng)面法;水提取工藝;含量測定;電磁裂解

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of saikosaponin a and saikosaponin d in Bupleurum chinense water extract， and to optimize its water extraction technology for electromagnetic cracking. METHODS： HPLC method was used. The determination was performed on SB-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 40 ℃. The detection wavelength was set at 210 nm， and? the sample size was 10 μL. Based on single factor experiment， using extraction time， particle size， solide-liquid ratio as factors， total extraction rate of saikosaponin a to saikosaponin d as indexes， the extraction technology was optimized by using Box-Behnken response surface methdology， and compared with the results of ultrasound method and decoction method. RESULTS： The linear range of saikosaponin a and saikosaponin d were 50.70-202.80 μg/mL （r=0.999 9） and 50.50-202.00 μg/mL （r=0.999 9）， respectively. The quantitation limits were 0.16 and 0.13 μg/mL， respectively. The detection limits were 0.05 and 0.04 μg/mL，respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The average recoveries were 98.23-102.47% （RSD=1.80%， n=6） and 98.84%-102.06% （RSD=1.60%， n=6）. The optimal extraction technology was as follows： the extraction time of 2.50 min; the particle size of 80 mesh， solid-liquid ratio of 1 ∶ 28 （g/mL）. Results of 3 times of validation tests showed that the optimal technology included the average total extraction rates of saikosaponin a and saikosaponin d were 8.42 mg/g， which was higher than that of ultrasonic method （8.34 mg/g） and decoction method （8.06 mg/g）， and the extration time was shorter. CONCLUSIONS： Established method is simple and accurate， and can be used for simultaneous determination of saikosaponin a and saikosaponin d in B. chinense water extract. The optimized water extraction technology for electromagnetic cracking is stable and feasible.

KEYWORDS? ?Bupleurum chinense; Saikosaponin a; Saiko- saponin d; HPLC; Box-Behnken response surface methodo- logy; Water extraction technology; Content determination; Electromagnetic cracking

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC.）或狹葉柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根，被列為上品，是具有一種2 000多年藥用歷史的傳統(tǒng)中藥，具有和解退熱、疏肝解郁、升舉陽氣之功效[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，柴胡具有抗炎、抗病毒、保肝、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等作用[3-5]，臨床常用含柴胡的藥物有柴胡口服液、柴胡注射液、柴胡片、柴胡滴丸等。柴胡主要含皂苷類、黃酮類、多糖類、揮發(fā)油類等成分[6-7]，其中皂苷類成分是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，主要成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d也是柴胡含量測定的指標(biāo)性成分[7-8]。柴胡皂苷常用的提取方法有乙醇回流法、煎煮法、浸漬法、超聲法等，雖然這些方法在一定程度上可滿足提取要求，但存在能耗高、工藝繁瑣、有效成分損失多等缺點(diǎn)[9-11]。電磁裂解提取法是一種新型的提取方法，具有提取時(shí)間短、提取效率高、提取產(chǎn)物活性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，并可在常溫下進(jìn)行，避免了不穩(wěn)定性成分受熱分解[12-15]?；诖?，本研究以水為提取溶劑，采用電磁裂解儀（見圖1）提取了柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d;參考2015年版《中國藥典》（一部）方法[16]采用高效液相色譜法（HPLC）測定了柴胡水提液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量;通過Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并與超聲法和煎煮法進(jìn)行比較，旨在為柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的提取提供一種新的方法，為制藥工業(yè)生產(chǎn)中綠色環(huán)保、節(jié)能減耗提取設(shè)備的研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元梯度泵、可變波長掃描紫外檢測器、自動進(jìn)樣器、色譜工作站（美國Agilent公司）;KQ5200DE型超聲波清洗器（昆山美美超聲儀器有限公司）;電磁裂解儀（長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥劑實(shí)驗(yàn)室自制，專利號：ZL201721353456.1）;L-204型萬分之一電子分析天平、AB135-S型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

柴胡皂苷a對照品（批號：P03M9F50593，純度：≥98%）、柴胡皂苷d對照品（批號：Z08A8L33357，純度：≥98%）均購自中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

柴胡飲片（批號：171101）購于酒泉市培豐中藥材生態(tài)種植加工有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翁麗麗教授鑒定為柴胡（B. chinense DC.）的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 柴胡水提液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量測定

采用HPLC法測定柴胡水提液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量[16]。

2.1.1 色譜條件 色譜柱：SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～50 min，25%A→90%A;50～55 min，90%A）;柱溫：40 ℃;流速：1.0 mL/min;檢測波長：210 nm;進(jìn)樣量：10 μL。在該色譜條件下，各成分分離度均大于2.5，理論板數(shù)以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d計(jì)均不低于35 000，陰性溶液對測定無干擾，詳見圖2。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取柴胡皂苷a對照品、柴胡皂苷d對照品各適量，精密稱定，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成柴胡皂苷a、柴胡皂苷d質(zhì)量濃度分別為202.80、202.00 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品適量，粉碎后過篩（目數(shù)參考最優(yōu)工藝），精密稱取300.0 g，置于電磁裂解儀中，按設(shè)定的試驗(yàn)條件加入一定比例的水提取，濾過，取濾液3.0 mL，60 ℃揮干，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.1.4 陰性溶液 以甲醇為陰性溶液。

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液2.5、4.0、5.5、7.0、8.5、10.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，即得柴胡皂苷a質(zhì)量濃度分別為50.70、81.12、111.54、141.96、172.38、202.80 μg/mL，柴胡皂苷d質(zhì)量濃度分別為50.50、80.80、111.10、141.40、171.70、202.00 μg/mL的系列線性關(guān)系工作溶液。取適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得柴胡皂苷a回歸方程為y=5.694 7x+6.221 4（r=0.999 9），柴胡皂苷d回歸方程為y=5.766 9x+4.492 9（r=0.999 9），表明柴胡皂苷a、柴胡皂苷d檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為50.70～202.80、50.50～202.00 μg/mL。

2.1.6 定量限與檢測限考察 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，加甲醇倍比稀釋，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢測限。結(jié)果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的定量限分別為0.16、0.13 μg/mL，檢測限分別為0.05、0.04 μg/mL。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面積的RSD分別為0.5%、0.3%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，分別于室溫下放置0、3、6、12、24 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d峰面積的RSD分別為1.1%、1.0%（n=5），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取藥材樣品粉末，共6份，每份約300.0 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量。結(jié)果，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的平均含量為2.80、3.69 mg/g，RSD分別為0.4%、0.5%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的藥材樣品粉末，過篩，共6份，每份約150.0 g，分別精密加入一定量的混合對照品溶液1.5 mL（含柴胡皂苷a質(zhì)量濃度56.64 μg/mL、柴胡皂苷d質(zhì)量濃度74.53 μg/mL），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.1.11 樣品含量測定 取藥材樣品粉末適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行操作3次，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量。結(jié)果，柴胡皂苷a的含量為2.48～3.64 mg/g、柴胡皂苷d的含量為3.34～4.74 mg/g。

2.2 柴胡水提液中柴胡皂苷a與柴胡皂苷d總提取率的測定

取藥材樣品粉末適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算柴胡皂苷a與柴胡皂苷d的總提取率（Y）。Y=（C×n×V）/（L×W）[17]，式中C為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d質(zhì)量濃度之和，n為稀釋體積，V為提取液總體積，L為供試品溶液體積，W為樣品質(zhì)量。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取次數(shù)對柴胡皂苷a與柴胡皂苷d總提取率（以下簡稱“總提取率”）的影響? ?取藥材樣品粉末，共5份，每份約300.0 g，以水為提取溶劑，在提取時(shí)間3 min，料液比1 ∶ 25（g/mL），樣品過60目篩條件下，考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）對總提取率的影響，結(jié)果見圖3A。由圖3A可見，隨著提取次數(shù)的增加，雖然在提取3次時(shí)總提取率為最高，但與其余幾次比較無明顯差異，綜合考慮節(jié)能、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)等因素，故選擇提取次數(shù)為1次。其原因可能為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d在提取1次時(shí)已基本被提取出來，此時(shí)再增加提取次數(shù)，總提取率增加不明顯。

2.3.2 提取時(shí)間對總提取率的影響 取藥材樣品粉末，共5份，每份約300.0 g，以水為提取溶劑，在提取次數(shù)1次，料液比1 ∶ 25（g/mL），樣品過60目篩條件下，考察不同提取時(shí)間（1、2、3、4、5 min）對總提取率的影響，結(jié)果見圖3B。由圖3B可見，隨著提取時(shí)間的增加，總提取率呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)提取時(shí)間為2 min時(shí)，總提取率最高，故選擇提取時(shí)間范圍為1～3 min。其原因可能與隨著提取時(shí)間延長，其他雜質(zhì)溶出導(dǎo)致溶液總濃度增加，使柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的溶出傳質(zhì)阻力增加，且還與細(xì)胞內(nèi)外有效成分含量達(dá)到動態(tài)平衡、濃度差推動力減弱到最低有關(guān)。

2.3.3 物料粒度對總提取率的影響 取藥材樣品粉末，共5份，每份約300.0 g，以水為提取溶劑，在提取次數(shù)1次，料液比1 ∶ 25（g/mL），提取時(shí)間2 min條件下，考察不同物料粒度（過40、60、80、100、120目篩）對總提取率的影響，結(jié)果見圖3C。由圖3C可見，隨著物料粒度的增加，總提取率呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)物料粒度過80目篩時(shí)，總提取率最高，故選擇物料粒度范圍為過60～100目篩。其原因可能為物料粒度超過80目篩后，隨著粉碎粒度增加，雜質(zhì)溶出增多，從而影響柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的溶出。

2.3.4 料液比對總提取率的影響 取藥材樣品粉末，共5份，每份約300.0 g，以水為提取溶劑，在提取次數(shù)1次，提取時(shí)間2 min，樣品過80目篩條件下，考察不同料液比（1 ∶ 5、1 ∶ 15、1 ∶ 25、1 ∶ 35、1 ∶ 45，g/mL）對總提取率的影響，結(jié)果見圖3D。由圖3D可見，隨著料液比的增加，總提取率呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)料液比為1 ∶ 25（g/mL）時(shí)，總提取率最高，故選擇料液比范圍為1 ∶ 15～1 ∶ 35（g/mL）。其原因可能為過多的溶劑會溶解更多的雜質(zhì)，從而導(dǎo)致總提取率降低。

2.4 提取工藝優(yōu)化

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間（A）、物料粒度（B）、料液比（C）為考察因素，以總提取率（Y）為響應(yīng)值，采用3因素3水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)。因素與水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表3、方差分析結(jié)果見表4。

2.4.2 模型方程建立 采用Design-Expert 8.06軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元擬合回歸。結(jié)果，二次多元回歸方程為Y=8.32+0.49A+0.07B+0.50C-0.01AB-0.13AC-0.04BC-0.71A2-0.54B2-0.70C2[R 2=0.997 1，校正系數(shù)（R 2Adj）=0.993 4]，P<0.0001，表明方程擬合極顯著;擬合方程的R 2為0.997 1，表明響應(yīng)值的變化有99.71%來自于所選變量;失擬項(xiàng)P值為0.130 1（>0.05），表明模型誤差較小，可用于預(yù)測總提取率。由方差分析結(jié)果可知，3個(gè)因素對總提取率影響的順序從大到小為C>A>B;A、C、A2、B2、C2影響極顯著，B、AB、BC影響不顯著。

2.4.3 響應(yīng)面分析 采用Design-Expert 8.06軟件，以提取時(shí)間（A）、物料粒度（B）、料液比（C）為考察因素，以總提取率為響應(yīng)值，繪制響應(yīng)面和等高線圖，詳見圖4。由圖4可知，因素A與C交互作用較為顯著，因素A與B、因素B與C交互作用不顯著。

2.4.4 最優(yōu)提取條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn) 基于Design-Expert 8.06軟件優(yōu)化得到最佳提取工藝為提取時(shí)間2.31 min、物料粒度過80.99目篩、料液比1 ∶ 28.27（g/mL），總提取率預(yù)測值為8.48 mg/g。考慮到試驗(yàn)的可操作性，最終最優(yōu)提取工藝確定為提取時(shí)間2.50 min、過80目篩、料液比1 ∶ 28（g/mL）。3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，在此工藝條件下，平均總提取率為8.42 mg/g（RSD=1.2%），預(yù)測值與實(shí)際值接近，表明模型優(yōu)化的結(jié)果合理、可靠。

2.5 不同提取方法的比較

參考相關(guān)文獻(xiàn)[18-19]，將上述最優(yōu)提取工藝與超聲法、煎煮法進(jìn)行比較，各方法均平行操作3次，結(jié)果見表5。由表5可見，電磁裂解法可明顯縮短提取時(shí)間，且平均總提取率最高。

3 討論

本研究采用HPLC法測定了以電磁裂解法提取的柴胡水提液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，該方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，可用于同時(shí)測定柴胡水提液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。采用單因素試驗(yàn)對影響柴胡皂苷a和柴胡皂苷d提取的4個(gè)因素即提取次數(shù)、提取時(shí)間、物料粒度、料液比進(jìn)行優(yōu)化。綜合考慮單因素試驗(yàn)結(jié)果及節(jié)能、省時(shí)、經(jīng)濟(jì)等因素，確定提取次數(shù)為1次，僅對其余3個(gè)因素通過Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)提取工藝為提取時(shí)間2.50 min、過80目篩、料液比1 ∶ 28（g/mL）。驗(yàn)證試驗(yàn)得總提取率為8.42 mg/g。與超聲法和煎煮法相比，電磁裂解法提取的總提取率最高，提取時(shí)間最短。

柴胡皂苷a和柴胡皂苷d屬于柴胡藥材中的原生皂苷類成分，其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在煎煮過程中分別易降解為柴胡皂苷b1和柴胡皂苷b2[20-21]。而電磁裂解提取可有效避免柴胡皂苷a和柴胡皂苷d受熱分解，其高效、節(jié)能等特點(diǎn)可為柴胡的工業(yè)化提取提供新思路，并為其合理應(yīng)用及開發(fā)提供參考。

綜上所述，本研究所建含量測定方法簡便、準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測定柴胡水提液中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量;所得優(yōu)化工藝穩(wěn)定、可行。

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（收稿日期：2019-03-26 修回日期：2019-06-23）

（編輯：陳 宏）