麻杏石甘湯對(duì)肺炎模型小鼠的療效觀察及對(duì)共刺激分子CD137水平的影響

柴少卿 于少飛 朱華

摘要? 目的：觀察麻杏石甘湯對(duì)肺炎模型小鼠的療效，同時(shí)探討其對(duì)共刺激分子CD137水平的影響。方法：選取60只無(wú)特定病原體（SPF級(jí)）幼齡小鼠納入研究，并隨機(jī)分為空白組、模型組及中藥組，每組20只。其中模型組及中藥組小鼠接受肺炎克雷伯菌混懸液滴入鼻腔，空白組小鼠接受等劑量生理鹽水滴鼻，24 h中藥組小鼠接受麻杏石甘湯灌胃，1劑/d，共干預(yù)7 d。比較3組小鼠一般活動(dòng)情況、外周血中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、多核粒細(xì)胞激素（PMN）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、肺組織病理改變以及外周血單核細(xì)胞中共刺激分子CD137水平的變化。結(jié)果：空白組小鼠未出現(xiàn)任何陽(yáng)性體征，模型組及中藥組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、體質(zhì)量下降、活動(dòng)減少等相關(guān)陽(yáng)性癥狀，其中中藥組較模型組改善;模型組及中藥組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、PMN、IL-6及IL-8均較空白組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），其中中藥組優(yōu)于對(duì)照組（ P <0.05）。模型組及中藥組小鼠肺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)錯(cuò)亂、肺泡大小不一，各級(jí)支氣管周圍、小葉間及肺泡間隔等存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分有纖維增生。其中中藥組較模型組病理明顯改善。模型組及中藥組小鼠外周血共刺激分子CD137表達(dá)增高，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），其中中藥組水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。結(jié)論：麻杏石甘湯加減對(duì)肺炎有明顯臨床效果，其作用機(jī)制可能與抑制共刺激分子CD137的分泌有關(guān)。

關(guān)鍵詞? 肺炎模型;肺炎克雷伯菌;小鼠;麻杏石甘湯;CD137

Effects of Maxing Shigan Decoction on Pneumonia Model Mice and Its Effect on CD137 Level of Costimulatory Molecule

Chai Shaoqin，Yu Shaofei，Zhu Hua

（Pediatric Department，People′s Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region，Hohhot 010010，China）

Abstract Objective： To observe the curative effect of Maxing Shigan Decoction on pneumonia model mice，and to explore its effects on the level of costimulatory molecule CD137. Method：A total of 60 SPF-free young mice were randomly divided into blank group，model group and Traditional Chinese Medicine group with 20 mice in each group. The mice in the model group and Traditional Chinese Medicine group were given Klebsiella pneumoniae suspension by dripping into the nasal cavity，the mice in the blank group were given the same dose of normal saline nasal drops，the mice in Traditional Chinese Medicine group were given Maxing Shigan Decoction intragastric administration for 24 hours，one dose per day，for 7 days. The general activity，peripheral blood （WBC），polymorphonuclear hormone （PMN），interleukin-6 （IL-6），interleukin-8 （IL-8），lung histopathology and the concentration of costimulatory molecule CD137 in peripheral blood mononuclear cells were compared.? Results： There were no positive signs in the blank group mice，but the model group mice and Traditional Chinese Medicine group mice showed mental dispirity，weight loss，decreased activity，and decreased fur gloss，and Traditional Chinese Medicine group mice were better than the model group mice. WBC，PMN，IL-6 and IL-8 in the peripheral blood of the model group mice and Traditional Chinese Medicine group mice were higher than the blank group mice，the difference was statistically significant （ P <0.05），Traditional Chinese Medicine group was better than the control group （ P <0.05）. There were a lot of inflammatory cells infiltrating around bronchi，interlobular and alveolar septum，and some fibrosis in the model group and Traditional Chinese Medicine group. Traditional Chinese Medicine group improved significantly compared with the model group. The expression of costimulatory molecule CD137 in peripheral blood of mice in model group and Traditional Chinese Medicine group was higher than that in blank group （ P <0.05）. The level of costimulatory molecule CD137 in Traditional Chinese Medicine group was lower than that in model group （ P <0.05）.? Conclusion： Maxing Shigan Decoction has obvious clinical effect on pneumonia，and its mechanism may be related to the inhibition of the secretion of costimulatory molecule CD137.

Key Words? Pneumonia model pneumonia; Klebsiella mice; Maxing Shigan Decoction; CD137

中圖分類號(hào)：R289.4;R563.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.019

細(xì)菌性肺炎是常見的肺炎類型，是臨床常見的感染性疾病之一，亦是導(dǎo)致我國(guó)兒童死亡的主要病因，遠(yuǎn)超過因艾滋病、瘧疾和麻疹死亡兒童人數(shù)的總和，但由于病原體的變遷、抗生素濫用等因素導(dǎo)致臨床療效差強(qiáng)人意。據(jù)目前已知研究[1-3]，細(xì)菌性肺炎的發(fā)生發(fā)展與多種炎性細(xì)胞及活性因子的級(jí)聯(lián)效應(yīng)導(dǎo)致氣道慢性炎性反應(yīng)有關(guān)，在此病理環(huán)節(jié)中T淋巴細(xì)胞的活化具有重要作用，貫穿炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)始終，而T淋巴細(xì)胞的異常激活與與其表面共刺激分子的活化關(guān)系密切。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌性肺炎患兒外周血T淋巴細(xì)胞表面共刺激分子被明顯活化，因此我們?cè)O(shè)想，抑制T淋巴細(xì)胞表面共刺激分子可能是細(xì)菌性肺炎的靶向治療。中醫(yī)古籍并無(wú)“細(xì)菌性肺炎”的病名記載，根據(jù)其臨床癥狀將其歸屬于“咳嗽”“喘證”等范疇，好發(fā)于兒童，中醫(yī)認(rèn)為小兒臟腑嬌嫩，形氣未充，極易外感風(fēng)邪，夾寒夾熱入侵與肺，影響肺氣宣發(fā)肅降，最終致肺氣郁遏，痰阻肺絡(luò)而成此病。麻杏石甘湯首載于《傷寒論》，有辛涼宣泄，清肺平喘之功效，具有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠盟幣湮?，與細(xì)菌性肺炎的病機(jī)一一對(duì)應(yīng)，臨床亦不乏麻杏石甘湯治療細(xì)菌性肺炎有效的臨床報(bào)道[4-6]，但對(duì)其作用機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一定論，基于此，我們利用麻杏石甘湯對(duì)60只SPF級(jí)小鼠進(jìn)行研究，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取60只無(wú)特定病原體（SPF級(jí)）幼齡小鼠，體質(zhì)量30～40 g，平均體質(zhì)量（31±1.1）g。鼠齡2～3個(gè)月，平均鼠齡（2.1±0.5）月。所有小鼠均購(gòu)自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXX（滬）2011-00241。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)條件：溫度（23.5±0.5）℃，濕度（52±1.5）%，以12/12 h為光暗周期。

1.1.2 藥物 麻杏石甘湯由本院中藥研究院提供，中藥組成：麻黃6 g、杏仁9 g、生石膏24 g、甘草6 g。

1.1.3 試劑與儀器

肺炎克雷伯菌株（本院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供）;IL-6 ELISA試劑盒（貨號(hào)kt37687，購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司）;IL-8 ELISA試劑盒（貨號(hào)kt32377，購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司）;全自動(dòng)生化儀（AU5800，購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）;酶標(biāo)儀（購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司）;CD137抗體（貨號(hào)ab9822，購(gòu)自Abcan公司）;β-actin抗體（貨號(hào)28341，購(gòu)自CST公司）;二抗羊抗小鼠Ig-HRP（貨號(hào)3928347，購(gòu)自北京中衫生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取只無(wú)特定病原體（SPF級(jí)）幼齡小鼠納入研究，隨機(jī)分為空白組（20只）、模型組（模型制備20只）及中藥組（20只）。3組小鼠體質(zhì)量、鼠齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P >0.05），具有可比性。本研究方案經(jīng)過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

模型制備參照參考文獻(xiàn)[7-8]中的模型制備方法：將小鼠充分麻醉后置于手術(shù)臺(tái)上，頸部備皮后消毒，將氣管充分暴露于操作者視野，用1 mL注射器刺入氣管滴入克雷伯菌懸濁液0.15 mL（用生理鹽水稀釋成1.2×1011cfu/L），空白組小鼠注入等劑量的生理鹽水，造模后縫合小鼠皮膚、常規(guī)消毒后使小鼠保持豎立狀態(tài)20 s。

1.2.2 干預(yù)方法

根據(jù)小鼠與人體間等效劑量換算0.66 g/mL對(duì)中藥組小鼠進(jìn)行灌胃，每日灌胃1次，空白組及模型組大鼠接受等劑量的生理鹽水灌胃，3組均連續(xù)灌胃7 d，麻杏石甘湯：麻黃3 g、苦杏仁3 g、石膏9 g、甘草2 g。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1）一般狀況評(píng)分：對(duì)3組小鼠精神狀況、體質(zhì)量、活動(dòng)量、皮毛光澤度進(jìn)行觀察比較。2）血細(xì)胞計(jì)數(shù)比較：對(duì)3組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、多核粒細(xì)胞激素（PMN）計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）水平比較：干預(yù)后從3組隨機(jī)選取3只小鼠，充分麻醉后抽取腹主動(dòng)脈血10 mL，置于4 ℃，2 000 r/min條件下充分離心15 min，抽取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）進(jìn)行檢測(cè)，將IL-6及IL-8抗體用碳酸鹽包被緩沖液稀釋后適量濃度后加至反應(yīng)孔中，每孔加入0.1 mL，將反應(yīng)板置于4 ℃條件下孵育過夜，隨后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）反復(fù)沖洗3次，1 min/次，隨后加入3組樣本，室溫下靜置1 h，隨后往各反應(yīng)孔中加入TMB底物溶液0.1 mL，室溫下充分反應(yīng)1 h后加入硫酸0.05 mL顯色，將反應(yīng)孔板置于酶標(biāo)儀內(nèi)讀取A值。整個(gè)過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。3）肺組織病理改變：干預(yù)后從3組隨機(jī)選取3只小鼠，充分麻醉后取肺部組織，采用蘇木精-伊紅（HE）染色對(duì)3組小鼠肺組織的病理形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，具體操作如下：將肺組織取出后置于多聚甲醛內(nèi)固定24 h，二甲苯（Ⅰ）15 min→二甲苯（Ⅱ）15 min→95%乙醇（Ⅰ）5 min→95%乙醇（Ⅱ）5 min→80%乙醇3 min→70%乙醇3 min→蒸餾水（Ⅰ）3 min→蒸餾水（Ⅱ）3 min過程進(jìn)行脫水，隨后將3組樣本進(jìn)行石蠟包埋，切片后撈片，用蘇木精染色后將玻片置于顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。4）肺組織CD137檢測(cè)：干預(yù)后從3組隨機(jī)選取3只小鼠，充分麻醉后取肺部組織，采用免疫蛋白印跡（Western blotting）對(duì)肺組織內(nèi)CD137水平進(jìn)行檢測(cè)，具體過程如下：將3組樣本中加入裂解液對(duì)組織進(jìn)行充分裂解，隨后將充分裂解的樣本在4 ℃，12 000 r/min條件下進(jìn)行離心后，吸取上清液，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白水平測(cè)定，將樣本加入事先配制好的電泳凝膠內(nèi)，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育CD137及β-actin一抗、孵育二抗后取出聚偏氟乙烯（PDVF）膜，加入ECL顯影液進(jìn)行顯影，在凝膠成像系統(tǒng)中對(duì)顯影結(jié)果進(jìn)行采集及分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn);組內(nèi)比較采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。以 P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠一般情況比較 模型組及中藥組小鼠接受造模當(dāng)天即出現(xiàn)煩躁活動(dòng)增強(qiáng)，造模第2天、第3天后小鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)量減少，食欲減退，第4天小鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡，體質(zhì)量下降，部分小鼠出現(xiàn)明顯的呼吸喘鳴音，第5天、第6天部分小鼠出現(xiàn)呼吸急促、顏面部、四肢發(fā)紺。與模型組比較，中藥組小鼠癥狀明顯改善?？瞻捉M小鼠未出現(xiàn)明顯陽(yáng)性癥狀體征。

2.2 3組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、PMN計(jì)數(shù)、IL-6、IL-8比較 模型組及中藥組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、PMN計(jì)數(shù)、IL-6、IL-8均較空白組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），其中中藥組優(yōu)于對(duì)照組（ P <0.05）。見表1。

2.3 2組小鼠肺組織病理學(xué)比較

模型組及中藥組小鼠肺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)錯(cuò)亂、肺泡大小不一，各級(jí)支氣管周圍、小葉間及肺泡間隔等存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分有纖維增生。其中中藥組較模型組病理明顯改善。見圖1。

2.4 3組小鼠肺組織CD137比較

模型組及中藥組小鼠外周血共刺激分子CD137表達(dá)增高，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05），其中中藥組水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。見表2及圖2。

3 討論

細(xì)菌性肺炎屬于中醫(yī)“咳嗽”“喘證”范疇，多由風(fēng)邪外感而導(dǎo)致。風(fēng)邪性分寒熱二類，風(fēng)熱侵表，表邪不解入里，或風(fēng)寒之邪從口鼻或皮毛入侵后寒隨化熱，肺經(jīng)被壅束，肺失宣降，郁而化熱，最終里熱大盛，煉液為痰，壅堵氣道，最終加劇肺氣宣降無(wú)權(quán)之勢(shì)。病情輕者者僅有發(fā)熱咳嗽，病情重者則里熱大盛，故患兒出現(xiàn)壯熱不退，咳嗽喘憋，呼吸困難等一系列臨床癥狀[9-11]?；谏鲜霾C(jī)，中醫(yī)治療喘息性肺炎以宣肺散邪、清瀉肺熱為主。麻杏石甘湯首載于《傷寒論》，是治療外感風(fēng)邪、邪熱壅肺之方，方中麻黃有開宣肺氣平喘之功，亦可開腠理以散表邪;石膏辛甘大寒，可清瀉肺熱及生津止渴，還可透邪解表。麻黃、石膏合用，一溫一寒，即可宣肺又可清肺，且均可祛邪外出，二藥合用相輔相成，即可清除致病之因，又可恢復(fù)肺氣宣發(fā)肅降之功。杏仁味苦，可降利肺氣，助肺氣肅降之功而平喘，此藥與麻黃合用則宣降相因，與石膏共用則清肅協(xié)同。炙甘草有益氣和中之功，與石膏合用可增強(qiáng)君藥生津之功，更可調(diào)和于寒溫宣降之間。麻黃、石膏、杏仁、炙甘草四藥合用，共奏解表、宣肺、降氣之功[12-14]。故本研究發(fā)現(xiàn)，模型組及中藥組小鼠在接種克雷伯菌后出現(xiàn)出現(xiàn)咳喘、呼吸急促等肺部相關(guān)癥狀，與此同時(shí)小鼠在接受麻杏石甘湯干預(yù)后陽(yáng)性癥狀明顯緩解，這提示麻杏石甘湯對(duì)細(xì)菌性肺炎確有理想療效，同時(shí)我們對(duì)3組小鼠的肺臟進(jìn)行HE染色，觀察其病理變化，發(fā)現(xiàn)接受克雷伯菌接種的小鼠出現(xiàn)肺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)錯(cuò)亂、肺泡大小不一，各級(jí)支氣管周圍、小葉間及肺泡間隔等存在大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分有纖維增生，這提示本研究造模是成功的，我們對(duì)中藥組小鼠進(jìn)行麻杏石甘湯灌胃后顯示小鼠肺臟組織的病理較模型組有明顯改善，這與相關(guān)研究結(jié)果相似[15-17]。

細(xì)菌性肺炎是嬰幼兒常見的臨床疾病，目前研究資料顯示T淋巴細(xì)胞異常激活是細(xì)菌性肺炎發(fā)生的觸發(fā)點(diǎn)，其活化過程需要共刺激信號(hào)的誘發(fā)，而信號(hào)由T淋巴細(xì)胞膜表面共刺激分子與抗原提呈細(xì)胞（APC）表面相應(yīng)配體結(jié)合后產(chǎn)生[18-19]。近年來體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多種共刺激分子在T淋巴細(xì)胞活化、增殖、凋亡等不同階段均有中藥的介導(dǎo)效應(yīng)。CD137是近年來新發(fā)現(xiàn)的T淋巴細(xì)胞共刺激分子，屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族的重要因子，CD137在T淋巴細(xì)胞內(nèi)存在磷酸化位點(diǎn)，正常整理狀態(tài)下該位點(diǎn)處于穩(wěn)定狀態(tài)，從而使CD137在T淋巴細(xì)胞表面處于靜止?fàn)顟B(tài)，不進(jìn)行表達(dá)，一旦CD4+、CD8+等T淋巴細(xì)胞被異?；罨瑒tCD137磷酸化位點(diǎn)被激活出現(xiàn)了高表達(dá)。CD137高表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)T淋巴細(xì)胞異?；罨?，從而進(jìn)一步影響T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能，加重病情發(fā)展，因此抑制CD137的表達(dá)被認(rèn)為是細(xì)菌性肺炎的治療新靶向。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)模型組及中藥組小鼠肺組織CD137水平明顯高于空白組小鼠，經(jīng)過麻杏石甘湯干預(yù)后中藥組小鼠肺組織CD137水平明顯下調(diào)，這提示麻杏石甘湯有效抑制細(xì)菌性肺炎機(jī)體CD137的活化，從而糾正T淋巴細(xì)胞的功能[20-22]。

總之，麻杏石甘湯治療細(xì)菌性肺炎療效理想，其作用機(jī)制可能與抑制共刺激分子CD137的分泌，從而改善了患者的免疫系統(tǒng)功能有關(guān)。

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