不同產(chǎn)地蒼耳子HPLC指紋圖譜及主要成分含量測(cè)定研究

何欽 鄭薇 李偉東 金俊杰 蔡寶昌 董自波 秦昆明

摘要? 目的：研究建立不同產(chǎn)地蒼耳子的HPLC指紋圖譜，并對(duì)不同產(chǎn)地蒼耳子藥材中4個(gè)主要成分進(jìn)行含量測(cè)定，為制定蒼耳子藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。方法：采用高效液相色譜方法，測(cè)定了10批蒼耳子藥材樣品，采用國(guó)家藥典委員會(huì)的中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而建立蒼耳子藥材的指紋圖譜共有模式。 結(jié)果：從不同產(chǎn)地蒼耳子HPLC指紋圖譜中，確定了16個(gè)指紋圖譜共有峰，建立了指紋圖譜共有模式;測(cè)定了不同產(chǎn)地蒼耳子中4個(gè)主要成分含量。結(jié)論：本方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，所建立的對(duì)照指紋圖譜和含量限度標(biāo)準(zhǔn)可以用于不同蒼耳子藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞? 蒼耳子藥材;指紋圖譜;高效液相色譜;主要成分;質(zhì)量控制;含量測(cè)定;產(chǎn)地

Study on the Fingerprint of Xanthium sibiricum L.from Different Origins and the Content Determination of Its Main Components

He Qin1，Zheng Wei1，Li Weidong2，Jin Junjie3，Cai Baochang2，3，Dong Zibo4，Qin Kunming3，4

（1 Suzhou Integrated Chinese and Western Medicine Hospital，Suzhou 215000，China; 2 College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China; 3 Nanjing Haiyuan Prepared Slices of Chinese Crude Drugs Co.Ltd，Nanjing 210061，China; 4 School of Pharmacy，HuaiHai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China）

Abstract Objective： To study the HPLC fingerprint of Fructus Xanthii，and to evaluate the quality of Fructus Xanthii from different habitats and batches，and to provide a reference for the formulation of the overall quality standard of Xanthium herbs. Methods： A total of 10 batches of Fructus Xanthii were determined by high performance liquid chromatography，and the data were analyzed by the similarity calculation software of the National Pharmacopoeia Committee of Chinese Pharmacopoeia （CTP），and the common pattern of the fingerprint of Fructus Xanthii was established. Results： A total of 16 fingerprint peaks were identified，and a common fingerprint pattern of Fructus Xanthii was established.The contents of four main components in Xanthium sibiricum from different habitats were determined. Conclusion： The method is stable and reproducible，and the established fingerprint can be used for quality evaluation and quality control of Fructus Xanthii.

Key Words? Fructus Xanthii herb; Fingerprint; HPLC; Main ingredients; Quality control; Content determination; Origin

中圖分類(lèi)號(hào)：R932 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2019.02.002

中藥蒼耳子為菊科植物蒼耳（ Xanthium sibiricum Patrin? ex Widder）的干燥成熟果實(shí)，臨床上主要用于治療風(fēng)寒頭痛、鼻淵流涕、風(fēng)疹瘙癢等癥。蒼耳子最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草文獻(xiàn)中多記載其有“有小毒”。2015版《中華人民共和國(guó)藥典》將蒼耳子歸為“有毒”藥材[1]。蒼耳子所含化學(xué)成分比較復(fù)雜，主要含有酚酸類(lèi)、倍半萜內(nèi)酯類(lèi)、水溶性苷類(lèi)以及油脂類(lèi)等化學(xué)成分[2]，主要藥理作用有降血糖、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等[3]。

目前，對(duì)蒼耳子藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)主要集中在酚酸類(lèi)成分以及水溶性苷類(lèi)成分的含量測(cè)定研究[4-5]。酚酸類(lèi)成分主要有綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C等[6];水溶性苷類(lèi)主要有蒼術(shù)苷和羥基蒼術(shù)苷，分析方法多為高效液相色譜法或高效毛細(xì)管電泳[7]。此外，有研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析蒼耳子中揮發(fā)性成分及油脂類(lèi)成分[8]。

中藥材質(zhì)量與產(chǎn)地息息相關(guān)，不同產(chǎn)地的蒼耳子藥材是否存在質(zhì)量差異尚缺乏深入研究。本實(shí)驗(yàn)收集了10批來(lái)自不同產(chǎn)區(qū)的蒼耳子藥材樣品，采用高效液相色譜法開(kāi)展指紋圖譜研究，并對(duì)蒼耳子中4個(gè)主要成分進(jìn)行含量測(cè)定，為科學(xué)評(píng)價(jià)蒼耳子藥材的質(zhì)量提供了參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津公司Shimadzu LC-20AB高液相色譜儀，包括在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器和柱溫箱;色譜柱為YMC-Pack ODS（250×4.6 mm，5 μm）;KQ3200DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）;BS2242S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）。

1.2 試劑 甲醇（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）;乙腈（色譜純，美國(guó)天地公司）;水（去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制）。綠原酸對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0753-200111;隱綠原酸（批號(hào)150728，純度：98%）、異綠原酸A（批號(hào)151028，純度：98%）、異綠原酸C（批號(hào)150624，純度：98%）均購(gòu)自南京世洲生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用面積歸一化法測(cè)定均≥98%。

1.3 分析樣品 本品由南京海源中藥飲片有限公司從河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)采購(gòu)，經(jīng)丁斐執(zhí)業(yè)藥師鑒定為菊科植物蒼耳（ Xanthium sibiricum Patrin? ex Widder）的成熟帶總苞的果實(shí)，共10批，產(chǎn)地和批號(hào)見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動(dòng)相：乙腈（B）-0.4%磷酸水溶液（A）;柱溫：35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm;流速：1 mL/min;進(jìn)樣體積：10 μL;梯度洗脫程序：0～35 min，10%B→17% B;35～40 min，17%B→20%B;40～55 min，20%B→30%B;55～70 min，30%B→60%B;70～75 min，60%B→10%B。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品各10 mg，精密稱(chēng)定，分別置5 mL容量瓶中，用20%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得對(duì)照品儲(chǔ)備液。取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一10 mL棕色容量瓶中，加20%乙醇稀釋至刻度，得混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備 取上述不同產(chǎn)地的蒼耳子藥材，粉碎后過(guò)60目篩。取蒼耳子藥材粉末1 g，精密稱(chēng)定，分別置于具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，稱(chēng)重。超聲處理60 min，放冷后稱(chēng)重，用甲醇補(bǔ)足減失重量，濾紙過(guò)濾，濾液減壓濃縮，濃縮液加甲醇定容至10 mL，用0.45 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，即得樣品溶液。

2.4 不同產(chǎn)地蒼耳子指紋圖譜建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一樣品溶液，照上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖中各主要色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積值的 RSD 值分別在0.00% ～0.15%和0.13% ～2.19%之間，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取1號(hào)蒼耳子樣品，按2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，照上述色譜條件，分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖中各主要色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積值的 RSD 值分別在0.00% ～1.08%和1.22% ～2.37%之間，表明該分析方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，照上述色譜條件，分別在0，2，4，6，8，24 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖中各主要色譜峰的保留時(shí)間和峰面積。各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積值的 RSD 值分別在0.00% ～1.30%和1.26% ～3.09%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 指紋圖譜建立及共有峰標(biāo)定 按上述方法測(cè)定10批蒼耳子藥材的指紋圖譜，采用中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》軟件，自動(dòng)匹配10批次蒼耳子的HPLC色譜圖色譜峰保留時(shí)間和峰面積等參數(shù)，以平均數(shù)法作為對(duì)照指紋圖譜的生成方法，建立蒼耳子藥材的指紋圖譜共有模式，生成對(duì)照指紋圖譜。10批蒼耳子藥材的指紋圖譜疊加圖。見(jiàn)圖1。指紋圖譜共有模式。見(jiàn)圖2。

通過(guò)分析，確定了蒼耳子藥材指紋圖譜中16個(gè)共有峰，其中13號(hào)峰的峰面積較大，且分離度和峰形都較好，因此我們選擇13號(hào)峰作為參照物峰，標(biāo)號(hào)為S，其他特征峰依次標(biāo)號(hào)為1，2，……，S，……，16。根據(jù)指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果，得出樣品的相似度，10批蒼耳子藥材樣品的相似度計(jì)算數(shù)據(jù)。見(jiàn)表2。來(lái)自河南、河北、山東、江蘇等中東部地區(qū)的6批蒼耳子指紋圖譜相似度均在0.8以上，來(lái)自四川、廣東、黑龍江和遼寧的蒼耳子指紋圖譜相似度與中東部產(chǎn)區(qū)相比較低，但這4個(gè)產(chǎn)地間樣品指紋圖譜相似度均達(dá)到0.8以上，相似度較高。 由此可見(jiàn)，不同產(chǎn)地蒼耳子藥材內(nèi)在質(zhì)量存在一定差異;地理位置靠近的中東部省區(qū)產(chǎn)蒼耳子質(zhì)量相近;東北和南方產(chǎn)的蒼耳子內(nèi)在質(zhì)量相似度較高，其內(nèi)在成分累積規(guī)律還有待進(jìn)一步深入研究。

2.4.5 共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積 通過(guò)與對(duì)照品保留時(shí)間和紫外光譜檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行比較，圖2中峰7為綠原酸，峰8為隱綠原酸，峰13為異綠原酸A，峰15為異綠原酸C。異綠原酸A含量較高，且位于色譜圖中間位置，因此選為參照物峰。將共有指紋峰的保留時(shí)間和峰面積與13號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積比較，對(duì)蒼耳子藥材共有模式中已標(biāo)定的16個(gè)共有峰進(jìn)行比值計(jì)算。10批蒼耳子藥材樣品的指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積值數(shù)據(jù)。見(jiàn)表3、表4。

2.5 不同產(chǎn)地蒼耳子中4個(gè)主要成分含量測(cè)定

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密量取適量的混合對(duì)照品溶液于容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣20 μL測(cè)定，以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算4個(gè)成分的線性回歸方程為：綠原酸Y=9 950 320.42X+4 769.84（r=0.999 6）、隱綠原酸Y=68 921 037.01X+51 960.39（r=0.999 8）、異綠原酸AY=8 210 383.75X+1 952.74（r=0.999 9）、異綠原酸CY=1 629 357.81X+4 819.16（r=0.999 8），結(jié)果表明上述4個(gè)成分在濃度為0.012 5～0.250 mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取1號(hào)蒼耳子樣品供試品溶液20 μL，在2.1項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，4個(gè)成分含量的 RSD 均小于0.25%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1號(hào)蒼耳子樣品供試品溶液，分別在配制后的0，4，8，12，16，24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得4個(gè)成分含量的 RSD 均小于0.20%，說(shuō)明供試樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取1號(hào)蒼耳子樣品，按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作，平行制備6份供試品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣分析，測(cè)得4個(gè)成分含量的 RSD 均小于3.50%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.5 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的1號(hào)蒼耳子樣品粉末6份，每份0.5 g，分別精密加入相當(dāng)于藥材中4個(gè)成分含量的對(duì)照品溶液，混勻，按2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示：4個(gè)成分的平均回收率為97.87%， RSD 為2.71%。

2.5.6 樣品測(cè)定結(jié)果 分別精密稱(chēng)取不同產(chǎn)地蒼耳子樣品適量，按2.3項(xiàng)下供試液品制備方法分別制備成供試品溶液，依照2.1項(xiàng)下色譜條件分析各樣品。各供試品溶液分別進(jìn)樣測(cè)定3次，以峰面積按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算各樣品中4個(gè)主要成分的含量，并計(jì)算平均值。不同產(chǎn)地蒼耳子中4個(gè)成分的含量差異較大，原因可能為4個(gè)酚酸類(lèi)成分含量受蒼耳子的品種、產(chǎn)地和采收期影響較大。 在蒼耳子質(zhì)量控制中應(yīng)該對(duì)綠原酸隱綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C等酚酸類(lèi)成分進(jìn)行質(zhì)量控制，以全面評(píng)價(jià)蒼耳子藥材質(zhì)量。由于現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示，不同產(chǎn)地蒼耳子內(nèi)在質(zhì)量差異較大，因此為了建立更加科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，還需要通過(guò)大樣本的數(shù)據(jù)比較分析。由此可見(jiàn)，在整體特征圖譜相似性良好的情況下，飲片所含有效成分的含量仍然可能存在較大差異。因此有必要在特征圖譜評(píng)價(jià)基礎(chǔ)上增加指標(biāo)性成分的含量測(cè)定，從而全面評(píng)價(jià)中藥飲片的質(zhì)量。見(jiàn)表5。

3 討論

蒼耳子藥材中含有多類(lèi)不同的化學(xué)成分，如酚酸類(lèi)、倍半萜內(nèi)酯類(lèi)和水溶性苷類(lèi)等[9]，為了盡可能多的提取主要代表性成分，本研究選用甲醇和乙醇2種不同溶劑進(jìn)行比較研究，并且考察了超聲提取法和加熱回流提取法對(duì)蒼耳子藥材提取效率的影響，結(jié)果顯示：蒼耳子藥材用甲醇超聲提取效果最佳。通過(guò)上述研究，最終建立了蒼耳子藥材的提取方法，可以盡可能多的提取主要成分，用于進(jìn)行指紋圖譜研究，確保建立的指紋圖譜共有模式更有代表性。

在指紋圖譜分析方法的建立過(guò)程中，先后選用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.4%磷酸水等作流動(dòng)相，結(jié)果顯示：采用乙腈-0.4%磷酸水作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，色譜圖基線較為穩(wěn)定，峰形較好，分離度符合要求。通過(guò)DAD全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示320 nm處色譜峰出峰最多，且分離度良好，故最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。

研究結(jié)果表明，特征圖譜技術(shù)可以有效進(jìn)行中藥飲片的鑒別，但是在整體圖譜相似性良好的情況下，藥材所含有效成分的含量仍然可能存在較大差異，如不同產(chǎn)地蒼耳子中的4個(gè)主要成分含量各不相同。因此有必要在特征圖譜評(píng)價(jià)基礎(chǔ)上盡增加有效成分的含量測(cè)定，從而全面評(píng)價(jià)中藥飲片的質(zhì)量，建立更加全面、科學(xué)、合理的中藥飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。

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