基于尿液代謝組學(xué)探究刺血結(jié)合藥線點灸對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠作用機制研究

陳日蘭 何彥霖 江海燕 劉泓毅 韋秋娜 羅國馨 彭元霞 朱英

〔摘要〕 目的 通過觀察刺血結(jié)合藥線點灸對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠尿液代謝組學(xué)影響，初步探討刺血結(jié)合藥線點灸對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用機制。方法 將39只SD大鼠隨機分3組：空白組、模型組、治療組，每組13只。模型組僅造模，治療組造模后給予刺血結(jié)合藥線點灸治療。記錄各組大鼠的步態(tài)、關(guān)節(jié)腫脹度變化;并運用氣相色譜儀與飛行時間質(zhì)譜儀的聯(lián)用代謝組學(xué)技術(shù)分析大鼠尿液代謝產(chǎn)物，進行主成分分析和偏最小二乘方判別分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。結(jié)果 治療后3組大鼠的步態(tài)評價和造模后各時間段的關(guān)節(jié)腫脹度比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;以VIP>1為標準尋找治療組與模型組中的標志性差異性代謝物16個，以P<0.05及質(zhì)譜信息再鑒別出標志性差異代謝物α-酮戊二酸、γ-氨基丁酸1、肌醇、半乳糖苷、檸檬酸5個;經(jīng)MetPA數(shù)據(jù)庫進行二次分析，發(fā)現(xiàn)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠治療前后其尿液代謝組學(xué)變化涉及代謝通路13條，其中丁酸代謝、三羧酸循環(huán)、半乳糖代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝這4條代謝途徑影響值的臨界點>0.10。結(jié)論 刺血結(jié)合藥線點灸可以改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠步態(tài)及關(guān)節(jié)腫脹度。其作用機制可能是通過影響體內(nèi)丁酸代謝、三羧酸循環(huán)、半乳糖代謝以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路從而抑制炎癥因子轉(zhuǎn)錄生成，加速局部代謝循環(huán)，起到消炎、鎮(zhèn)痛作用。

〔關(guān)鍵詞〕 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎;刺血;藥線點灸;代謝組學(xué)

〔中圖分類號〕R245.31? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.020

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是因尿酸鈉沉積于關(guān)節(jié)導(dǎo)致關(guān)節(jié)紅腫、疼痛的關(guān)節(jié)疾病[1]。嚴重影響患者生活，且近年來患病率明顯升高并有年輕化趨勢[2]。刺血結(jié)合藥線點灸療法以其簡便、快捷、顯效在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎治療中凸顯優(yōu)勢，但是其機制的研究甚少，尤其在動物實驗方面，因此，加強實驗研究為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，迫在眉睫[3-6]。代謝組學(xué)能從整體水平研究生物體內(nèi)源性小分子在內(nèi)外環(huán)境或基因影響下的代謝物變化，可對比評價治療前后的機體病理生理狀態(tài)，解釋生物體代謝的本質(zhì)科學(xué)尋找有效的治療措施，降低治療的毒副作用，提高臨床療效[7]?；诖耍狙芯渴褂么x組學(xué)技術(shù)，通過檢測、分析急性痛風(fēng)性模型大鼠尿液中代謝產(chǎn)物，尋找差異性標志物，分析相關(guān)代謝通路，以探究刺血結(jié)合壯醫(yī)藥藥線點灸治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物與分組

雄性SD大鼠39只，健康成年，體質(zhì)量（200±20） g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[動物許可證號：SCXK（桂）2016-0002]，根據(jù)動物倫理學(xué)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗室動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)10周后，按體質(zhì)量分級隨機分為空白組、模型組、治療組，每組13只。

1.2? 主要實驗試劑與儀器

MODELDS-671電子天平（大連星海電子衡器有限公司）;TG16-WS 臺式高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）;L-2-氯苯丙氨酸（CAS號：103616-89-3，質(zhì)量分數(shù)≥98%），購買于上海恒柏生物科技有限公司;雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）[含1%三甲基氯硅烷（TMCS），v/v]，購買自美國REGIST科技公司;Agilent 7890A氣相色譜儀（美國安捷倫科技公司）;Pegasus HT氣相氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀（美國LECO公司）;壯醫(yī)藥藥線（直徑0.7 mm，長30 cm，購買自廣西壯族自治區(qū)壯醫(yī)醫(yī)院）。

1.3? 尿酸鈉溶液制備

電子秤取1.000g微晶尿酸鈉結(jié)晶，玻璃杯碾碎后放入燒杯，加9 mL生理鹽水，再加1 mL吐溫80，加熱攪拌，配制成10 mL尿酸鈉溶液[8]。

1.4? 模型制備

采用Coderre等[8]的改良法對模型組、治療組大鼠進行造模。使用4號注射針頭的注射器將0.4 mL尿酸鈉溶液注入到大鼠的右側(cè)踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。注射部位及方法[9]：在操作臺上固定大鼠，充分暴露右后側(cè)踝關(guān)節(jié)，并將其擺放成直角后找到右后肢背側(cè)正中脛腓骨與踝關(guān)節(jié)之間的間隙，將注射器針頭傾斜45°通過此間隙插入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，將尿酸鈉混懸液注射進關(guān)節(jié)腔，以對側(cè)關(guān)節(jié)囊突出為標準。

1.5? 造模成功判定[8，10]

1.5.1? 大鼠行為? 造模前大鼠精神良好，毛色白，飲食飲水正常、體質(zhì)量正常增加，關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率為百分之百。造模后，精神欠佳，毛色發(fā)黃干枯，踝關(guān)節(jié)在炎癥高峰期可觸到痛風(fēng)結(jié)節(jié)，行動可見跛行，飲食量和飲水次數(shù)均明顯減少，體質(zhì)量增長減緩明顯。

1.5.2? 右后肢踝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)改變? 注射尿酸鈉溶液24 h后，每組隨機抽取3只大鼠進行HE染色。病理切片圖片可以看出：在光鏡下，造模后的大鼠踝關(guān)節(jié)軟組織周圍的毛細血管擴張、充血，關(guān)節(jié)滑膜增厚并伴有大量以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，局部軟組織遭到破壞，新生小血管上有較多的成骨纖維細胞形成，肉芽組織中出現(xiàn)較多的異物多核巨細胞。而正常的大鼠踝關(guān)節(jié)在光鏡下是結(jié)構(gòu)清晰、無病理性改變的，所以通過肉眼觀察和HE染色光鏡觀察，均提示造模成功[11]。

1.6? 干預(yù)方法

空白組、模型組不做任何治療性干預(yù);治療組：在腫脹的踝關(guān)節(jié)局部取老鼠造模一側(cè)踝關(guān)節(jié)上紅腫最明顯的地方作為阿是穴，常規(guī)消毒后，用5號一次性注射器針頭在該處點刺放血，放血量使用注射器吸取以精確出血量達（0.30±0.04） mL。造模12 h后每天放血1次，連續(xù)3 d。藥線點灸：刺血結(jié)束后在腫脹踝關(guān)節(jié)局部沿腫脹外圍向中心點灸，3壯，每壯相隔2 mm。連續(xù)3 d。

1.7? 步態(tài)觀察和關(guān)節(jié)腫脹度分析

1.7.1? 步態(tài)觀察? 參照步態(tài)分級標準表（見表1）[12]，對空白組、模型組、治療組進行步態(tài)觀察，并記錄。

1.7.2? 關(guān)節(jié)腫脹度觀察? 分別于造模前、造模后12、24、48、72 h用皮尺測量踝關(guān)節(jié)腫脹度（關(guān)節(jié)腫脹度=造模后關(guān)節(jié)周徑-造模前的關(guān)節(jié)周徑），取2次測量所得數(shù)值的平均值，比較各組大鼠造模前后踝關(guān)節(jié)腫脹變化程度[6]。

1.8? 尿液代謝組學(xué)檢測

1.8.1? 樣本收集? 收集24 h尿液，以8 000 r/min離心10 min，用2 mL凍存管收集上層尿液，收集完成以后及時密封置于-80 ℃的液氮罐保存，送檢。

1.8.2? 樣本處理? （1）代謝物萃?。喝?00 μL尿液樣本，加入20 μL尿素酶（80 mg/mL），振蕩混勻30 s，37 °C烘箱孵育1 h;加入0.35 mL甲醇，再加入20 μL L-2-氯苯丙氨酸，漩渦混勻30 s;將上述二者混勻后，在4 ℃，13 000 r/min的環(huán)境下離心15 min;緩慢取出0.39 mL上清液放入2 mL進樣瓶（甲烷硅基化的）中，供檢驗。（2）代謝物衍生化：將提取的代謝物放入真空濃縮器中進行干燥并提取;在干燥后的代謝物中加入80 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg/mL），輕輕混勻后，放入烘箱中80 ℃孵30 min;向每個樣品中迅速加入100 μL BSTFA（含有1% TCMS，v/v）后70 ℃孵育120 min;冷卻至室溫，向混勻的樣本中加入10 μL FAMEs（飽和脂肪酸甲酯標準混合液，溶于三氯甲烷C8-C16：1 mg/mL;C18-C24：0.5 mg/mL）;混勻，上機檢測。（3）質(zhì)譜條件：選擇不分流模式下的進樣量1 μL，初始的柱溫為60 °C保持1 min后開始以升溫速度為每分鐘10 ℃的速率上升至330 ℃，持續(xù)10 min;前進口樣的溫度保持在280 °C，傳輸藥線溫度在280 °C，離子源溫度220 °C;電離電壓：-70eV;載氣使用氦氣，前進樣口吹掃流速為3 mL/min，柱流速為1 mL/min;掃描方式為全掃描85～600 m/z，頻率保持為20 spec/s。溶劑延遲時間366 s。

1.9? 數(shù)據(jù)處理及生物標志物篩選

等級資料采用？字2檢驗;計量結(jié)果以“x±s”表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件。采用方差分析，多重兩兩比較采用LSD或SNK檢驗，方差不齊者采用 Dunnet T3法檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。代謝組學(xué)采用LECO公司的Chroma TOF4.3X軟件和LECO-FiehnRtx5數(shù)據(jù)庫對尿液質(zhì)譜圖信息進行峰匹配，峰提取及數(shù)據(jù)導(dǎo)出等處理。將上述得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件進行無監(jiān)督模式是別的主成分分析（principal component analysis， PCA）和非監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）辨別分析。通過得分圖比較各組樣本組間差異，初步判斷各組尿液代謝產(chǎn)物差異。

2 結(jié)果

2.1? 步態(tài)觀察

治療結(jié)束后對大鼠進行步態(tài)評價，模型組與空白組、治療組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.2? 關(guān)節(jié)腫脹度

通過觀察大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的改變，分析并且觀察刺血結(jié)合藥藥線點灸對關(guān)節(jié)腫脹度的緩解作用。各組大鼠造模后關(guān)節(jié)周徑均有不同程度的增加，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;造模后 12、24、48、72 h，治療組關(guān)節(jié)腫脹程度低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

2.3? 主成分分析（PCA）

PCA分析是一種無監(jiān)督的多元變量統(tǒng)計分析方法，可以從多維空間反應(yīng)各組樣本之間的代謝差異和組間樣本差異，是原始數(shù)據(jù)最初呈現(xiàn)的一種基本原始狀態(tài)。本研究取空白組、模型組、治療組大鼠治療后的24 h尿液樣本進行PCA分析。在PCA得分圖上3組的樣本點分散于不同區(qū)域，3組大鼠代謝圖譜具有明顯差異趨勢，說明本實驗造模方法可行。空白組的樣本點主要分布在第一、四象限且比較集中具有一定的聚類性，說明組內(nèi)大鼠內(nèi)源性代謝物差異較小，代謝狀態(tài)和變化趨勢相對穩(wěn)定;模型組樣本點主要分布在第二、三象限且比較分散，治療組樣本點主要分布在第二象限且較，3組樣本點無明顯的交叉和重疊。治療組大鼠代謝狀態(tài)、變化趨勢逐漸向空白組大鼠靠近。

2.4? 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）

PLS-DA是一種有監(jiān)督的多元變量統(tǒng)計分析方法，該方法與PCA相比，主要是在分析的過程中引入了一個新的變量（Y 變量），此變量具有分類信息，從而減少或刪除組內(nèi)差異對分類造成的干擾，其判別能力優(yōu)于PCA分析。本實驗使用SIMCIA-P12.0 軟件對空白組大鼠和模型組大鼠采用 PLS-DA分析法從整體上進行了尿液代謝譜數(shù)據(jù)的模式識別，同時運用響應(yīng)置換檢驗驗證模型。PLS-DA分析的得分圖和200次模型響應(yīng)置換結(jié)果。治療組與模型組的 PLS-DA 模型相關(guān)參數(shù)為：R2=0.926，Q2=0.645，得分圖中的R2值代表模型的解釋能力，Q2值代表模型的預(yù)測能力，Q2>0.5說明模型預(yù)測能力較好，模型有效;Q2>0.9說明此模型效果突出。模型響應(yīng)置換結(jié)果為：R2=0.876，Q2=

-0.262，響應(yīng)置換檢驗中的Q2<0則說明建模成功，沒有出現(xiàn)過度擬合。本實驗得分圖中各組內(nèi)的樣本點也趨于集中，空白組與模型組之間分隔更遠。通過置換檢驗，說明該模型的擬合度較好，進一步驗證了本實驗PLS-DA模型的構(gòu)建是成功的。

2.5? 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）

OPLS-DA是PLS-DA的一種衍生運算分析方法，主要結(jié)合了正交矯正信號（OSC）和PLS兩種方法，通過將X軸矩陣信息分解成與Y相關(guān)和不相關(guān)的兩類信息，能夠排除與分組不相關(guān)的一些變量，更準確的篩選出有價值的差異性變量從而使使判別能力更優(yōu)。通過OPLS-DA分析過濾掉不相關(guān)的正交信號，結(jié)合差異性變量的重要性投影值（VIP）值，從而使獲得的差異性代謝物更加可靠[9]。

本實驗對空白組、模型組、治療組大鼠進行了OPLS-DA分析，模型相關(guān)參數(shù)顯示為：R2Y=0.841，Q2=0.732，均大于0.5，說明此模型構(gòu)建成功，具有很好的擬合度和預(yù)測能力。從OPLS-DA得分圖中可以看出空白組、模型組、治療組呈現(xiàn)出明顯的區(qū)分。其中，治療組接近空白組。

2.6? 差異性代謝物的篩選及鑒定

通過上述模型的識別與分析，確定本實驗中3組大鼠尿液內(nèi)源性代謝物存在顯著的代謝差異，根據(jù)OPLS-DA分析中的VIP值顯示出各變量的VIP值。VIP值越大，說明貢獻作用越大。由于變量的平均VIP值都接近于1，故常將VIP>1的變量視為對模型具有重要意義。因此本實驗篩選出16個VIP值大于1的變量，見表4。再以VIP>1和P-value<0.05為標準，并結(jié)合載荷圖和T檢驗篩選候選變量，通過這些變量所代表的化合物的質(zhì)譜信息，從HMDB、KEGG等數(shù)據(jù)庫中查找出5個潛在生物標志物。見表5。

2.7? 潛在生物標志物的代謝途徑變化

將涉及的潛在生物標志物代入MetPA數(shù)據(jù)庫進行分析，構(gòu)建代謝通路，可知急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠涉及的代謝通路包括：三羧酸循環(huán)、丁酸代謝、谷氨酸代謝、呲哆醇代謝等13條（見表6）。代謝通路影響值的臨界點設(shè)置為>0.10，高于這個值將被選擇作為潛在的靶標路徑，丁酸代謝、三羧酸循環(huán)、半乳糖代謝，以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝這4條代謝途徑在刺血結(jié)合藥線點灸改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠內(nèi)源性代謝中起到重要作用。

3 討論

壯醫(yī)藥線灸療法是在中醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)直接灸如麥粒灸、燈火灸等基礎(chǔ)上，結(jié)合嶺南地域氣候等特點，經(jīng)嶺南壯民族長期特色醫(yī)療實踐特點加以發(fā)展起來的[12]。其綜合麥粒灸、燈火灸優(yōu)勢，再利用經(jīng)藥物浸漬后的特制苧麻線點灸相應(yīng)穴位起到更為獨特和廣泛的作用。而刺血療法又稱刺絡(luò)法、放血療法，是中醫(yī)學(xué)中最古老的治療疾病方法之一，歷代醫(yī)家多用于急證、熱證、實證，通過瀉熱排毒，疏通龍火兩路達到陰陽平衡起到治療作用[13]。付琳琳[14]等人認為此法可加快局部血液循環(huán)使關(guān)節(jié)沉積尿酸結(jié)晶代謝加快，從而緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)疼痛。

本實驗通過對3組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、步態(tài)分析及尿液PCA分析，證明刺血結(jié)合藥線點灸對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有較好療效。通過對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠尿液PCA、PLS-DA、OPLS-DA 等分析，從16種差異代謝性代謝物中篩選出5種與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的潛在生物標志物及4條最可能的代謝通路，分別是：丁酸代謝;三羧酸循環(huán);丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝;半乳糖代謝。

其中丁酸代謝通路與炎癥反應(yīng)關(guān)系最為密切，具有增強免疫力，抑制炎癥反應(yīng)，維護腸道健康的作用，可抑制內(nèi)皮細胞的活化，減少細胞間粘附分子-1、血管細胞粘附分子-1釋放[15]，從而抑制白細胞在血管內(nèi)邊集，并伸出偽足遷移至炎癥組織中[16]。同時影響補體激活，阻礙炎癥旁路途徑的激活[17]。結(jié)合本研究結(jié)果可考慮刺血結(jié)合藥線點灸通過影響模型大鼠體內(nèi)具有抗炎作用的γ-氨基丁酸，以及可降低應(yīng)激狀態(tài)中炎癥因子IL-6等水平的α-酮戊二酸，使丁酸代謝通路逐漸恢復(fù)正常，從而發(fā)揮抗炎作用，達到治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的效果。

三羧酸循環(huán)、半乳糖代謝，能反映機體能量代謝水平[18]，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎期間，模型大鼠對能量的需求大大增加，炎癥反應(yīng)明顯，機體的能量代謝異常[19]，α-酮戊二酸、檸檬酸、半乳糖苷1的含量升高，肌醇下降，導(dǎo)致三羧酸循環(huán)、半乳糖代謝發(fā)生障礙，而當大鼠經(jīng)過刺血結(jié)合藥線點灸治療后，尿液中的α-酮戊二酸、檸檬酸、半乳糖苷1，的含量開始向正常值回調(diào)，體內(nèi)異常的三羧酸循環(huán)開始恢復(fù)正常，機體的能量代謝趨向于恢復(fù)正常，炎性癥狀得到緩解、疼痛減輕。

丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝可刺激機體內(nèi)的谷氨酰胺（合成γ-氨基丁酸的重要原料）生成增多。在治療組大鼠接受刺血結(jié)合藥線點灸治療后，其尿液代謝物中的γ-氨基丁酸的含量與模型組相比下降，而γ-氨基丁酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能通過調(diào)Ca2+通道，減少神經(jīng)末梢遞質(zhì)釋放，減輕痛覺[20]?？沙醪酵茢啻萄Y(jié)合藥藥線點灸療法通過降低機體中γ-氨基丁酸的表達，從而減少谷氨酰胺合成，使異常的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝逐漸恢復(fù)正常。

綜上所述，本實驗通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠尿液進行代謝組學(xué)分析，說明這幾種內(nèi)源性物質(zhì)與人體代謝機制聯(lián)系較為緊密。一定程度上反映急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)代謝水平的變化，為監(jiān)測疾病生理狀態(tài)下體內(nèi)代謝物的變化和痛風(fēng)發(fā)作的預(yù)防和改善提供一定依據(jù)，為刺血結(jié)合壯藥藥線點灸對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠作用機制的深入研究奠定了一定基礎(chǔ)，從而促進民族醫(yī)藥外治法發(fā)展。

參考文獻

[1] 曾小峰，陳耀龍.2016中國痛風(fēng)診療指南[J].浙江醫(yī)學(xué)，2017，39（21）：1823-1832.

[2] VINOLO M A， RODRIGUES H G， NACHBAR R T， et al. Regulation of inflammation by short chain fatty acids [J]. Nutrients， 2011， 3（10）： 858-76.

[3] 李迎春，徐建華.急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制及研究進展[J]，安徽醫(yī)學(xué)，2013，34（1）：96-98.

[4] 廖子龍，陳日蘭，朱? 英，黃琪琳，等.不同壯醫(yī)療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床療效對比研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2014，33（20）：92-93.

[5] 李鳳珍，鐘麗雁，梁? 艷，等.壯醫(yī)刺血療法治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的臨床研究[J].中醫(yī)學(xué)報，2014，29（1）：134-136.

[6] 朱? 英，陳日蘭，龐學(xué)豐，等.刺絡(luò)放血結(jié)合壯醫(yī)藥藥線點灸治療痛風(fēng)急性關(guān)節(jié)炎期的觀察[J].廣西中醫(yī)藥，2010，33（4）：8-10.

[7] 李倩倩，劉秋萍，韋雙雙，等.代謝組學(xué)在痛風(fēng)中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用[J].中國中醫(yī)急癥，2017，26（8）：1405-1408.

[8] CODERRE T J， WALL P D. Ankle joint arthritis in rats provide a useful tool for the evaluation of analgesic and anti-arthritic agents[J]. Pharmacology Biochemistry & Behavior， 1988，29（3）：261.

[9] CODERRE T J， WALL P D. Ankle joint urate arthritis in rats： an alternative animal model of arthritis to that produced by Freund's adjuvant[J]. Pain，1987，28（3）：379-393.

[10] 梁? 莎，夏有兵，朱? 毅，等.急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠局部造模方法的改良[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（2）：10-13.

[11] 曹燕亞，郭瑞新.尿酸鹽致大鼠痛風(fēng)模型的制備[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2011，25（1）：32-33.

[12] 黃瑾明.壯醫(yī)藥線點灸療法[M].廣西：廣西人民出版社，1986：23.

[13] 呂凱露，夏有兵，程? 潔，等.刺血療法對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠局部IL-1β、IL-10啟動子甲基化的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，33（5）：509-514.

[14] 付琳琳.放血療法緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的臨床觀察[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2016.2-4.

[15] MENZEL T， LUHRS H， ZIRLIK S， et al. Butyrate Inhibit s Leukocyte Adhesion to Endothelial Cells Via Modulation of VCAM-1[J]. Inflammatory Bowel Diseases， 2004，10（2）：122-128.

[16] ZAPOLSKA-DOWNAR D， SIENNICKA A， KACZMARCZYK M， et al. Butyrate inhibits cytokine-induced VCAM-1 and ICAM-1 expression in cultured endothelial cells： the role of NF-kappaB and PPA Ralpha[J]. Journal of Nutritional Biochemistry， 2004，15（4）：220-228.

[17] ANDOH A， TSUJIKAWA T， FUJIYAMA Y， et al. Role of Dietary Fiber and Short-chain Fatty Acids in the Colon[J]. Current Pharmaceutical Design， 2003，9（4）：347-358.

[18] PUERTOLLANO E， KOLIDA S， YAQOOB P. Biological significance of short-chain fatty acid metabolism by the intestinal microbiome[J]. Current Opinion in Clinical Nutrition & Metabolic Care， 2014，17（2）：139-144.

[19] STEMPELJ M， KEDINGER M， AUGENLICHT L， et al. Essential role of the JAK/STAT1 signaling pathway in the expression of inducible nitric-oxide synthase in intestinal epithelial cells and its regulation by butyrate[J]. Journal of Biological Chemistry， 2007，282（13）：9797-9804.

[20] ZIMMERMAN M A， SINGH N， MARTIN P M， et al. Butyrate suppresses colonic inflammation through HDAC1-dependent Fasupregulation and Fas-mediated apoptosis of T cells[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol， 2012，302（12）： G1405-G1415.