活血散結方含藥血漿對視網膜色素上皮細胞毒性作用的研究

潘坤 彭俊 吳佳敏 張又瑋 李建超 吳權龍 彭清華

〔摘要〕 目的 制備活血散結方含藥血漿，并研究其不同濃度對視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞的毒性作用。方法 以成年健康家兔為對象，制備活血散結方含藥血漿。將提取的兔原代RPE細胞分9個組，分別為：空白對照組、正常血漿組、5%含藥血漿組、10%含藥血漿組、20%含藥血漿組、40%含藥血漿組、60%含藥血漿組、80%含藥血漿組、100%含藥血漿組，予以相對應濃度的含藥血漿干預，CCK8法檢測含藥血漿對兔RPE細胞毒作用。結果 活血散結方各濃度含藥血漿對RPE細胞有抑制作用，其中5%～20%含藥血漿對RPE細胞有較弱的抑制作用，但與正常血漿比較，抑制率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;而40%～100%含藥血漿對RPE細胞生長有明顯的抑制作用，與正常血漿比較，抑制率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 活血散結方含藥血漿對RPE細胞有一定的抑制作用，抑制程度與含藥血漿濃度成量效關系，可以考慮選擇5%～20%含藥血漿濃度作為后續(xù)實驗研究的干預濃度。

〔關鍵詞〕 活血散結方;視網膜色素上皮細胞;細胞毒性;含藥血漿

〔中圖分類號〕R285.5;R276.7? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.003

增生性玻璃體視網膜病變（proiiferative vitreoretinopathy，PVR）是孔源性視網膜脫離、糖尿病視網膜病變、玻璃體出血以及眼球后段穿通傷等眼底疾病的嚴重并發(fā)癥，目前該病的發(fā)病率在逐年增加[1-3]。PVR的基本病理生理過程主要涉及細胞增生、細胞外基質（extracellular matrix， ECM）的合成和膜的收縮[4]。視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞在PVR的發(fā)生和發(fā)展過程中起關鍵作用，是重要的介導細胞，也是目前建立PVR模型的主要細胞[5]。目前許多學者提出使用藥物預防PVR的發(fā)展，主要目的在于抗增殖及炎癥[6]，而這些藥物例如秋水仙堿、5-氟尿嘧啶、地塞米松等，或處于實驗臨床階段，或因其藥物毒性、長期并發(fā)癥等原因，真正應用于臨床的很少，故尚無作為防治PVR的臨床常規(guī)藥物[7]。近年來，許多報道中藥及其制劑防治PVR己取得不錯療效[8-12]。湖南中醫(yī)藥大學彭清華教授從中醫(yī)學對PVR的認識及多年來的臨床經驗出發(fā)，在眼科水血同治的原則和基礎上，提出活血散結方，已取得良好的療效。本文將探討不同濃度活血散結方含藥血漿對兔RPE細胞活性的影響。

1 材料

1.1? 實驗動物

成年健康無眼疾青紫藍兔4只，雌雄不限，體質量1.5～2.0 kg，由上海市松江區(qū)車墩實驗動物良種場提供，動物許可證號：SXCK（滬）2012-0008。實驗前行常規(guī)眼科檢查（裂隙燈、間接眼底鏡），排除眼內外疾患方進入實驗。含藥血漿制備：成年健康家兔8只，雌雄兼用，體質量1.5～2.0 kg，由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK（湘）2015-0004。常規(guī)喂養(yǎng)，控制室溫20～26 ℃，保持空氣流通，相對濕度55%左右，實驗前所有動物適應性飼養(yǎng)1周。

1.2? 藥物制備

活血散結方：由三七、丹參、海藻、昆布、鱉甲、地龍配伍組成，飲片由湖南中醫(yī)藥大第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。采用水煎法，分煎2次后混合藥液濃縮至1.025 g/mL生藥濃度，4 ℃以下保存。

1.3? 試劑及儀器

1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）;胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）;胰蛋白酶（美國GIBCO公司）;D-Hank液（美國GIBCO公司）;聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X 100，上海索萊寶公司）;熒光封片劑（Fluoromount-G，上海索萊寶公司）;小鼠抗兔廣譜細胞角蛋白（南京vazyme公司）;羊抗兔Alexa Fluor 488（南京vazyme公司）;細胞增殖與毒性檢測試劑盒（七海生物公司）。CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司3111）;倒置顯微鏡（德國Motic公司 AE31）;酶標儀（美國Bio-tek公司ELX800）。

2 方法

2.1? 活血散結方含藥血漿的制備

采用隨機數字法將家兔分為活血散結方組、空白組，每組4只。根據人與家兔體表面積換算方法計算（人以60 kg體質量為標準，家兔以1.6 kg體質量為標準），按等效劑量換算法換算家兔活血散結方組的等效臨床劑量為20.256 g/kg≈20.3 g/kg?？瞻捉M灌服蒸餾水，均為每日20 mL/kg灌胃，分早晚兩次灌服，連續(xù)灌胃5 d。采血前禁食禁水12 h，末次給藥2 h后，無菌條件下腹主動脈取血，收集血液于含3.2%枸緣酸鈉1∶9真空采血管內，顛倒混勻后靜置。在3 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液即為含藥血漿。0.22 μm膜濾過分裝，置于-70 ℃超低溫冰箱保存。

2.2? 兔原代RPE細胞的培養(yǎng)

采用酶消化法獲取兔原代RPE細胞[13]。取青紫藍兔耳緣靜脈處空氣栓塞法處死，無菌操作條件下摘除眼球，去凈眼球表面筋膜，生理鹽水充分沖洗，鞏膜穿刺刀沿鋸齒緣后2 mm處刺入，用顯微剪環(huán)形剪開眼球前段，去除角膜、晶狀體以及玻璃體，由視網膜周邊至視乳頭方向輕輕去除視網膜神經上皮層。將眼杯置于眼球托上，7-0線在四個方向縫合固定眼杯，PBS沖洗。滴加胰蛋白酶，放置細菌培養(yǎng)箱中消化30 min，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止反應。用吸管輕輕吹打眼球內壁使RPE細胞脫落分散，收集眼杯中細胞懸液于離心管中。胰酶消化，離心，棄去上清液，加入10%胎牛培養(yǎng)基將細胞吹打分散，將RPE細胞調整為4×104～5×104個/mL細胞的密度，并接種于25 mL培養(yǎng)瓶，在37 ℃、5%CO2和相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后每3天更換培養(yǎng)液，直到細胞融合。當細胞貼壁鋪滿大部分瓶底即可進行傳代培養(yǎng)。

2.3? 兔原代RPE細胞的鑒定

Cytokeratin-8特異性抗體免疫熒光法[14]進行鑒定。將四片玻璃片蓋于24孔板，每孔加1 mL培養(yǎng)基，取上述“2.2”對數生長期第2代細胞約5×104個/mL細胞進行爬片，置培養(yǎng)箱過夜。待細胞鋪平貼壁后，用4%PFA于室溫固定30 min。取50 μL破膜封閉液于防水膜上，蓋于細胞上，室溫放置1 h。取50 μL小鼠抗兔廣譜細胞角蛋白一抗滴于防水膜上，蓋于細胞上，放置4 ℃環(huán)境下過夜。將玻片取出用PBS沖洗。取羊抗兔二抗，滴50 μL于防水膜上，蓋于細胞上，室溫放置2 h，操作過程注意避光并保持細胞濕潤。2 h后將玻片用PBS沖洗，吸干多余水分，封片并于熒光顯微鏡下進行觀察。

2.4? CCK8法檢測活血散結方含藥血漿對兔RPE細胞的毒性作用

取96孔板培養(yǎng)板，平行接種9組：空白對照組、正常血漿組、5%含藥血漿組、10%含藥血漿組、20%含藥血漿組、40%含藥血漿組、60%含藥血漿組、80%含藥血漿組、100%含藥血漿組，每組各設5個復孔。收集對數期RPE細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 μL，5%CO2、37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加入用無血清培養(yǎng)基配制的不同濃度的含藥血漿，培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL試劑盒中7sea-cell counting kit溶液，同步設調零孔，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標儀檢測450 nm處的吸光值（OD），并計算。

細胞增殖抑制率=[1-（實驗組OD值/空白組OD值）]×100%。

2.5? 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對所有數據資料進行統(tǒng)計學分析，計量資料以“x±s”表示。行ANOVA單因素方差分析，樣本間的兩兩比較用LSD檢驗或者Dunnett檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1? 兔RPE細胞鑒定

Cytokeratin-8特異性抗體免疫熒光法結果顯示：熒光顯微鏡下觀察RPE細胞，熒光遍及胞質，細胞角蛋白染色呈強陽性。

3.2? 含藥血漿對RPE細胞生長情況的影響

倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，空白對照組與正常血漿組細胞分布較為密集，實驗各組中5%～20%含藥血漿組細胞與正常組相比，細胞密度無明顯減小;而40%～100%含藥血漿各組細胞活性受到一定的抑制，細胞密度減小，并呈一定的量效關系。

3.3? CCK8法檢測活血散結方含藥血漿對兔RPE細胞的毒性作用

如表1所示，含藥血漿干預RPE細胞48 h后細胞毒性檢測結果顯示為5%～20%的含藥血漿組細胞活力OD值與正常組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），40%～100%的含藥血漿各組細胞活力OD值與正常血漿組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

4 討論

中醫(yī)學文獻對PVR無相應病名的記載，缺乏對其病機的闡述，因其為有形之物，類似中醫(yī)學“積聚”范疇，又因PVR各階段癥狀差異，可歸屬于“暴盲”“云霧移睛”和“視瞻昏渺”范疇[15]。目前研究認為該病與“癥瘕”的病理病機相似[16]，與肝腎脾三臟密切相關[17]，同時彭清華教授還提出外傷PVR的病機為血水互結[18]?；钛⒔Y方由三七、丹參、鱉甲、地龍、昆布、海藻等中草藥組成，方中三七化瘀止血活血，丹參活血祛瘀，入肝經血分，二藥合用活血化瘀，共為君藥;鱉甲軟堅散結，入肝腎兩經，與君藥合用加強活血化瘀散結之功，為方中臣藥;地龍通行經絡，清熱利水，昆布、海藻消痰軟堅，利水消腫，入肝腎兩經，三藥合用助化痰軟堅，利水散結之功。全方共奏活血化瘀、軟堅散結之功，使眼內瘀血痰結之有形之物利散，改善眼底情況提高患者視功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)活血散結方中中藥多具有抗凝、抗纖維、抑制細胞異常增殖的作用[10，19]。

有研究表明，血漿藥理學的半體內實驗及體外細胞實驗是目前中藥復方藥理機制有效的研究方式[20]。本研究采取血漿藥理學方法[21]，不同濃度活血散結方含藥血漿干預RPE細胞48 h后檢測細胞毒性。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)5%～20%含藥血漿干預的RPE細胞密度變化不大，而40%～100%含藥血漿干預下的RPE細胞受到一定的抑制，細胞密度下降;CCK8法檢測顯示含藥血漿對RPE細胞均有不同程度的抑制作用，且存在一定量效關系（正相關），其中5%～20%含藥血漿對細胞有較弱的抑制作用，與正常血漿組比較，抑制率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;而40%～100%含藥血漿對細胞生長有明顯的抑制作用，與正常血漿比較，抑制率差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。綜合考慮，活血散結方含藥血漿可以一定程度抑制RPE細胞，可選擇抑制率較低的5%～20%含藥血漿濃度作為后續(xù)研究的干預濃度，進一步探討PVR發(fā)生、發(fā)展過程中RPE細胞的作用機制。

參考文獻

[1] 薛曉輝.VEGF和bFGF在增生性玻璃體視網膜病變患者玻璃體中的表達及意義[J].陜西醫(yī)學雜志，2016，45（6）：707-708，719.

[2] 董尼娜.干擾素-γ聯(lián)合曲安奈德防治兔增生性玻璃體視網膜病變的實驗研究[D].鄭州：鄭州大學，2014.

[3] 陶? 勇，姜燕榮，高新曉.外傷性視網膜脫離眼發(fā)生嚴重增生性玻璃體視網膜病變的危險因素研究[J].眼科新進展，2009，29（8）：594-596.

[4] 孫? 蕾.靶向PDGF-A RNA干涉抑制增生性玻璃體視網膜病變中RPE細胞增殖的實驗研究[D].長春：吉林大學，2008.

[5] 李蘭根，偉? 偉，張玉鳳，等.視網膜色素上皮細胞氧化應激過程中SirT1/STAT3的相互作用[J].眼科新進展，2017，37（12）：1-3.

[6] 路永珩，鄭? 軼.增生性玻璃體視網膜病變發(fā)病機制與治療的研究進展[J].醫(yī)學綜述，2018，24（13）：2548-2552.

[7] 焦明菲，顏? 華.增生性玻璃體視網膜病變的藥物治療[J].眼科研究，2010，28（4）：381-384.

[8] 陳? 吉，彭清華，邢雁飛，等.散血明目片對外傷性增生性玻璃體視網膜病變兔眼玻璃體結締組織生長因子的影響[J].中國中醫(yī)眼科雜志，2006，16（4）：224-227.

[9] 張亞妮.散結明目片對兔視網膜保護及抗增殖作用的實驗研究[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學，2010.

[10] 彭清華，劉? 娉，彭? 俊，等.益氣養(yǎng)陰活血利水中藥復方對兔視網膜脫離后視網膜組織中ATP含量的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2016，36（7）：28-30.

[11] 肖? 華，范欽華.中藥干預對防治增生性玻璃體視網膜病變的基礎研究[J].四川中醫(yī)，2013，31（11）：156-158.

[12] 王文麗.海昆化瘀片調控RPE誘導的增生性玻璃體視網膜病變TGF-β表達的研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學：2013.

[13] XU G X， YANG J， SUN T S， et al. Primary culture of human retinal pigment epithelium in vitro[J]. International Journal of Ophthalmology， 2004， 4（1）：12-15.

[14] 胡健艷，陳? 雪，陳? 輝，等.兔視網膜色素上皮細胞培養(yǎng)和鑒定[J].南通大學學報，2005，25（3）：171-173.

[15] 彭清華，彭? 俊.暴盲病名沿革及分化[J].中華中醫(yī)藥學刊，2010，28（9）：1812-1813.

[16] 王文麗，葉河江，張曉婷，等.從眼內癥瘕論治增生性玻璃體視網膜病變[J].四川中醫(yī)，2013，31（4）：33-34.

[17] 吳要華.化瘀散結片對DispaseI誘導的實驗性增生性玻璃體視網膜病變müller細胞的影響[D].成都：成都中醫(yī)藥大學，2013.

[18] 付美林，彭清華，陳? 吉，等.活血利水法對兔外傷性PVR增殖膜上EGFmRNA表達的影響[J].國際眼科雜志，2012，12（1）：25-29.

[19] 余? 肖.三七對防治外傷性增生性玻璃體視網膜病變的實驗研究[D].南京：南京中醫(yī)藥大學，2014.

[20] 林澤苗，鐘佳賢，李青南.中藥血清藥理學和血漿藥理學應用比較研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2016，12（12）：62-64.

[21] 劉? 林.中藥含藥血漿與血清有效成分比較及血漿藥理學方法研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2016.