熱應(yīng)激前后湖羊下丘腦差異表達新基因的篩選與注釋

李隱俠　馮小品　張莉　張俊　錢勇　孟春花　王慧利　仲躋峰　曹少先

摘要：湖羊是中國南方唯一的綿羊品種，耐濕熱是其重要的特色性狀之一。但目前關(guān)于其耐濕熱機制尚不清楚。本研究以湖羊為研究對象，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)鑒定熱應(yīng)激前后下丘腦組織中的新基因及其差異表達，并通過不同數(shù)據(jù)庫比對和分析，進行新基因功能注釋。結(jié)果表明，熱應(yīng)激前后在湖羊下丘腦組織中共檢測到1990個新轉(zhuǎn)錄本，通過功能注釋，發(fā)現(xiàn)1344個新基因。在熱應(yīng)激組和對照組湖羊中，差異表達新基因186個，其中130個新基因表達上調(diào)，56個新基因表達下調(diào)，通過比對發(fā)現(xiàn)這些基因分別與細胞免疫、繁殖、生長代謝及相關(guān)信號通路相關(guān)。Real-time PCR驗證試驗結(jié)果表明，10個熱應(yīng)激前后表達差異基因中有9個與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。這些結(jié)果為綿羊基因組的進一步完善及基因功能的挖掘提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為全面解析綿羊熱應(yīng)激的分子機制提供更多的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：湖羊;熱應(yīng)激;下丘腦;轉(zhuǎn)錄組測序;real-time PCR

中圖分類號：Q781

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0363-07

熱應(yīng)激是指高溫環(huán)境下，動物機體對熱環(huán)境刺激產(chǎn)生的非特異性生理反應(yīng)的總稱。研究結(jié)果表明，影響家畜生產(chǎn)性能的主要環(huán)境因素有溫度、濕度、太陽輻射和風(fēng)速[2]，在以高太陽輻射和高溫著稱的熱帶地區(qū)，熱應(yīng)激是一個限制動物發(fā)育和生產(chǎn)的主要因素[3]。研究結(jié)果表明，急性熱應(yīng)激使雞生長性能下降，營養(yǎng)成分重分配，脂肪沉積增加[4-5];高溫環(huán)境破壞蛋雞內(nèi)分泌系統(tǒng)進而妨礙生殖活動[6];熱應(yīng)激影響綿羊的產(chǎn)奶量和繁殖性能[7-8]。

熱應(yīng)激原因很簡單，但其影響和調(diào)控機制到目前為止尚不清楚。通過垂體將神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)連接起來的下丘腦組織是一個調(diào)節(jié)體溫的關(guān)鍵中樞[9]。眾所周知，下丘腦的前視區(qū)（POA）和前下丘腦區(qū)（AH）是體溫調(diào)節(jié)中心，下丘腦區(qū)域如室旁下丘腦核（PVN）、視神經(jīng)核（SO）和外側(cè)下丘腦在熱應(yīng)激狀態(tài)下被激活。熱應(yīng)激狀態(tài)下，下丘腦通過下丘腦-垂體-腎上腺軸、交感神經(jīng)系統(tǒng)和其他神經(jīng)內(nèi)分泌途徑保存或者消散熱量，從而調(diào)節(jié)動物體溫[10]。

湖羊是中國南方主要的綿羊品種，具有非常重要的優(yōu)良特性，在中國低繁殖力綿羊品種遺傳改良和新品系培育中做出了一定的貢獻，其中耐濕熱是眾多優(yōu)良特性之一。本研究以湖羊下丘腦組織為研究對象，在熱應(yīng)激狀態(tài)和非熱應(yīng)激狀態(tài)下，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)、參考基因組比對技術(shù)挖掘湖羊新轉(zhuǎn)錄本，解析調(diào)控湖羊熱應(yīng)激的差異表達新基因，并進行功能注釋，為進一步解析熱應(yīng)激調(diào)控的分子機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

一周歲健康、體質(zhì)量[（33.00+1.58）kg]相近的湖羊母羊6只，急性熱應(yīng)激組和對照組各3只，自由采食和飲水。急性熱應(yīng)激組溫度42℃ 左右4 h，熱應(yīng)激模型和溫度參照文獻[11];對照組溫度22℃ 左右。基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見文獻[12]。

1.2 樣品采集及RNA提取

熱應(yīng)激組和對照組湖羊處理后立即屠宰，取完整的下丘腦組織置于液氮中貯存。在液氮中將整個下丘腦組織研磨完全，用Trizol 法提取總RNA，并分別采用Nanodrop、Qubit 2.0和Agilent 2100方法檢測RNA樣品的純度、濃度和完整度等，符合測序要求的RNA送往北京百邁客生物科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 cDNA文庫構(gòu)建和測序

使用NEBNext UltraTM RNA文庫試劑盒（NEB，美國），按照其說明書進行文庫構(gòu)建，具體步驟參照文獻[13]。應(yīng)用llumina Hiseq 2500高通量測序平臺對構(gòu)建的eDNA文庫進行測序，測序讀取長度為125 bp（雙末端測序）。

1.4 RNA-seq分析

將原始數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)過濾獲得高質(zhì)量的Cleandata，利用TopHat2將Clean reads 與參考基因組進行序列比對，并統(tǒng)計比對效率。使用Cufflinks軟件對新轉(zhuǎn)錄本和新基因的表達水平進行定量。同時對差異表達基因（DEG）進行統(tǒng)計，以差異倍數(shù)（FC）≥2且錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.01為標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 功能注釋

使用BLAST軟件將差異表達新基因與Nr、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、KEGG數(shù)據(jù)庫進行序列比對，使用KOBAS2.0得到新基因的KEGG orthology結(jié)果，預(yù)測完新基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列后使用HMMER軟件與Pfam數(shù)據(jù)庫比對，獲得新基因的注釋信息。

1.6 Real-time PCR

以轉(zhuǎn)錄組測序相對應(yīng)的RNA為模板，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Real-time PCR反應(yīng)體系為2.0 μleDNA模板，10 U的上下游引物各0.4 μl，2 ChamQ SYBR qPCR Master Mix10.0 μl。反應(yīng)程序為95℃ 預(yù)變性30s;95℃ 10s，60℃ 30s，40個循環(huán);95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。每個樣本重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)結(jié)果

完成6只湖羊下丘腦組織的轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得48.66 Gb Clean data，Q30堿基百分比在89.79%以上，得到大量高質(zhì)量原始數(shù)據(jù)。分別將各樣本的Cleanreads與綿羊參考基因組進行序列比對，比對效率從65.05%到71.20%不等。

2.2 新基因預(yù)測及數(shù)據(jù)庫注釋

通過與綿羊參考基因組（Oar_v4.0）進行序列比對，在2組湖羊下丘腦組織中共檢測到1990個新基因，其中綿羊以外數(shù)據(jù)庫被注釋的新基因為1344個。新基因在不同數(shù)據(jù)庫中進行注釋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nr數(shù)據(jù)庫新基因數(shù)量最多，達1342個，而COG數(shù)據(jù)庫注釋的新基因數(shù)量最少，為78個（表1）。Nr數(shù)據(jù)庫中新基因同源物種分布結(jié)果顯示約99.98%新轉(zhuǎn)錄本注釋到最高的10個物種（圖1），即牛（Bostaurus）（31.22%）、野牦牛（Bos mutus）（21.16%）、綿羊（Ovisaries）（13.34%）、中國水牛（Bubalus bubalis）（5.51%）、山羊（Capra hircus）（5.44%）、藏羚羊（Pantholops hodgsonii）（4.84%）、野牛（Bison bison）（3.87%）、黑狐（Pteropus alecto）（1.12%）、海豚（Tursiops truncatus）（1.04%）和豬（Sus scrofa）（0.89%）。

2.3 新基因GO分類

GO分類發(fā)現(xiàn)690個新基因分別分類到50個基因本體（GO）條目中，細胞組分19個、分子功能13個和生物學(xué)過程18個（圖2），其中動物生長、繁殖、免疫系統(tǒng)、代謝及信號通路等生物學(xué)過程新基因所占比例最大，細胞組分次之，分子功能最少。

2.4 熱應(yīng)激前后差異表達新基因的篩選和注釋

對熱應(yīng)激和對照組湖羊的下丘腦組織差異表達新基因進行篩選。結(jié)果表明，兩組間共有186個新基因表達差異顯著，其中上調(diào)基因130個，下調(diào)基因56個。186個新基因只有146個在不同數(shù)據(jù)庫中被注釋，其中在Nr數(shù)據(jù)庫中被注釋的差異表達新基因數(shù)目最多（146個），在COG數(shù)據(jù)庫中最少（6個）（表2）。

45個差異表達新基因參與到65個信號通路，包含氧化磷酸化、MAPK信號通路、鈣信號通路、代謝通路等。根據(jù)GO分類注釋信息發(fā)現(xiàn)，其中參與湖羊生長調(diào)控的新基因有4個，參與繁殖調(diào)控的新基因有1個，參與免疫調(diào)控的新基因有2個，參與代謝調(diào)控的新基因有9個，參與氧化應(yīng)激調(diào)控的新基因有21個，對應(yīng)新基因編號及參與功能見表3。

2.5 熱應(yīng)激前后差異表達新基因的Real-time PCR驗證

為了進一步確認轉(zhuǎn)錄組測序得到的差異表達新基因在熱應(yīng)激前后表達量差異，設(shè)計12對引物（表4），以熱應(yīng)激前后湖羊下丘腦組織cDNA為模板，Real-time PCR驗證熱應(yīng)激前后基因表達差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10個表達有差異的新基因組中，9個基因的驗證結(jié)果都與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致，Ovis_aries_newGene_12971基因轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示熱應(yīng)激后該基因表達量顯著下降，而Real-time PCR結(jié)果顯示該基因熱應(yīng)激后表達量下降，但是未達到顯著水平（圖3）。轉(zhuǎn)錄組測序熱應(yīng)激前后基因表達差異與Real-time PCR驗證熱應(yīng)激前后基因表達差異比較見表5。

3 討論

Marai等[13]根據(jù)溫濕指數(shù)（THI）將熱應(yīng)激劃分為不同的等級：22.2～23.3是普通熱應(yīng)激、23.4～25.6為嚴重?zé)釕?yīng)激>25.6屬于極嚴重?zé)釕?yīng)激。研究結(jié)果表明不同動物誘發(fā)熱應(yīng)激的溫度不同，對于羊而言，通常認為羊的臨界溫度為25～30℃ ，當(dāng)綿羊暴露于超過30℃時被認為發(fā)生熱應(yīng)激[14]。Srikandakumar等[15]在溫度為35.5～43.9℃ 時發(fā)現(xiàn)白毛澳大利亞美利奴產(chǎn)生熱應(yīng)激，呼吸頻率上升到每1min128次。DaCosta等在溫度為24～45℃ 的氣候室中觀察32只Polwarth母羊在不同級別熱應(yīng)激條件下飲食、反芻情況[11]。本研究根據(jù)Srikandaku-mar[15]和DaCosta[11]的研究模型選擇熱應(yīng)激時間和溫度對湖羊進行熱應(yīng)激研究。通過對對照組和熱應(yīng)激組湖羊下丘腦組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，與之前的綿羊參考基因組序列相比，共檢測到1990個新轉(zhuǎn)錄本，其中有數(shù)據(jù)庫注釋的基因1344個。這些新轉(zhuǎn)錄本比對到GO、Nr、Swiss-Prot、KEGG數(shù)據(jù)庫的數(shù)量分別為689、1344、347和537，與這些數(shù)據(jù)庫的成功比對為進一步證實這些新基因的存在提供了理論依據(jù)。同源物種比對分析發(fā)現(xiàn)，與牛的相似基因最多（31.22%），與綿羊的相似基因為13.34%，此結(jié)果一方面表明同為反芻動物的牛和羊在基因組序列中的高度保守性[1617]，同時也表明現(xiàn)有的綿羊參考基因組的不完整性，本研究鑒定的綿羊新基因?qū)M一步完善綿羊參考基因組具有非常重要的意義。

研究結(jié)果表明，當(dāng)動物經(jīng)歷熱應(yīng)激后，動物體溫上升，從而觸發(fā)進化保守的能調(diào)控多個細胞活性的熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)調(diào)節(jié)基因，包括蛋白折疊、蛋白講解轉(zhuǎn)運、代謝、DNA修復(fù)和復(fù)制等變化[1819]，調(diào)控相關(guān)基因通路的變化，進而調(diào)控機體的氧化應(yīng)激[20]、生長[21]、繁殖[22]、代謝[23].免疫[24]等。本研究結(jié)果經(jīng)過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激前后差異表達的新基因中有45個新基因參與到65個信號通路，包含氧化磷酸化、MAPK信號通路，鈣信號通路、代謝通路等。研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激能激活MAPK信號通路，進而阻斷細胞生長和引發(fā)凋亡[25]，同時發(fā)現(xiàn)其參與熱應(yīng)激誘導(dǎo)的精子損傷[26]，進而調(diào)控動物的繁殖。根據(jù)GO分類注釋信息，發(fā)現(xiàn)參與湖羊生長調(diào)控的新基因有4個，參與繁殖調(diào)控的新基因有1個，參與免疫調(diào)控的新基因有2個，參與代謝調(diào)控的新基因有9個，參與氧化應(yīng)激調(diào)控的新基因有21個。該結(jié)果表明，存在潛在的新基因，其在湖羊熱應(yīng)激后參與調(diào)控湖羊生長、繁殖、免疫、代謝和氧化應(yīng)激等功能。

本試驗對湖羊熱應(yīng)激前后下丘腦組織差異表達新基因進行GO功能分類和信號通路分析，有助于進一步解析調(diào)控湖羊熱應(yīng)激的分子機制，為盡早挖掘出完備的湖羊耐濕熱特性的分子機理提供依據(jù)。

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