核桃細菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及特征分析

祝友朋　韓長志　熊智

摘要：核桃細菌性黑斑病嚴重影響著核桃的產(chǎn)量和品質(zhì)，是核桃生產(chǎn)過程中危害較為嚴重的病害之一。植物病原真菌、細菌以及卵菌的分泌蛋白質(zhì)在其致病過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究以核桃細菌性黑斑病菌CFBP2528CFBP7179、CFBP8253、DW3F3.JI303、NCPPB1447、Xaj4177個菌株分泌蛋白質(zhì)氨基酸序列為基礎數(shù)據(jù)，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、PHD、Protscale、TargetP1.1Server、SMART等網(wǎng)站在線預測分析其理化性質(zhì)、二級結構、疏水性、轉運肽及保守結構域等性質(zhì)，明確核桃細菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)所具有的特征。結果表明，在所分析的7個菌株520個分泌蛋白質(zhì)中，分泌蛋白質(zhì)的理論等電點集中在6.01～7.00，蛋白質(zhì)數(shù)量所占比例為26.92%;不穩(wěn)定性系數(shù)集中在20.01～40.00，其蛋白質(zhì)數(shù)量所占比例為63.65%;親水值小于0的蛋白質(zhì)數(shù)量所占比例為76.51%，親水性最強的氨基酸殘基中數(shù)量最多的是D，所占比例為13.64%，疏水性最強的氨基酸殘基中數(shù)量最多的是L，所占比例為29.58%;分泌蛋白質(zhì)均含有無規(guī)則卷曲、a螺旋、β折疊、TM（跨膜螺旋）二級結構，其所占比例分別為27.56%、27.17%、26.45%、1.03%;轉運肽集中在分泌通路，其所占比例為95.38%;每個菌株平均有16個分泌蛋白質(zhì)具有保守結構域，所占比例為21.35%。上述研究結果為深入解析核桃細菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)的功能冗余性和多樣性奠定了基礎。

關鍵詞：核桃細菌性黑斑病菌;分泌蛋白;理化性質(zhì);生物信息學分析

中圖分類號：S664.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0295-07

核桃作為中國第一大干果樹種，其在經(jīng)濟林產(chǎn)業(yè)服務國家經(jīng)濟發(fā)展和生態(tài)保障方面發(fā)揮著重要作用，目前，中國在核桃種植面積和產(chǎn)量方面均居世界第一，作為核桃的種植面積（2.87x106 hm2）、產(chǎn)量（1.15x106t）、產(chǎn)值（3.15x1010元）均居全國之首的重要省份——云南省，近些年，大力發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè)[1]。云南省129個縣（市、區(qū)）中90%以上種植核桃，核桃產(chǎn)業(yè)已惠及2.6x106多名山區(qū)群眾，成為云南省覆蓋面最廣，匯集群眾最多，持續(xù)發(fā)展?jié)摿ψ畲蟮母咴厣a(chǎn)業(yè)之一。然而，近些年對中國核桃第一州（市）——云南省大理州核桃主要生產(chǎn)區(qū)開展核桃病害調(diào)研，發(fā)現(xiàn)核桃炭疽病、核桃細菌性黑斑病等病害發(fā)生日益嚴重[2-3]。

學術界有關核桃細菌性黑斑病菌的報道尤以核桃黃單胞桿菌（Xanthomonas arboricola pv. juglandis）報道為主（46]，受該病菌侵染的核桃，果實容易腐爛、早落，出仁率和含油率均降低，核桃品質(zhì)下降并減產(chǎn)，嚴重時落果率高達60%～80%。前期通過對X.arboricola pv. juglandis（菌株編號分別為CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj417）開展分泌蛋白質(zhì)預測，以分泌蛋白質(zhì)所具有的特征（N-端含有信號肽、不含有跨膜結構域、沒有GPI錨定位點、將蛋白質(zhì)分泌在胞外）為依據(jù)，利用SignalP v4.1、ProtCompB v9.0、TM-HMM v2.0、big-PI Fungal predictor TargetP v1.1等生物信息學分析程序進行分析，明確上述7個菌株中含有的分泌蛋白質(zhì)數(shù)量分別為76個、79個、77個、78個、67個、75個、68個，平均為74個。分泌蛋白質(zhì)在植物病原菌侵染植物過程中發(fā)揮著重要的作用，逐漸成為植物病理學研究的熱點之一[7]，有關植物病原真菌（禾谷炭疽菌[8]、希金斯炭疽菌[9]、稻瘟菌[10]、大麗輪枝菌[1]、香蕉枯萎病菌[12]）、植物病原卵菌（樟疫霉[13]、致病疫霉[14]）、植物病原細菌（枯草芽孢桿菌BEST195[15]、結核分枝桿菌[16]、香蕉細菌性軟腐病菌[17]、茄青枯病菌以[18]及丁香假單胞桿菌番茄致病變種[19]）的分泌蛋白質(zhì)己經(jīng)明確。然而，國內(nèi)外對于植物病原細菌特別是經(jīng)濟林木上病原細菌分泌蛋白質(zhì)的研究尚不夠深入[7]，尚未見到對核桃細菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及特征的分析報道[20]。

本研究基于前期的研究基礎，對核桃細菌性黑斑病菌中分泌蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、不穩(wěn)定系數(shù)、疏水性、二級結構、轉運肽及保守結構域開展生物信息學分析，以期為核桃細菌性黑斑病的深入研究和有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 分泌蛋白質(zhì)來源

核桃細菌性黑斑病菌的全蛋白質(zhì)組序列來源于NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Xanthom-onas+arboricola+pv.+juglandis）。對X.arboricolapv.juglandis（菌株編號分別為CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj417）開展分泌蛋白質(zhì)預測，獲得7個菌株的520個分泌蛋白質(zhì)氨基酸序列。

1.2 分泌蛋白質(zhì)性質(zhì)分析

運用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https：//web.expasy.org/protparam/）分析分泌蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，包括理論等電點、不穩(wěn)定性系數(shù)、總平均親水性等，采用PHD（htp：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）分析分泌蛋白質(zhì)的二級結構，采用Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析分泌蛋白質(zhì)的疏水性，采用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析分泌蛋白質(zhì)的轉運肽，采用SMART（http：//smart.embl-heidel-berg.de/）分析分泌蛋白質(zhì)的保守結構域，然后對分析數(shù)據(jù)進行整理歸納。

2 結果

2.1 分泌蛋白質(zhì)的理論等電點

通過對核桃細菌性黑斑病菌CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3、J303、NCPPB1447、Xaj4177個菌株的520個分泌蛋白質(zhì)所具有的理論等電點數(shù)值進行分析，CFBP2528菌株的分泌蛋白質(zhì)WP_039528270.1（ID號）具有最低理論等電點，為4.14;CFBP7179菌株的分泌蛋白質(zhì)WP_047130622.1（ID號）具有最高理論等電點，為11.71。將上述分泌蛋白質(zhì)，以理論等電點1.00為1個間隔單位，對其進行歸類分析，結果表明，核桃細菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)理論等電點主要集中于6.01～7.00，其數(shù)量為140個，所占比例為26.92%;理論點為5.01～6.00的分泌蛋白質(zhì)有16個，所占比例為22.12%。同時，對屬于酸性蛋白質(zhì)（理論等電點小于6.01）的分泌蛋白質(zhì)進行分析，其數(shù)量平均為21個，所占比例為28.46%;對屬于中性蛋白（理論等電點位于6.01～8.00）的分泌蛋白進行分析，其數(shù)量平均為26個，所占比例為35.00%;對屬于堿性蛋白質(zhì)（理論等電點大于8.00）的分泌蛋白質(zhì)進行分析，其數(shù)量平均為27個，所占比例為36.54%（圖1）。上述結果表明核桃細菌性黑斑病菌7個菌株的分泌蛋白質(zhì)中酸性蛋白質(zhì)、中性蛋白質(zhì).堿性蛋白質(zhì)數(shù)量分布較為均勻，所占比例為1.00：1.23：1.28。

2.2 分泌蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性系數(shù)

對520個分泌蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性系數(shù)進行統(tǒng)計分析，結果表明，分泌蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性系數(shù)集中在20.01～40.00（所占比例為63.65%）。同時，不穩(wěn)定性系數(shù)小于40.01（穩(wěn)定蛋白質(zhì)）的分泌蛋白質(zhì)有51個，所占比例為68.65%;不穩(wěn)定性系數(shù)大于40.01（不穩(wěn)定蛋白質(zhì)）的分泌蛋白質(zhì)有23個，所占比例為31.35%（圖2）。上述結果表明，核桃細菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)多屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.3 分泌蛋白質(zhì)的親水性

對核桃細菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)的親水性進行統(tǒng)計分析，結果表明，分泌蛋白質(zhì)多數(shù)屬于親水性蛋白（親水性值小于0），其數(shù)量有57個，所占比例為76.54%;同時，疏水性蛋白質(zhì)（親水性值大于0）數(shù)量有17個，所占比例為23.46%（圖3）。上述結果表明，核桃細菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)多數(shù)屬于親水性蛋白質(zhì)。

此外，對分泌蛋白質(zhì)的疏水性進行統(tǒng)計分析，結果表明，分泌蛋白質(zhì)中親水性蛋白質(zhì)有56個，所占比例為75.96%，疏水性蛋白質(zhì)有18個，所占比例為24.04%。對分泌蛋白質(zhì)親水性最強氨基酸殘基、疏水性最強氨基酸殘基種類進行統(tǒng)計分析，明確前者有17種氨基酸殘基，缺少F（苯丙氨酸）、I（異亮氨酸）、W（色氨酸）3種氨基酸殘基，存在較多的是D（天冬氨酸）、R（精氨酸）、G（甘氨酸）3種氨基酸殘基，所占比例分別為13.64%、9.44%.9.27%（圖4）;后者有13種氨基酸殘基，缺少E（谷氨酸）、H（組氨酸）、K（賴氨酸）、N（天冬酰胺）、Q（谷氨酰胺）、R、W、Y（酪氨酸）等氨基酸殘基，存在較多的是L（亮氨酸）、A（丙氨酸）、V（纈氨酸）3種氨基酸殘基，所占比例分別為29.58%、26.92%、11.27%（圖4）。

2.4 分泌蛋白質(zhì)二級結構組成特征

對核桃細菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)進行二級結構預測并統(tǒng)計分析，結果表明，分泌蛋白質(zhì)均含有無規(guī)則卷曲、a螺旋β折疊、TM（跨膜螺旋）等結構，平均所占比例分別為27.56%、27.17%、26.45%、1.03%，即比例為1.000：0.986：0.960：0.037。同時，對分泌蛋白質(zhì)中的酸性蛋白質(zhì)、中性蛋白質(zhì)及堿性蛋白質(zhì)二級結構組成進行統(tǒng)計分析，就無規(guī)則卷曲、a螺旋β折疊、TM（跨膜螺旋）等結構組成比例而言，在酸性蛋白質(zhì)中所占比例分別為27.70%、27.09%、28.05%、0.92%;在中性蛋白質(zhì)中所占比例分別為24.35%、27.32%、24.99%、1.05%;在堿性蛋白質(zhì)中所占比例分別為30.54%、27.08%、26.59%、1.09%（圖5）。因此，核桃細菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)的酸性蛋白質(zhì)二級結構組成尤以β折疊為主、以跨膜螺旋結構較少為特征，中性蛋白質(zhì)二級結構組成則以跨膜螺旋結構較少為特征，堿性蛋白質(zhì)二級結構組成則以無規(guī)則卷曲較多為特征。

2.5 分泌蛋白質(zhì)的轉運肽

對核桃細菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)的轉運肽預測分析，明確分泌蛋白質(zhì)的線粒體靶向肽預測值、信號肽預測值、定位情況和預測可靠性。其中轉運肽定位分布（圖6）中，平均有71個定位在分泌通道、3個定位在線粒體，所占比例分別為95.38%、4.23%，CFBP2528和Xaj417還含有1個其他位置，占比為0.38%;同時，就預測結果可靠性而言，平均有58個分泌蛋白質(zhì)的預測可靠性大于0.600，所占比例為78.46%，有4個分泌蛋白質(zhì)的預測可靠性小于0.200，所占比例為5.19%。

2.6 分泌蛋白質(zhì)的保守結構域

通過對核桃細菌性黑斑病菌的520個分泌蛋白質(zhì)開展保守結構域的預測及分析，發(fā)現(xiàn)有111個分泌蛋白質(zhì)存在明顯的保守結構域，即每個菌株平均有16個分泌蛋白質(zhì)具有明顯的保守結構域（圖7），所占比例為21.35%。不同菌株分泌蛋白質(zhì)所存在的保守結構域種類和數(shù)量不盡相同，主要涉及的種類有24種，最少的類別涉及數(shù)量僅為1個，最多的類別涉及的數(shù)量為14個。

3 討論

本研究基于前期的研究基礎，明確核桃細菌性黑斑病菌CFBP2528、CFBP7179、CFBP8253、DW3F3J303、NCPPB1447、Xaj417等7個菌株的分泌蛋白質(zhì)所具有的理化性質(zhì)及特征，酸性蛋白質(zhì)、中性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)數(shù)量分布較為均勻，數(shù)量所占比例為1.00：1.23：1.28;尤以穩(wěn)定蛋白質(zhì)、親水性蛋白質(zhì)居多;親水性最強的氨基酸殘基數(shù)量較多的是D、G、R3種氨基酸殘基，疏水性最強的氨基酸殘基數(shù)量較多的是L、A、V3種氨基酸殘基;均存在無規(guī)則卷曲、a螺旋β折疊、跨膜螺旋等二級結構，所占比例為1.000：0.986：0.959：0.037;擁有明顯保守結構域的分泌蛋白質(zhì)所占比例較低。

近些年，學術界對核桃細菌性黑斑病菌的報道涉及樹生黃單胞菌胡桃變種（Xanthomonas campestrispv. juglandis）[21-22]、成團泛菌（Pantoea agglomerans）以及上述細菌的復合[23]等，本研究僅對X. ar-boricola pv. juglandi的分泌蛋白質(zhì)開展了生物信息學分析，上述其他致病菌的分泌蛋白質(zhì)及其理化性質(zhì)情況如何，尚需進一步明確。同時，本研究采用對比分析和平均值的方法對X. arboricola pv. juglandi的7個菌株的分泌蛋白質(zhì)進行分析，初步明確了核桃細菌性黑斑病菌的分泌蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及其特征。目前，國內(nèi)外有關植物病原菌（真菌、細菌、卵菌等）分泌蛋白質(zhì)的預測報道大多集中在某一個菌株開展[8-20]，本研究對同一種病原菌的幾個菌株分泌蛋白質(zhì)的預測尚屬首次，具有一定的創(chuàng)新性，但采用不同菌株分泌蛋白質(zhì)特征值的平均數(shù)來衡量其理化性質(zhì)，其準確性有待于進一步驗證。

此外，本研究明確了7個X. arboricola pv. juglandi菌株的分泌蛋白質(zhì)數(shù)量平均為74個，以堿性蛋白質(zhì)、穩(wěn)定蛋白質(zhì)、親水性蛋白質(zhì)居多，二級結構中跨膜螺旋較少，保守結構域的種類和數(shù)量較少。就單個菌株的分泌蛋白質(zhì)所具有的特征而言，親水性蛋白質(zhì)的比例為70.59%～83.12%，酸性蛋白質(zhì)的比例為25.00%～31.65%，中性蛋白質(zhì)的比例為32.89%～36.76%，堿性蛋白質(zhì)的比例為33.77%～42.11%，二級結構中無規(guī)則螺旋的比例為26.23%～30.06%，a螺旋的比例為25.81%～29.49%，β折疊的比例為25.14%～28.18%，TM的比例分布為0.85%～1.28%，轉運肽定位在分泌通路的比例為92.21%～97.37%，定位在線粒體的比例為1.32%～7.79%，保守結構域的數(shù)量為13～18個。推測上述不同菌株之間分泌蛋白質(zhì)理化性質(zhì)特征差異的原因與菌株的生存環(huán)境、培養(yǎng)因素等有關。

通過對X.arboricolapv.juglandi的分泌蛋白質(zhì)的疏水性進行分析，明確親水性蛋白和疏水性蛋白質(zhì)平均有56個和18個，然而，通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫在線分析理化性質(zhì)，明確親水性蛋白質(zhì)和疏水性蛋白質(zhì)平均有57個和17個，上述2種不同的預測方法導致了不同的結果。具體而言，在上述2種預測方法中，有19個分泌蛋白質(zhì)的疏水性結果存在差異性，分別為CFBP2528菌株（WP_016901454.1）、CFBP7179菌株（WP_016901454.1、WP_016902921.1、WP_026064112.1）、CFBP8253菌株（WP016901454.1、WP_016902921.1、WP_026064112.1、WP_053045589.1）、DW3F3菌株（PMR89132.1、PMR89352.1、PMR89417.1）、J303菌株（0AH79955.1、0AH79250.1、0AH76971.1）、NCPPB1447菌株（WP_016901454.1、WP_016902921.1、WP026064112.1、WP_026064348.1）、Xaj417菌株（AKU51471.1），進一步對比分析，發(fā)現(xiàn)2種方法所預測的值相差最小為0.183，相差最大為12.992，造成上述差異的原因有待進一步明確。

同時，對核桃細菌性黑斑病菌分泌蛋白質(zhì)所具有的保守結構域進行分析，具有明顯保守結構域的分泌蛋白質(zhì)所占比例僅為21.35%，推測上述具有不同結構域的分泌蛋白質(zhì)在實現(xiàn)核桃細菌性黑斑病菌侵染核桃后所具有的功能具有多樣性特點。

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