印度梨形孢最適培養(yǎng)基的篩選及其對水稻的促生作用研究

舒珊 高中南 袁聽 陳強 朱志炎 何勇 葉開溫 田志宏

摘 要：【目的】內(nèi)生真菌印度梨形孢Piriformospora indica（Pi）可定殖在多種植物根系中，促進(jìn)植物生長發(fā)育，增強植物抗逆性。【方法】 將印度梨形孢接種至8種供試培養(yǎng)基中，測定其在8種培養(yǎng)基中的生長速率，并將印度梨形孢與水稻幼苗共培養(yǎng)，分析印度梨形孢對水稻幼苗株高、葉長、根長、根數(shù)、鮮重和葉綠素含量等生物學(xué)性狀的影響。【結(jié)果】 8種供試培養(yǎng)基中，V8培養(yǎng)基是最適合印度梨形孢生長的培養(yǎng)基，且加入一定量蔗糖能進(jìn)一步促進(jìn)印度梨形孢的生長;研究還發(fā)現(xiàn)，接種了印度梨形孢的水稻株高、葉長、根長、根數(shù)、葉綠素含量和地上地下部鮮質(zhì)量都顯著高于對照;與對照相比，接種印度梨形孢20 d后的水稻，其株高增高了32.36%，葉綠素含量提高了15.88%?！窘Y(jié)論】 印度梨形孢是通過增加光合作用和增強根系生理機能，從而促進(jìn)水稻的生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞：印度梨形孢;培養(yǎng)基;水稻;促生作用

中圖分類號：S 154文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1008-0384（2019）02-155-07

0 引言

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物之一[1]，在生長過程中會受到各種生物和非生物逆境的脅迫，極大地限制了水稻的產(chǎn)量[2-3]。在生產(chǎn)過程中，人們往往通過施用化肥、農(nóng)藥等措施來促進(jìn)水稻生長，提高水稻產(chǎn)量。但過度使用化肥和農(nóng)藥會給環(huán)境帶來巨大壓力，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。印度梨形孢Piriformospora indica（Pi）是Verma等[4]從印度塔爾沙漠分離的一種根部內(nèi)生真菌，其可定殖于多種植物的根系中，促進(jìn)植物的生長和發(fā)育，增強植物對脅迫的抵抗力，提高作物產(chǎn)量[5-6]。【前人研究進(jìn)展】已有研究表明，印度梨形孢不僅能促進(jìn)小白菜和擬南芥的生長發(fā)育[7-8];提高大白菜、芝麻等作物的抗旱性[9-11]，大麥對高鹽的耐受性[12];增加番茄和玉米的生長發(fā)育及抵抗力[13-14];還可以提高移栽苗的成活率[15-16];促進(jìn)藥用植物代謝物的產(chǎn)生[17-20]?！颈狙芯壳腥朦c】印度梨形孢與叢枝菌根真菌作用相似，不同的是該菌可以在體外培養(yǎng)。目前，印度梨形孢在PDA等培養(yǎng)基上的生長速率還不夠快，產(chǎn)生的孢子量不夠多，若要獲得一定量的孢子，需要更多的培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間，也不利于生物菌肥的規(guī)模化生產(chǎn)。進(jìn)一步篩選出適合印度梨形孢生長的培養(yǎng)基，不僅能夠加快印度梨形孢的生長速率，更快地獲得科研所需的孢子量，節(jié)省科研時間，還能加快印度梨形孢生物菌肥規(guī)模化生產(chǎn)的進(jìn)程?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過篩選出印度梨形孢的最適培養(yǎng)基，快速獲取所需孢子量，讓印度梨形孢定殖于水稻根系，促進(jìn)水稻的生長發(fā)育，增強水稻的抵抗力，減少農(nóng)藥和化肥的使用量，減輕對環(huán)境的壓力，從而促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試材料

印度梨形孢菌株及供試水稻品種日本晴，均由長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。8種供試培養(yǎng)基配方如下：（1）

Aspergillus：參照文獻(xiàn)[21];（2）

PDA：200 g·L-1馬鈴薯+20 g·L-1葡萄糖+20 g·L-1瓊脂;（3）

V8：200 mL·L-1 V8果汁+3.0 g·L-1 CaCO3+20 g·L-1瓊脂;（4）

農(nóng)夫果園橙子：200 mL·L-1農(nóng)夫果園橙子果汁+3.0 g·L-1 CaCO3+20 g·L-1瓊脂;（5）

農(nóng)夫果園芒果：200 mL·L-1農(nóng)夫果園芒果果汁+3.0 g·L-1 CaCO3+20 g·L-1瓊脂;（6）

農(nóng)夫果園番茄：200 mL·L-1農(nóng)夫果園番茄果汁+3.0 g·L-1 CaCO3+20 g·L-1瓊脂;（7）

MS：50 mL·L-1大量元素+5 mL·L-1微量元素+5 mL·L-1鐵鹽+5 mL·L-1有機成分，具體配方參照文獻(xiàn)[22];（8）康乃馨：200 g·L-1康乃馨葉片+20 g·L-1瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 印度梨形孢在平板上的生長速率測定

取-80℃冰箱保存的印度梨形孢菌塊接種于PDA平板上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，再轉(zhuǎn)接至新的PDA平板上培養(yǎng)1周左右，在活化的印度梨形孢菌落邊緣，用打孔器打成直徑5 mm的菌餅，將菌餅分別接種至含不同固體培養(yǎng)基的平板中央，每種培養(yǎng)基接種3個平板，放置于28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，測量并記錄印度梨形孢在培養(yǎng)第5、7、10 d時的菌落直徑。

1.2.2 印度梨形孢在液體培養(yǎng)基中的生長速率測定

將活化后直徑5 mm的印度梨形孢菌餅接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，然后放置于28℃搖床，200 r·min-1黑暗培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)第5、7、10 d時測量印度梨形孢菌體鮮重[23]，烘干后稱量并記錄菌體干重，每種培養(yǎng)基每次測量3瓶。

1.2.3 水稻幼苗的培養(yǎng)

選取健康飽滿的水稻種子，置于70%乙醇中1 min，無菌水洗滌3次，置于2.5%次氯酸鈉溶液中消毒10 min，無菌水洗滌3次后，轉(zhuǎn)入2個已滅菌的培養(yǎng)皿中，加入等量的無菌水，置于植物生長室萌發(fā)，植物生長室溫度為（26±1）℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗，待水稻種子萌發(fā)長出根后，向其中一個培養(yǎng)皿中加入適量濃度的印度梨形孢菌懸液，另一個培養(yǎng)皿中加入等體積無菌水作對照。

1.2.4 印度梨形孢的定殖檢測

印度梨形孢與水稻共培養(yǎng)14 d后，隨機選取10株水稻幼苗，用無菌水沖洗根系，再將根系剪成長度為1 cm的小段，置于10% KOH溶液中過夜，然后用無菌水沖洗3次，1% HCl溶液中浸泡5 min，0.05%臺盼藍(lán)染色5～8 min，無菌水沖冼6～8次，最后在400倍顯微鏡下觀察是否有印度梨形孢定殖，印度梨形孢定殖后，將2個培養(yǎng)皿中長勢相同的水稻幼苗分別種植于含無菌土壤的2個育苗盒中，觀察并記錄水稻幼苗生長情況。

1.2.5 水稻生物量及葉綠素含量的測定

接種印度梨形孢20 d后，分別各取10株處理和對照的水稻幼苗，測量株高、最大葉長、最大葉寬、根長、根數(shù)、地上地下部鮮重及葉綠素含量，葉綠素含量測定方法參照文獻(xiàn)[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢在固體培養(yǎng)基上的生長速率

將印度梨形孢接種至8種固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其在V8培養(yǎng)基上生長最快，培養(yǎng)5 d后，已接近長滿整個平板（圖1）;其次是3種農(nóng)夫果園培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后菌絲體也長滿整個平板;再次是PDA培養(yǎng)基和Aspergillus培養(yǎng)基;在康乃馨培養(yǎng)基上生長最慢，生長至10 d時直徑只有5.19 cm（表1）。

2.2 印度梨形孢在液體培養(yǎng)基中的生長速率

印度梨形孢在不同的液體培養(yǎng)基中的形態(tài)和生長速率各不相同（圖2）。本研究發(fā)現(xiàn)印度梨形孢在V8培養(yǎng)液中的生長速率最快（表3）。當(dāng)印度梨形孢在8種培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d時，其在V8培養(yǎng)基中的生物量最大，且印度梨形孢已達(dá)到平臺期，當(dāng)培養(yǎng)至7 d和10 d時，進(jìn)入衰亡期，鮮重隨著時間的推移逐漸減少;其次是Aspergillus培養(yǎng)基，當(dāng)印度梨形孢在Aspergillus液體培養(yǎng)基中生長5 d和7 d時，其生物量都要比在PDA培養(yǎng)基中的生物量要大一些，生長速率相對較快（表2）;生長速率差異最大的為3種農(nóng)夫果園培養(yǎng)基，和在固體培養(yǎng)基上不同，印度梨形孢在3種農(nóng)夫果園培養(yǎng)液中的生長速率都沒有比在Aspergillus和PDA培養(yǎng)液中的快;生長最慢的仍然是在康乃馨培養(yǎng)基中。2.3 不同碳源對印度梨形孢生長的影響

為了測試不同碳源對印度梨形孢生長的影響，向V8培養(yǎng)基中分別加入濃度為1%的葡萄糖、果糖和蔗糖。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至3、5、7 d時，印度梨形孢在加入蔗糖的V8培養(yǎng)基上的生長速率都是最快的，并在培養(yǎng)至第7 d時，已接近長滿整個平板（圖3）;而加入葡萄糖或果糖都會稍微抑制印度梨形孢的生長，其生長速率都比在不加糖的V8培養(yǎng)基上慢一點;研究還發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢在加葡萄糖或果糖的V8培養(yǎng)基上的生長速率沒有顯著性差異（表3）。

2.4 印度梨形孢的定殖檢測

印度梨形孢與水稻幼苗共培養(yǎng)14 d后，取水稻幼苗根系進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，在顯微鏡下可觀察到印度梨形孢的孢子存在于水稻根系成熟區(qū)的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間（圖4），表明印度梨形孢已成功定殖到水稻根系中。

2.5 印度梨形孢對水稻幼苗生長的影響

印度梨形孢對供試水稻日本晴幼苗的生長有顯著的影響。在接種印度梨形孢前，幼苗的生物學(xué)性狀之間沒有顯著性差異（圖5-A）;印度梨形孢與水稻幼苗共培養(yǎng)7 d后，接種了印度梨形孢的水稻幼苗株高要顯著高于未接種印度梨形孢的幼苗株高，而且葉片顏色更綠（圖5-B）;接種印度梨形孢20 d后，接種了印度梨形孢的水稻的主根更長，根毛較多，株高更高，葉片更長，鮮重更重，葉綠素含量更多（表4），且處理組的葉片數(shù)大多為3葉或2葉1心，而對照組大多為2葉（圖5-C）。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，在8種培養(yǎng)基中，V8培養(yǎng)基是印度梨形孢的最適培養(yǎng)基，無論是在固體還是液體培養(yǎng)基中，印度梨形孢在V8培養(yǎng)基中的生長速率都是最快的。在固體平板上，印度梨形孢在3種農(nóng)夫果園培養(yǎng)基上的菌絲生長速率比在Aspergillus和PDA平板上快，而在液體培養(yǎng)基中卻相反，這是印度梨形孢在平板上的菌絲體總量增長速度不同所導(dǎo)致的[25]。雖然相同時間內(nèi)印度梨形孢在3種農(nóng)夫果園培養(yǎng)基上的生長直徑更大，但其菌絲體相對稀疏，菌絲體含量增長速率比在Aspergillus和PDA平板上要慢很多，所以才會在液體培養(yǎng)基中出現(xiàn)相反的結(jié)果。研究還發(fā)現(xiàn)，平板上培養(yǎng)5 d時，印度梨形孢在Aspergillus培養(yǎng)基上的生長速率比在PDA上的快一些，這與Pham等[25]的研究結(jié)果相同，但在培養(yǎng)至7 d和10 d時，生長速率卻又相反;液體培養(yǎng)時又發(fā)現(xiàn)，不論是培養(yǎng)至5 d、7 d或10 d，印度梨形孢在Aspergillus培養(yǎng)液中的菌絲量都比在PDA中的要多。Pham等[25]研究發(fā)現(xiàn)，印度梨形孢在Aspergillus固體平板上培養(yǎng)時，會出現(xiàn)一定規(guī)律的停滯生長現(xiàn)象，每當(dāng)停滯生長時，會產(chǎn)生大量不同直徑的孢子，然后再繼續(xù)生長，這可能是導(dǎo)致印度梨形孢在培養(yǎng)至7 d和10 d時，其在Aspergillus平板上的直徑比在PDA上的小的原因;而在液體中培養(yǎng)時，印度梨形孢不出現(xiàn)停滯生長現(xiàn)象，所以印度梨形孢在Aspergillus液體培養(yǎng)基中的菌絲體含量總是比在PDA培養(yǎng)液中的多。向V8培養(yǎng)基中加入不同碳源，發(fā)現(xiàn)加入蔗糖能促進(jìn)印度梨形孢的生長，但加入葡萄糖或果糖都會對印度梨形孢的生長有所抑制，其機制還不明確，有待進(jìn)一步研究。

已有研究表明，印度梨形孢能夠促進(jìn)小白菜、油菜及芝麻等多種植物的生長[4-8]。本研究表明，印度梨形孢同樣能促進(jìn)水稻的生長發(fā)育。與對照相比，定殖了印度梨形孢的水稻具有更好的性狀，如株高、葉長、根長、根數(shù)、鮮重和葉片葉綠素含量等，差異達(dá)顯著或極顯著水平;與對照相比，接種印度梨形孢20 d后的水稻，其株高增加了32.36%，葉綠素含量提高了15.88%。這些結(jié)果表明，印度梨形孢是通過增加光合作用和增強根系生理機能，從而促進(jìn)水稻的生長發(fā)育。這與印度梨形孢提高油菜和芝麻等作物生長的機理類似。

作物在生產(chǎn)過程中會受到各種生物和非生物脅迫，極大限制了作物的產(chǎn)量。通過篩選出更適合印度梨形孢生長的培養(yǎng)基，不僅可以加速印度梨形孢生物菌肥的規(guī)模化生產(chǎn)，用該生物菌肥促進(jìn)作物的生長，提高作物對生物和非生物脅迫的抵抗能力，還能減少農(nóng)藥和化肥的使用量，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：林海清）