芒果壯鋏普癭蚊為害對芒果葉片揮發(fā)物的影響

蔡鴻嬌 陳峰

摘 要：【目的】探討芒果壯鋏普癭蚊為害對芒果葉片揮發(fā)物的影響，為癭蚊防治提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎庙斂展滔辔⑤腿。⊿PME）及氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）技術(shù)分析芒果壯鋏普癭蚊為害后芒果葉片揮發(fā)性物質(zhì)和相對含量的變化?！窘Y(jié)果】健康葉片和蟲傷葉分別含有65種和66種揮發(fā)物成分， 其中45個組分相同，主要包括石竹烯、α-蓽澄茄烯、十八碳烯、蒈烯、水芹烯、β-月桂烯、蒎烯等。癭蚊為害后揮發(fā)物主要為萜烯類31種和芳香族化合物13種，相對含量分別高達51.41%和41.10%，酯類物質(zhì)相對含量明顯高于健康葉片，成分也發(fā)生改變。蟲傷葉揮發(fā)物除了萘和薁之外，主要物質(zhì)包括甲基-4-（1-甲基亞乙基）-環(huán)己烯（24.32%）、α-蓽澄茄烯（8.92）、3-蒈烯（2.23%）、乙酸酯3-己烯-1-醇（2.23%）、4-蒈烯（1.06%）、檸檬烯（1.04%）、a-石竹烯（1.46%）。極微量物質(zhì)包括辛醇、蘭桉醇、斯巴醇、表藍桉醇、長香茅醇，香豆素類化合物只在健康葉片中檢測到，馬兜鈴烯、法呢烯和一些特殊萘和薁芳香族化合物只在蟲傷葉中檢測到?！窘Y(jié)論】芒果葉片的主要揮發(fā)性物質(zhì)為芳香族類和萜烯類化合物，癭蚊為害后導(dǎo)致?lián)]發(fā)物質(zhì)和含量發(fā)生明顯改變。

關(guān)鍵詞：芒果壯鋏普癭蚊;頂空固相微萃取;GC-MS;揮發(fā)物;蟲傷葉

中圖分類號：S 433文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）02-223-06

0 引言

【研究意義】芒果壯鋏普癭蚊Procontarinai robusta Li，Pu and Zhang，2003屬雙翅目Diptera、癭蚊科Cecidomyiidae、普癭蚊屬Procontarinai Kieffer& Cecconi，2003年被鑒定為新種[1]。DAISIE（歐洲抵御外來物種計劃項目）2009年公布的歐洲外來物種詳細報告指出，外來物種導(dǎo)致經(jīng)濟價值、生物多樣性及生態(tài)系統(tǒng)功能的明顯損失，芒果壯鋏普癭蚊被列為11 000種入侵害蟲防控對象名單內(nèi)[2]。陳永森等風(fēng)險分析認為該物種具有高度的危險性，應(yīng)列為國家二類檢疫對象[3]。

芒果樹是廈門市的主要行道樹種之一，芒果壯鋏普癭蚊主要為害芒果樹葉片，1999年在廈門首次發(fā)現(xiàn)，隨后十幾年逐漸蔓延爆發(fā)擴散到廈門周邊城市[4]。芒果樹是芒果壯鋏普癭蚊的唯一寄主，每年發(fā)生4代，4～11月為害情況比較嚴重。成蟲將蟲卵產(chǎn)在芒果嫩葉的背面，孵化后幼蟲直接鉆入葉肉取食為害，造成葉片隆起，形成黑色蟲癭，梅雨季節(jié)幼蟲為害部位經(jīng)常形成斑點、孔洞、腐爛，蟲癭數(shù)量多的嚴重影響植物生長發(fā)育，從而導(dǎo)致芒果樹提前衰老、葉片發(fā)黃干枯、提早凋落、不開花結(jié)果等現(xiàn)象[5]，影響果園芒果產(chǎn)量和品質(zhì)，也影響芒果行道樹的景觀特色。

除了芒果壯鋏普癭蚊，其他癭蚊對寄主也表現(xiàn)出明顯的專一寄生性和特殊的蟲癭形態(tài)，因此癭蚊個體即使再小，也可以通過蟲癭的形態(tài)來判斷癭蚊物種。芒果壯鋏普癭蚊的防治也較為困難，癭殼厚硬的特點使化學(xué)藥劑難以達到靶標害蟲，且容易農(nóng)藥殘留，利用植物化學(xué)信息素防治和監(jiān)測芒果壯鋏普癭蚊成蟲是一種新的防治途徑?！厩叭搜芯窟M展】癭蚊對寄主植物的選擇主要依靠植物揮發(fā)性物質(zhì)。植物揮發(fā)性物質(zhì)影響昆蟲行為，如產(chǎn)卵、覓食、交配、繁殖、生長等[6]。特別是健康植物葉片中擁有可以引誘害蟲的揮發(fā)性氣味，可以引誘害蟲在葉片上進行取食繁殖等活動[7]。同理芒果葉片的揮發(fā)物影響芒果壯鋏普癭蚊對寄主搜索定位、產(chǎn)卵、取食等行為。

目前已知的植物揮發(fā)性有機物主要成分包括醇類、醛類、酮類、酯類、萜烯類和芳香族類等。天然產(chǎn)物分離技術(shù)常見包括水蒸氣蒸餾法、吸附樹脂法、有機溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法、分子蒸餾法、抽氣吸附法、動態(tài)頂空采集法和固相微萃取法（SPME），植物揮發(fā)物的采集和測定應(yīng)盡可能真實反映自然狀態(tài)下植物揮發(fā)物的成分和組成，頂空采樣聯(lián)合氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）對小分子的檢測能力較差，而SPME-GC-MS具有無需有機溶劑、對成分檢測靈敏度高、操作簡單、重現(xiàn)性好、無污染等優(yōu)點，被廣泛采納。【本研究切入點】目前通過植物次生物質(zhì)調(diào)控害蟲行為從而達到控制害蟲種群的目的是世界研究熱點。雖然SPME-GC-MS只能進行定性和相對含量分析，無法進行定量分析，但對初步判斷癭蚊為害對芒果揮發(fā)性物質(zhì)成分的改變是可行的。

因此分析癭蚊為害對植物揮發(fā)物成分的影響有利于揭示昆蟲與植物之間的互作關(guān)系，對未來利用植物信息素監(jiān)測和防治害蟲種群提供參考依據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過比較健康葉片和蟲傷葉揮發(fā)性成分和相對含量的差異來分析害蟲對植物次生物質(zhì)的影響，以期為從植物中提取或者合成控制害蟲的活性物質(zhì)防治害蟲提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

芒果葉片采集來自集美大學(xué)校園內(nèi)芒果行道樹，選擇新鮮芒果樹新抽梢上的嫩葉，健康葉片為對照組，以及剛被癭蚊為害的嫩梢葉片為蟲傷組，每組分別100g， 每組各重復(fù)4次。利用頂空固相微萃取方法吸附揮發(fā)性氣味，將葉片置入頂空樣品瓶中，插上萃取頭在室溫下進行萃取，萃取的時長為40 min。

1.2 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分離條件

采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（儀器型號Agilent 7980A GC;MS： 5975C）測定芒果葉片的植物揮發(fā)性成分。

采用的色譜柱是HP-INNOWax（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱溫采用程序升溫，初溫40℃，以3℃·min-1升至120℃，再以5℃·min-1升至200℃，保持10 min;進樣口的溫度250℃，采用不分流進樣載氣高純He，流量1.0 mL·min-1。萃取頭在進樣口脫附3 min。質(zhì)譜條件為電子轟擊離子源（EI）;檢測器電壓為350V;離子源溫度為200℃;接口溫度為250℃，電子能量70 eV;掃描質(zhì)量范圍為35～335 amu。

1.3 揮發(fā)性化合物的定性和半定量分析

利用NIST譜庫檢索定性，面積歸一化法求各成分的百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康葉片與蟲傷葉揮發(fā)物數(shù)量和相對含量

芒果葉片揮發(fā)物成分復(fù)雜，主要分為芳香族化合物、萜烯類、醇類、酯類、烴類、醛類、酮類和酸類8類，其中芳香族化合物和萜烯類是主要成分組成部分。

健康葉片揮發(fā)物總離子圖見圖1，各組分經(jīng)過計算機譜庫，共檢出161個成分，分離鑒定出有效組分65種（表1），主要為芳香族化合物16種和萜烯類27種，相對含量分別高達29.77%和50.64%。

癭蚊為害后葉片揮發(fā)物總離子圖見圖2，共檢出158個成分，分離鑒定出其中有效組分 66種，主要為萜烯類31 種和芳香族化合物 13 種 ，相對含量分別高達51.41%和 41.10%（表1）。

試驗結(jié)果顯示芒果主要揮發(fā)物成分為萜烯類物質(zhì)，與Winterhalter的報道基本一致，他認為芒果香味由酯類、萜烯類、酮類、醛類以及非萜烯類的其他烴類等物質(zhì)共同作用產(chǎn)生[8]。結(jié)果顯示醇類、酯類、烴類、醛類、酮類和酸類含量較低，這是由于很多揮發(fā)物只有在芒果果實成熟過程中釋放，比如水果在綠熟期開始形C2～C6 的酯類[9]，同時在成熟過程產(chǎn)生的重要香氣產(chǎn)物是醛類和醇類[10]，本試驗主要測定葉片，所以這類物質(zhì)較少。有些喇叭茶醇、表藍桉醇、杜松醇等是薁前驅(qū)體化合物，即可經(jīng)脫水、脫氫轉(zhuǎn)化為薁，薁屬芳香族化合物。被癭蚊為害后酯類的相對含量明顯增加，很多實驗也證明害蟲為害導(dǎo)致植物產(chǎn)生特異性氣味，被稱為取食誘導(dǎo)揮發(fā)物（Herbivory-induced plant volatiles，HIPVs）。

2.2 健康葉片與蟲傷葉揮發(fā)物主要成分

健康葉片與蟲傷葉含有45個相同組分，癭蚊為害后產(chǎn)生21種成分的差別，常見的共同揮發(fā)性物質(zhì)包括石竹烯、α-蓽澄茄烯、十八碳烯、蒈烯、水芹烯、β-月桂烯、蒎烯等（表2），α-水芹烯被證明也是芒果花的主要成分，β-石竹烯是芒果果實揮發(fā)物的主要成分之一，β-蓽澄茄油烯在果實和花中也均有被檢測到[11]。同時檢測出大量的萘與其同分異構(gòu)體薁的出現(xiàn)。

健康葉片揮發(fā)物除了萘和薁之外，主要的物質(zhì)包括甲基-4-（1-甲基亞乙基）-環(huán)己烯（31.6%）、α-蓽澄茄油烯（5.03%）、3-蒈烯（3.01%）、4-蒈烯（1.98%）、檸檬烯（1.10%）等（表2）。很多醇類雖然含量極低，比如辛醇、蘭桉醇、斯巴醇、表藍桉醇、長香茅醇，只有在健康葉片檢測到，而這些物質(zhì)是芳香族化合物的前體。極微量的香豆素類化合物在健康葉片中發(fā)現(xiàn)。從活性上看香豆素類化合物由于其共軛雙鍵的存在， 具有較高的生物活性，比如3-芳基香豆素化合物具有顯著的抑制細胞生長，從而用在抗腫瘤治療[12]，然而呋喃香豆素類化合物能被昆蟲細胞色素P450降解[13]。檸檬烯廣泛存在天然植物中，在高溫中可以分解成異戊二烯，研究發(fā)現(xiàn)檸檬烯對肉類腐敗有抑菌效果，因此在防腐保鮮領(lǐng)域被廣泛研究。本試驗中兩者檸檬烯相對含量差別不大。健康葉片中含有的硫氰酸二酯在蟲傷葉中并未發(fā)現(xiàn)。該物質(zhì)是否和異硫氰酸酯具有相同的功能有待研究，異硫氰酸酯可以幫助害蟲定向?qū)ふ壹闹鱗14]。

蟲傷葉揮發(fā)物除了苯和薁之外，主要的物質(zhì)包括甲基-4-（1-甲基亞乙基）-環(huán)己烯（24.32%）、α-蓽澄茄烯（8.92）、3-蒈烯（2.23%）、乙酸酯3-己烯-1-醇（2.23%）、4-蒈烯（1.06%）、檸檬烯（1.04%）、a-石竹烯（1.46%）等。α-蒎烯，β-蒎烯和莰烯被認為是芒果葉片吸引癭蚊形成蟲癭的主要生物標志物，含量越高越容易吸引癭蚊Procontarinia matteiana為害[15]。本試驗中α-蒎烯在蟲傷葉的含量明顯高于健康葉片，β-蒎烯和莰烯兩者差別不大。有些組分只有在蟲傷葉中才被檢測到，比如馬兜鈴烯、法呢烯等（表2），馬兜鈴酸被證明具有毒性，國際癌癥研究機構(gòu)2008年將馬兜鈴酸列為1類致癌物，將馬兜鈴酸類物質(zhì)列為2類致癌物，為害后產(chǎn)生的馬兜鈴烯是否對癭蚊產(chǎn)生拒食作用有待研究。更多的芳香族化合物萘薁結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含量豐富。酯類物質(zhì)相對含量明顯高于健康葉片，成分也發(fā)生改變。石竹烯是雙環(huán)倍半萜的植物化合物，藥理研究對細胞膜具有高親和力，有局部麻醉、抗炎、驅(qū)蚊蟲、抗焦慮、抗抑郁作用[16]，本試驗測定結(jié)果顯示，α-石竹烯在癭蚊為害后含量增加，是否會對癭蚊有驅(qū)避作用需進行風(fēng)洞行為實驗和觸角電位實驗確認。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果說明芒果葉片的主要揮發(fā)性物質(zhì)為芳香族類和萜烯類化合物，癭蚊為害后可導(dǎo)致葉片揮發(fā)物組分和含量發(fā)生明顯改變。植物釋放的揮發(fā)物的化學(xué)成分和比例變化被稱為化學(xué)指紋圖譜（chemical fingerprint） [17]，可以調(diào)控昆蟲的寄主定向選擇、產(chǎn)卵取食、交配繁殖等行為[18]。本試驗測定結(jié)果顯示，芒果葉片與前人果實的成分鑒定差別較大，是否與寄主品種也有關(guān)系，有待進一步確認。

昆蟲對寄主植物的搜索是一個復(fù)雜的過程，包括對氣味的識別和色彩的定位，其中揮發(fā)物是主要線索，但是揮發(fā)物的成分復(fù)雜，未來的研究將測定不同揮發(fā)物濃度下對昆蟲的電生理反應(yīng)和行為反應(yīng)。田厚軍等[11]研究表明，昆蟲觸角對同一揮發(fā)物不同濃度表現(xiàn)出不同的電生理反應(yīng)，雌雄之間也有顯著差別。昆蟲對寄主揮發(fā)物的感知主要取決于觸角感受器中的嗅覺受體神經(jīng)元（olfactory receptor neurones，ORNs），這些神經(jīng)元可以識別單分子結(jié)構(gòu)，而寄主植物的揮發(fā)物通常都是混合的，這要求ORNs能夠在高背景氣味干擾下短時間內(nèi)在不同濃度揮發(fā)物中精細的分辨出相關(guān)的寄主主體氣味線索[19]。芒果壯鋏普癭蚊對芒果葉片的寄主專一性必然和某種或者某幾種物質(zhì)緊密相連，因此揮發(fā)物的有效成分配比和持續(xù)時間是未來的研究重點，同時揮發(fā)物的提取和人工合成必須是經(jīng)濟實惠才能實現(xiàn)市場化。

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（責任編輯：林海清）