全基因組測(cè)序在食品安全預(yù)防中的利劍作用

推薦單位：國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心

成果來源：國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心

科研代表：王偉? ? 轉(zhuǎn)化作者：倪影

談?wù)勅蚪M測(cè)序，認(rèn)識(shí)它和我們健康息息相關(guān)的疾病預(yù)防、食品安全方面的關(guān)系。

2016年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的一份報(bào)告將威脅人類健康和生命的矛頭直指受到污染的食品。報(bào)告稱，全球范圍內(nèi)每年有多達(dá)6億人因食用受到污染的食品而生病，全球每年有42萬人因食源性疾病死亡。

沙門氏菌是引發(fā)全球性的食源性疾病的主要致病菌之一，世界衛(wèi)生組織（WHO）已經(jīng)將其列為具有中等危害和嚴(yán)重危害的食物傳播性病原。蛋、家禽和肉類產(chǎn)品是沙門氏菌病的主要傳播媒介，受威脅最大的是小孩、老年人及免疫缺陷個(gè)體。2006～2010年間我國報(bào)告的病因明確的細(xì)菌性食源性疾病暴發(fā)事件中，70%～80%是由沙門氏菌所致。同時(shí)，其所造成的疾病負(fù)擔(dān)，經(jīng)濟(jì)損失、醫(yī)療負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)等都不容忽視。

因此，建立快速、有效的檢測(cè)方法對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，將在食品安全保障、公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)以及禽病預(yù)防和控制中發(fā)揮巨大作用。另外，沙門氏菌耐藥性的不斷增強(qiáng)一直以來也是備受關(guān)注的全球性問題，通過對(duì)耐藥性的監(jiān)測(cè)，可以為防控沙門氏菌疫情暴發(fā)、合理使用抗生素提供科學(xué)依據(jù)。近年來，發(fā)展迅速的全基因組測(cè)序（Whole Genome Sequencing，WGS）在這方面功不可沒，尤其是在對(duì)食源性疫情暴發(fā)的檢測(cè)和監(jiān)控方面起著至關(guān)重要的作用，相信全基因組測(cè)序在不久的將來在食品安全方面將發(fā)揮非常重要的作用。

何為全基因組測(cè)序？基因組攜帶著生物個(gè)體的遺傳信息，基因組測(cè)序能夠加深對(duì)生物個(gè)體分子機(jī)制的理解。所謂全，指把物種細(xì)胞里面完整的基因組序列從第1個(gè)DNA開始一直到最后一個(gè)DNA，完完整整地檢測(cè)出來，并排列好，由此能夠鑒定出基因組上任何類型的突變，包含著所有基因和生命特征之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性。當(dāng)然，全基因組測(cè)序的實(shí)現(xiàn)離不開更高的測(cè)序技術(shù)支撐。

測(cè)序技術(shù)，簡(jiǎn)單說來是將DNA中的信息轉(zhuǎn)變?yōu)橛?jì)算機(jī)可處理的數(shù)字信息?；蚪M測(cè)序技術(shù)作為人類探索生命奧秘的重要手段之一，對(duì)生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展起到了巨大的推動(dòng)作用。

目前為止，測(cè)序技術(shù)可以分為三個(gè)階段，或三代測(cè)序技術(shù)。

第一代測(cè)序技術(shù)以1977年出現(xiàn)的sanger測(cè)序技術(shù)為標(biāo)志。一代技術(shù)的成本高，通量低，速度慢。

第二代測(cè)序技術(shù)以roche公司的454技術(shù)，illumina公司的solexa技術(shù)和ABI公司的solid技術(shù)的誕生為標(biāo)志。與一代測(cè)序技術(shù)相比，二代測(cè)序技術(shù)不僅保持了高準(zhǔn)確度，而且降低了測(cè)序成本，提高了測(cè)序速度。二代測(cè)序的出現(xiàn)，使得全基因組測(cè)序進(jìn)入了新的紀(jì)元。

第三代測(cè)序技術(shù)緊隨第二代測(cè)序技術(shù)出現(xiàn)，helicos和pacific公司推出了新的測(cè)序儀，與前2代技術(shù)相比，最大的特點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了單分子測(cè)序。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)每一條DNA分子的單獨(dú)測(cè)序，被認(rèn)為是第三代測(cè)序技術(shù)的開啟。

歐盟曾對(duì)傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定和全基因組測(cè)序分析進(jìn)行過成本和時(shí)間的比較：使用傳統(tǒng)生化和分型方法，要完成對(duì)于樣本中細(xì)菌的分離鑒定、血清分型、耐藥檢測(cè)、分子分型等一系列檢測(cè)，可能需要幾天到幾周的時(shí)間，總花費(fèi)在360甚至1360歐元。而借助全基因組測(cè)序技術(shù)，從拿到菌株到得到全部信息，只需要1～2天的時(shí)間，并且其成本僅為50～100歐元。

因?yàn)閷?duì)于傳統(tǒng)生化和分型方法而言，不同的細(xì)菌需要有其特定的試劑、操作流程和方法;同時(shí)，準(zhǔn)備工作繁瑣、操作復(fù)雜，且細(xì)菌之間的比較僅能通過個(gè)別指標(biāo)或基因位點(diǎn)來分析。對(duì)于全基因組測(cè)序，可允許幾個(gè)病原體同時(shí)測(cè)序，從而使實(shí)驗(yàn)室操作更簡(jiǎn)單、更快、更便宜;同時(shí)，可利用細(xì)菌全基因組的特異性基因位點(diǎn)進(jìn)行細(xì)菌間比對(duì)分析，極大提高特異性、靈敏度和分辨率，達(dá)到株水平的鑒定。

不難看出，全基因組測(cè)序能夠?qū)⒍鄠€(gè)實(shí)驗(yàn)流程整合為一;是對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)的更進(jìn)，也是代替;能夠更精確地提供信息;且信息量更大，性價(jià)比更高。

鑒于全基因組測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)，全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的高度特異性能夠改進(jìn)病例定義，實(shí)現(xiàn)快速診斷;借助監(jiān)視雷達(dá)，全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的高靈敏度可以將看似零星的散發(fā)病例相關(guān)聯(lián);通過遺傳進(jìn)化關(guān)系分析，全基因組測(cè)序?qū)χ虏【斐傻氖称肺廴?、疾病爆發(fā)進(jìn)行溯源分析，從而有效加強(qiáng)對(duì)疫情的管理。

全基因組測(cè)序的應(yīng)用，是食品安全疫情監(jiān)測(cè)與研究領(lǐng)域的重要一步。全基因組測(cè)序能夠精確鑒定引起食源性疾病的菌株，將成為預(yù)防食源性疾病爆發(fā)的利器，在疾病暴發(fā)時(shí)可以更快地采取行動(dòng)，鑒定致病微生物;同時(shí)，具備單核苷酸多態(tài)性分析，有助于理解目標(biāo)生物體的進(jìn)化史，提供細(xì)節(jié)供傳染病學(xué)家們清楚地了解疾病的傳播途徑，揭示細(xì)菌暴發(fā)過程中發(fā)生的一系列小規(guī)模的基因突變，追蹤暴發(fā)的源頭，開展毒性特點(diǎn)和耐藥性分析。

2014年4月-6月，英國借助全基因組測(cè)序?qū)崿F(xiàn)沙門菌引起食源性疾病的原因食品溯源。當(dāng)時(shí)，在歐盟各國暴發(fā)了350例沙門菌感染，通過流調(diào)發(fā)現(xiàn)，可能與使用生產(chǎn)商供應(yīng)的雞蛋制作的食品有關(guān)，于是英國在英格蘭5家餐館采集雞蛋、環(huán)境樣品、以及病人樣品，同時(shí)與其他國家的沙門菌爆發(fā)菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)這次暴發(fā)的菌株聚集成一簇，且菌株間突變很小，最后得出結(jié)論，歐盟各國350例沙門菌患者食用同一污染沙門菌雞蛋。

在我國，全基因組測(cè)序在食品安全應(yīng)用方面也有新的突破，發(fā)現(xiàn)了食源性碳青霉烯耐藥沙門菌。國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心作為國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)、評(píng)估、預(yù)警和標(biāo)準(zhǔn)制定機(jī)構(gòu)，從2002年開始就在全國范圍內(nèi)開展污染物和致病菌的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和評(píng)估工作。一直以來非常關(guān)注食源性致病菌的耐藥性問題，了解我國食源性沙門菌的NDM-1的流行情況。

2014年，國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心微生物室在對(duì)山東某大型屠宰場(chǎng)采集屠宰后準(zhǔn)備發(fā)貨的整雞樣品的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)過程中，對(duì)141份樣品進(jìn)行沙門菌分離鑒定，后期抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有1株印第安納血清型的沙門菌，對(duì)測(cè)試的11類抗生素的全部21種抗生素耐藥，僅對(duì)替加環(huán)素和多粘菌素敏感，可以說達(dá)到泛耐藥的水平。隨后用美羅培南Etest條進(jìn)行確認(rèn)，為碳青霉烯耐藥沙門菌，同時(shí)PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)菌株攜帶NDM-1基因，質(zhì)粒傳遞性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，其能夠?qū)①|(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸埃希氏菌中，轉(zhuǎn)移頻率在2.2× 10-4左右。

為了更深入地研究其耐藥機(jī)制和毒力等特性，提取菌株的基因組DNA后進(jìn)行了pacbio平臺(tái)三代完成圖測(cè)序。最后，對(duì)blaNDM-1耐藥基因環(huán)境于NCBI中的菌株進(jìn)行了比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這株雞肉來源的沙門菌NDM-1基因同其他多種耐藥基因位于一個(gè)一類整合子上，兩側(cè)被IS26的插入元件包括，整合子、插入序列同質(zhì)粒一樣，都屬于可移動(dòng)元件，能都介導(dǎo)耐藥基因在菌株間傳遞和轉(zhuǎn)移。它同臨床來源的大腸、弗氏檸檬酸桿菌和肺克具有高度同源性，提示，該基因環(huán)境可能已經(jīng)在臨床環(huán)境中發(fā)生傳播。

這是我國屠宰后整雞中blaNDM-1基因陽性印第安納沙門菌首次報(bào)道。在監(jiān)測(cè)工作過程中成功運(yùn)用全基因組測(cè)序?qū)κ吃葱蕴记嗝瓜┠退幧抽T菌的耐藥機(jī)制進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)菌株含有一個(gè)攜帶blaNDM-1基因等多重耐藥基因的大質(zhì)粒，鑒于該菌株表現(xiàn)為泛耐藥（XDR），同時(shí)攜帶多種耐藥基因、毒力因子和重金屬抗性基因，一旦在環(huán)境、動(dòng)物和消費(fèi)者中傳播，造成的潛在生態(tài)和健康危害將非常嚴(yán)重。同時(shí)，研究結(jié)果對(duì)加強(qiáng)肉雞養(yǎng)殖、屠宰、運(yùn)輸、銷售、消費(fèi)等全食物鏈中多重耐藥沙門菌的耐藥監(jiān)測(cè)，研究其傳播機(jī)制，從而預(yù)防和控制多重耐藥沙門菌，指導(dǎo)肉雞養(yǎng)殖企業(yè)合理使用抗生素具有著重要意義。