血竭醇提物對大鼠穿支皮瓣模型存活及PI3K/Akt/eNOS通路的影響

張麗 張揚 王緒平 黃孝聞 吳人杰 壽旦

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）23-3252-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.15

摘 要 目的：研究血竭醇提物對大鼠穿支皮瓣模型存活及PI3K/Akt/eNOS通路的影響。方法：采用只保留穿支血管切斷其他血管的方法復制大鼠穿支皮瓣模型，造模成功后，將大鼠分為模型組（外敷，生理鹽水）和血竭醇提取物（EESD，血竭素含量為75.08 mg/g）組（外敷，0.21 g/cm2），每組10只，連續(xù)敷藥7 d，每天1次。敷藥7 d后測定各組大鼠穿支皮瓣存活率、皮瓣微血管密度。將人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）缺氧缺糖16 h后復氧復糖復制HUVEC缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型，造模成功后，將細胞分為正常組、模型組和血竭素高、中、低濃度組（2.5、1.0、0.5 μg/mL），于復氧復糖培養(yǎng)24 h后，采用顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)，采用MTT法和比色法分別測定各組細胞的活性和細胞中一氧化氮（NO）的含量，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）和Western blot法檢測絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA的表達水平，PI3K蛋白的表達以及Akt、eNOS蛋白的磷酸化程度。結(jié)果：在大鼠實驗中，與模型組比較，EESD組大鼠穿支皮瓣存活率、微血管密度均顯著增加（P<0.01）。在細胞試驗中，與正常組比較，模型組HUVEC細胞存活率、NO含量，PI3K、Akt、eNOS mRNA的表達水平，PI3K蛋白的表達以及Akt、eNOS蛋白的磷酸化程度均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與模型組比較，血竭素高、中、低濃度組HUVEC細胞的存活率、NO含量，PI3K、Akt、eNOS mRNA的表達水平，PI3K蛋白的表達以及Akt、eNOS蛋白的磷酸化程度均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：EESD可提高大鼠穿支皮瓣模型的存活率，其機制可能與激活PI3K/Akt/eNOS通路保護內(nèi)皮細胞有關(guān)。

關(guān)鍵詞 血竭醇提物;血竭素;穿支皮瓣;絲氨酸/蘇氨酸激酶;磷脂酰肌醇-3-激酶;內(nèi)皮型一氧化氮合酶

Study on the Effects of Ethanol Extract of Sanguis Draconis on the Survival of Perforating Flap Model in Rats and PI3K/Akt/eNOS Pathway

ZHANG Li1，ZHANG Yang2，WANG Xuping2，HUANG Xiaowen2，WU Renjie2，SHOU Dan1（1.College of Pharmacy， Zhejiang University of TCM， Hangzhou 310053， China;2.Zhejiang Academy of TCM/TCM Research Center， Hangzhou 310007， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of ethanol extract of Sanguis Draconis on the survival of perforating flap model in rats and PI3K/Akt/eNOS pathway. METHODS： Perforating flap model was established by cutting off surrounding vessels and keeping one perforator. After modeling， the rats were divided into model group （external use， normal saline） and ethanol extract of Sanguis Draconis （EESD， the content of dracorhodin was 75.08 mg/g） group （external use， 0.21 g/cm2）， with 10 rats in each group. They were given relevant medicine for consecutive 7 days， once a day. The flap survival rate and flap microvessel density were determined after given relevant medicine 7 days. Human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） were reoxygenated and glycoconjugated 16 h after hypoxia and hypoglycemia to establish oxygen-glucose deprivation/oxygen-glucose recovery model of HUVECs. After modeling， model cells were divided into normal group， model group， dracorhodin high-concentration， medium- concentration and high-concentration groups （2.5， 1.0， 0.5 μg/mL）. After reoxygenated and glycoconjugated for 24 h， cells morphology was observed by microscope; cell viability and the content of NO were detected by MTT assay and colorimetry. mRNA expression of Akt， PI3K and eNOS， PI3K protein expression， the phosphorylation of Akt and eNOS protein were determined by RT-PCR and Western blot assay. RESULTS： In rat experiment， compared with model group， flap survival rate and microvessel density of rats were increased significantly in EESD group （P<0.01）. In cell experiment， compared with normal group， the survival rate of HUVEC， NO content， mRNA expression of PI3K， Akt， eNOS，PI3K protein expression， the phosphorylation of Akt and eNOS protein were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with model group， dracorhodin high-concentration， medium-concentration and high-concentration groups survival rate of HUVEC cells， NO content， mRNA expression of PI3K， Akt and eNOS， PI3K protein expression， the phosphorylation of Akt and eNOS protein were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： The survival rate of perforating flap model in rat can be increased by treating with EESD， the mechanism of which may be associated with the activation of PI3K/Akt/eNOS pathway to protect endothelial cells.

KEYWORDS ? Ethanol extract of Sanguis Draconis; Dracorhodin; Perforating flap; Akt; PI3K; eNOS

小腿遠端及足踝部創(chuàng)面缺損常使得骨骼、肌腱外露，常采用植皮進行處理，但是植皮不易成活，因此臨床上常應用皮瓣移植修復，一般來說術(shù)后功能恢復良好。穿支皮瓣是指僅以管徑細小的皮膚穿支血管供血的皮瓣，是皮瓣移植修復中的一種方法，具有切取范圍小，不切斷肌肉、神經(jīng)，不損傷主干血管，安全性高等優(yōu)點，廣泛應用于創(chuàng)傷修復、燒傷、軟組織缺損重建等[1]。然而，穿支血管一般管徑細小，供區(qū)面積有限，使其在體表大面積缺損修復中的應用受到限制，皮瓣遠端易發(fā)生缺血性壞死[2]，導致患者需要再次手術(shù)，延長住院時間、增加治療費用[3-4]。因此，提高患者皮瓣存活率，對改善穿支皮瓣臨床應用具有重要意義。相關(guān)研究表明，穿支皮瓣遠端組織血液灌注不充分及缺血再灌注損傷是導致皮瓣壞死的主要原因[5]。缺血再灌注時，釋放過多的氧自由基，導致脂質(zhì)過氧化，進而引起細胞損傷，導致皮瓣缺血區(qū)域持續(xù)性損傷[6]。因此，抑制氧自由基是促進穿支皮瓣存活的主要策略。中藥血竭在活血散瘀、止血、止痛和生肌斂瘡等方面具有確切療效，血竭素是其中主要有效成分;現(xiàn)代研究證實，血竭具有改善局部血循環(huán)、清除氧自由基、抑制血小板聚集等多種藥理活性[7-8]。血竭素可通過促進血管內(nèi)皮生長因子表達，誘導血管生成，提高組織供氧，加快創(chuàng)面愈合[9]。

目前，血竭及血竭素對穿支皮瓣作用的研究較少，本研究通過復制大鼠穿支皮瓣模型，術(shù)后給予血竭醇提物（EESD），研究其對大鼠穿支皮瓣存活以及微血管密度的影響。在血管內(nèi)壁的形成過程中，覆蓋在血管內(nèi)腔表面的血管內(nèi)皮細胞具有血管收縮和舒張以及血管生成等生物學功能，而人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）是在進行血管內(nèi)皮細胞試驗時常選用的細胞模型[10]。因此，本研究也復制HUVEC缺氧缺糖/復氧復糖細胞模型，并給予血竭素，然后檢測HUVEC細胞活性、一氧化氮（NO）含量和絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表達以及PI3K、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、eNOS、磷酸化eNOS（p-eNOS）蛋白表達，探究血竭中主要有效成分血竭素對PI3K/Akt/eNOS通路的影響，以期為血竭的臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）;ECLIPSE TS100-F倒置顯微鏡 （日本Nikon公司）;MRZ14M010高速冷凍離心機（美國Beckman公司）;SpectraMax190多功能酶標儀（上海美谷分子儀器有限公司）;ChemiDoc XRS凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）;ABI7500實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）;Periflux System 5000激光多普勒儀（瑞典Perimed公司）。

1.2 藥品與試劑

血竭（杭州華東醫(yī)藥有限公司，批號：20180314）經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院俞忠明副研究員鑒定為棕櫚科植物麒麟竭（Daemonorops draco Bl.）果實的樹脂;EESD（浙江省中醫(yī)藥研究院自制，其中血竭素含量為75.08 mg/g）;血竭素高氯酸鹽（天然血竭素的一種人工合成替代品，中國食品藥品檢定研究院，批號：180922，純度：≥99%）;NO試劑盒（南京建成生物科技有限公司，批號：20190122）;MTT（安徽Biosharp公司，批號：KGA312）;BCA蛋白定量試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：KGP902）;Trizol試劑（美國Ambion公司，批號：213408）;二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma-Aldrich公司，批號：WXBC1590V）;定量PCR試劑盒 （杭州博日科技有限公司，批號：BSB03L1）;PCR引物（上海生工生物公司）; 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號：ab6721）、PI3K（批號：ab32089）、Akt（批號：ab32089）、p-Akt （批號：ab32505）、p-eNOS（批號：ab184154）、eNOS（批號：ab199956）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（批號：ab6721）抗體均購自英國Abcam公司。

1.3 動物

SD大鼠，♂，體質(zhì)量（250±20） g，購于浙江省動物實驗中心，動物實驗許可證號：SYXK（浙）2019-0010。

1.4 細胞

HUVEC細胞由中國科學院上海細胞庫提供。

2 方法

2.1 大鼠實驗

2.1.1 造模、給藥與分組 取20只SD大鼠，腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉處理，于大鼠腹部劍突下方1 cm處，在下緣連接兩個髂前上棘處設計三角形皮瓣，掀起皮瓣后保留上腹血管和穿支血管，切斷其他血管，原位縫合皮瓣。采用激光多普勒儀檢測皮瓣血流，當切斷血管位置的灌流量≤10 PU，上腹血管和穿支血管灌流量≥30 PU表明大鼠穿支皮瓣模型造模成功[11]。造模后，將大鼠分為模型組（外敷，生理鹽水）和EESD組（外敷，0.21 g/cm2，根據(jù)臨床外用劑量換算而得），每組10只，連續(xù)敷藥7 d，每天1次。

2.1.2 大鼠穿支皮瓣存活率測定 敷藥后，肉眼觀察各組大鼠穿支皮瓣的成活情況，包括皮瓣的顏色、腫脹程度及壞死面積等。在敷藥后第3 d和第7 d，拍攝各組大鼠穿支皮瓣的圖片，并用Image-Pro Plus 6.0 軟件計算各組大鼠穿支皮瓣存活率，穿支皮瓣成活率（%）=穿支皮瓣存活面積/皮瓣總面積×100%。

2.1.3 穿支皮瓣病理學檢查和微血管密度檢測 敷藥7 d后，各組大鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死。取各組大鼠腹部穿支皮瓣組織于4%多聚甲醛中固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，然后于光學顯微鏡下（×200）分別觀察各組大鼠穿支皮瓣的成纖維細胞增生、中性粒細胞浸潤、肉芽組織生長的情況;每張切片隨機選取3個不同視野進行微血管斷面計數(shù)，以微血管斷面平均數(shù)作為微血管密度。

2.2 細胞試驗

2.2.1 HUVEC細胞缺氧缺糖/復氧復糖模型的建立及分組 當HUVEC細胞生長密度達80%～85%時，更換成DMEM無糖培養(yǎng)基，放入?yún)捬鹾袃?nèi)進行缺氧培養(yǎng)16 h后，加入正常細胞培養(yǎng)液，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，即建立HUVEC細胞缺氧缺糖/復氧復糖模型[12]。本研究將細胞分為正常組、模型組和血竭素高、中、低濃度組（2.5、1.0、0.5 μg/mL）;正常組不加藥正常培養(yǎng)，模型組缺糖缺氧培養(yǎng)16 h后，復糖復氧培養(yǎng)24 h，血竭素高、中、低濃度組細胞缺糖缺氧培養(yǎng)16 h后，按上述劑量給藥，再復糖復氧培養(yǎng)24 h。

2.2.2 MTT法檢測HUVEC細胞存活率 各組細胞（每組平行6孔）復糖復氧培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去MTT及培養(yǎng)基，再加入200 μL DMSO，振蕩 10 min后，置于酶標儀，在490 nm波長下測定吸光度，并計算細胞存活率，細胞存活率（%）=（試驗組吸光度/正常組吸光度）×100%。

2.2.3 血竭素對HUVEC細胞中NO含量的影響 取對數(shù)生長期的HUVEC細胞，以每孔5×105 mL-1接種于96孔培養(yǎng)板中，分為正常組、模型組和血竭素高、中、低劑量組，每組平行6孔，按“2.2.1”項下方法進行缺氧缺糖/復氧復糖處理，然后取各組細胞培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，根據(jù)NO試劑盒說明書操作方法檢測細胞上清液中的NO含量。

2.2.4 Akt、PI3K、eNOS的mRNA表達檢測 取對數(shù)生長期的HUVEC細胞，以每孔5×105 mL-1接種于6孔培養(yǎng)板中，分為正常組、模型組和血竭素高、中、低濃度組，每組平行6孔，按“2.2.1”項下方法進行缺氧缺糖/復氧復糖處理后，按Trizol說明書提取各組細胞的總RNA，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR反應擴增程序為94 ℃ 2 min;94 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s;共40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后繪制熔融曲線，并用2-ΔΔct法分析數(shù)據(jù)。引物序列見表1。

2.2.5 Western blot法檢測Akt、PI3K、eNOS、p-Akt、p- eNOS蛋白的表達 取對數(shù)生長期的HUVEC細胞，以每孔5×105 mL-1接種于6孔培養(yǎng)板中，分為正常組、模型組和血竭素高、中、低濃度組，每組平行6孔，按“2.4”項下方法進行缺氧缺糖/復氧復糖處理后，收集各組細胞，裂解，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，變性5 min，每組取蛋白20 μg，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離蛋白，再轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，室溫下，5%BSA封閉0.5 h，分別加入Akt、p-Akt、PI3K、eNOS、p-eNOS一抗 ?（1 ∶ 1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，次日加二抗（1 ∶ 2 000稀釋）室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，用化學發(fā)光底物試劑檢測，采用Image Lab軟件測定蛋白灰度值對蛋白進行定量分析，并以p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS表示相應蛋白的磷酸化程度。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s的形式表示，采用單因素方差分析進行組間比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠實驗結(jié)果

3.1.1 EESD對大鼠穿支皮瓣模型存活的影響結(jié)果 敷藥后第1 d，2組大鼠穿支皮瓣均有不同程度的腫脹，皮瓣遠端區(qū)域呈深紫色，無明顯壞死;敷藥后第3 d，2組大鼠穿支皮瓣出現(xiàn)局灶性壞死伴充血，且顏色發(fā)黑;敷藥后第 7 d，2組大鼠的穿支皮瓣壞死部位開始融合、結(jié)痂和硬化，針刺無流血，壞死和存活部位之間的界限穩(wěn)定，存活部位毛發(fā)開始生長。與模型組比較，敷藥后第3、7 d，EESD組的穿支皮瓣存活率顯著升高（P<0.01）。各組大鼠穿支皮瓣存活率測定結(jié)果見表2。

3.1.2 各組大鼠穿支皮瓣病理學檢查及微血管密度檢測 各組大鼠穿支皮瓣病理學敷藥后第7 d，觀察各組大鼠穿支皮瓣的HE染色切片結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組[微血管密度為（12.09±2.30）個/mm2]比較，EESD組[微血管密度為（28.56±2.33）個/mm2]成纖維細胞增多，肉芽組織較薄，彌漫性中性粒細胞浸潤減少，毛細血管擴張，組織水腫和炎性細胞減少，微血管密度顯著增加（P<0.05）。各組大鼠穿支皮瓣病理學觀察圖見圖1。

3.2 細胞試驗結(jié)果

3.2.1 各組HUVEC細胞存活率檢測結(jié)果 與正常組比較，模型組HUVEC細胞存活率顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，血竭素高、中、低濃度組HUVEC細胞存活率顯著升高（P<0.05），且隨著給藥濃度的增加，細胞存活率增加。各組HUVEC細胞存活率測定結(jié)果見表3。

3.2.2 各組HUVEC細胞中NO含量的檢測結(jié)果 與正常組比較，模型組HUVEC細胞中的NO含量顯著降低 （P<0.01）;與模型組比較，血竭素高、中、低濃度組HUVEC細胞中NO含量顯著升高（P<0.01），且隨給藥濃度的增加，NO含量增加。各組HUVEC細胞中NO含量的測定結(jié)果見表4。

3.2.3 各組HUVEC細胞中PI3K、Akt和eNOS mRNA表達的檢測結(jié)果 與正常組比較，模型組HUVEC細胞中PI3K、Akt、eNOS mRNA的表達水平顯著降低（P<0. 05）;與模型組比較，血竭素高、中、低濃度組HUVEC細胞中PI3K、Akt、eNOS mRNA的表達水平均顯著升高（P<0.05）。各組HUVEC細胞中PI3K、Akt、eNOS mRNA的表達水平檢測結(jié)果見圖2。

3.2.4 各組HUVEC細胞中PI3K、Akt、eNOS、p-Akt、p-eNOS蛋白表達結(jié)果 與正常組比較，模型組HUVEC細胞中PI3K蛋白的表達以及Akt、eNOS蛋白的磷酸化程度均顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，血竭素高、中、低濃度組HUVEC細胞PI3K蛋白的表達以及Akt、eNOS蛋白的磷酸化程度均顯著升高（P<0.05）。各組HUVEC細胞中PI3K、Akt、eNOS、p-Akt、p-eNOS蛋白表達的電泳圖見圖3，定量分析結(jié)果見圖4。

4 討論

血竭是由棕櫚科植物麒麟竭的樹脂經(jīng)加工制成的，主要成分為血竭素[13-14]。本試驗前期采用95%乙醇提取、濃縮，制備EESD，并采用血竭素作為質(zhì)控指標，經(jīng)檢測血竭醇提物中血竭素的含量為75.08 mg/g。作為血竭中的主要活性成分，血竭素具有改善血液循環(huán)，促進血管增生等作用[15]，但血竭素單體的存在形式不穩(wěn)定，易被還原，通常以鹽的形式存在，血竭素高氯酸鹽為血竭中活性成分血竭素的穩(wěn)定態(tài)，因此，在研究血竭素對內(nèi)皮細胞的保護作用時，選取血竭素高氯酸鹽作為細胞試驗的受試藥物。

穿支皮瓣壞死主要發(fā)生在遠端潛在區(qū)，遠端皮瓣無法獲得足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，進而引起皮瓣壞死[16]。本研究動物實驗中模型組和EESD組在給藥前期均發(fā)生穿支皮瓣遠端壞死的情況，但EESD給藥7 d后，EESD組穿支皮瓣存活率顯著高于模型組。缺血再灌注損傷和微循環(huán)功能障礙是阻礙穿支皮瓣存活的主要原因，缺血再灌注后產(chǎn)生大量活性氧（ROS），破壞微循環(huán)，從而引起內(nèi)皮細胞腫脹[17]。本研究提示，EESD可通過加速血管形成來改善穿支皮瓣的存活。

血管內(nèi)皮細胞是血流和血管之間的單層扁平細胞，受損后內(nèi)皮性NO釋放減少[18]。NO是細胞和細胞間重要的信號傳導因子，內(nèi)皮性NO可減少ROS的產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過氧化。此外，NO也可抑制血小板黏附和聚集，抑制黏附分子和趨化因子的表達以及減少炎癥細胞浸潤[19-20]，對內(nèi)皮細胞起保護作用。相關(guān)研究表明，抑制eNOS可消除NO對缺血再灌注損傷的保護作用，且該保護作用與PI3K/Akt信號通路引起的eNOS上調(diào)相關(guān)[21-22]。本研究細胞試驗結(jié)果顯示，HUVEC細胞缺氧缺糖后NO含量明顯減少，給予血竭素后，HUVEC細胞中的NO含量增加;提示血竭素能夠通過抗氧化作用，發(fā)揮其對HUVEC缺氧缺糖損傷細胞的保護作用。Western blot結(jié)果也顯示，HUVEC缺氧缺糖后PI3K蛋白表達下降，Akt、eNOS蛋白的磷酸化程度降低，而給予血竭素后Akt，eNOS磷酸化程度顯著升高（P<0.05）。

綜上所述，EESD可有效促進穿支皮瓣新生血管形成，改善穿支皮瓣的活存率。該過程可能與其中的有效成分血竭素激活PI3K/Akt/eNOS信號通路，促進NO生成，進而維持內(nèi)皮細胞正常功能密切相關(guān)。本研究可為中藥血竭促進皮瓣移植存活的臨床應用提供新的思路和治療策略。

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（收稿日期：2019-07-10 修回日期：2019-08-15）

（編輯：唐曉蓮）