參蓉補(bǔ)腦膠囊對老年癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及機(jī)制研究

屈相玲 樸春梅 熊成歡 李平 劉明 周訓(xùn)蓉

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）23-3221-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.23.10

摘 要 目的：研究參蓉補(bǔ)腦膠囊對老年癡呆（AD）模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，并探討其作用機(jī)制。方法：將72只小鼠隨機(jī)分為空白對照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、吡拉西坦片組（陽性對照，0.80 g/kg）和參蓉補(bǔ)腦膠囊高、中、低劑量組（1.92、0.96、0.48 g/kg），每組12只;除空白對照組小鼠皮下注射等量生理鹽水外，其余各組小鼠均每日皮下注射D-半乳糖（150 mg/kg）和腹腔注射亞硝酸鈉（50 mg/kg）復(fù)制AD小鼠模型;并于造模同時(shí)灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)60 d。末次給藥1 h后，設(shè)計(jì)水迷宮實(shí)驗(yàn)測定小鼠逃避潛伏期和90 s內(nèi)穿越平臺(tái)位置的次數(shù)，蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察小鼠大腦皮層病理變化，并采用免疫組織化學(xué)法檢測小鼠大腦皮層腫瘤壞死因子α（TNF-α）、核轉(zhuǎn)錄因子кB p65（NF-кB p65）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和磷酸化蛋白激酶（Akt）蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與空白對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長（P<0.01），90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P<0.01）;大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞明顯損傷，完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<0.01）;大腦皮層TNF-α、NF-кB p65、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，除參蓉補(bǔ)腦膠囊低劑量小鼠的逃避潛伏期和大腦皮層TNF-α、NF-кB p65、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P>0.05），其余各給藥組小鼠上述指標(biāo)均明顯改善（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：參蓉補(bǔ)腦膠囊能改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力;其機(jī)制可能與其抑制小鼠大腦皮層TNF-α、NF-кB p65、PI3K、Akt蛋白的表達(dá)，減輕炎癥損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞 參蓉補(bǔ)腦膠囊;老年癡呆模型;核轉(zhuǎn)錄因子кB p65;磷脂酰肌醇3-激酶;磷酸化蛋白激酶;腫瘤壞死因子α;小鼠

Improvement Effects of Shenrong Bunao Capsule on Learning and Memory Ability of Alzheimer’s Disease Model Mice and Its Mechanism Study

QU Xiangling1，PU Chunmei1，XIONG Chenghuan1，LI Ping1，LIU Ming2，ZHOU Xunrong1（1.Dept. of Pharmacy， Second Affiliated Hospital of Guizhou University of TCM， Guiyang 550003， China;2.Basic Medical School， Guizhou University of TCM， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effect of Shenrong bunao capsule on learning and memory ability of Alzheimer’s disease （AD） model mice， and to investigate its mechanism. METHODS： Totally 72 mice were randomly divided into blank control group （normal saline）， model group （normal saline）， Piracetam tablets group （positive control，0.80 g/kg），Shenrong bunao capsule high-dose，middle-dose and low-dose groups （1.92， 0.96， 0.48 g/kg）， with 12 mice in each group. Except that blank control group was given constant volume of normal saline subcutaneously. Other groups were given D-galactose （150 mg/kg） subcutaneously and sodium nitrite （50 mg/kg） intraperitoneally every day to induce AD model. At the same time，they were given relevant medicine intragastrically，once a day， for consecutive 60 d. 1 h after last administration， Morris water maze test was used to measure escape latency and times of crossing the platform within 90 s. HE staining was used to observe pathological changes of cerebral cortex in mice. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of TNF-α， NF-κB p65， PI3K and Akt in cerebral cortex of mice. RESULTS： Compared with blank control group， escape latency was prolonged significantly （P<0.01）， and the times of crossing the platform within 90 s was decreased significantly in model group （P<0.01）. The neurons in cerebral cortex was damaged obviously， and the number of intact neurons was decreased significantly （P<0.01）. The protein expressions of TNF-α， NF-κB p65， PI3K and Akt in cerebral cortex were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， except that there was no statistical significance in escape latency， protein expressions of TNF-α， NF-кB p65， PI3K and Akt in Shenrong bunao capsule low-dose group （P>0.05）， above indexes of other administration groups were improved significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Shenrong bunao capsule can improve the learning and memory ability of AD model mice， and its mechanism may be related to the inhibiting the protein expressions of TNF-α，NF-κB p65， PI3K and Akt in cerebral cortex region and relieving inflammation injury so as to protect cranial nerve.

KEYWORDS Shenrong bunao capsule; Alzheimer’s disease model; NF-кB p65; PI3K; Akt; TNF-α; Mice

老年癡呆癥又稱阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病，臨床表現(xiàn)為記憶力減退和認(rèn)知功能障礙。該病的患病率在5%左右，并呈逐年上升趨勢，且目前尚無特效治療藥物[1]。參蓉補(bǔ)腦膠囊（曾用名為參茸補(bǔ)腦膠囊、補(bǔ)腦Ⅰ號(hào)）是貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院的醫(yī)院制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：黔藥制字Z20170088），由人參、制遠(yuǎn)志、石菖蒲等九味中藥組成，具有補(bǔ)心腎、通絡(luò)閉、開清竅、心腎并調(diào)的功能，對治療健忘、輕度認(rèn)知功能障礙有較好療效[2]，其可能在AD治療中具有潛在應(yīng)用價(jià)值[3]。已有研究表明，D-半乳糖聯(lián)合亞硝酸鈉誘導(dǎo)小鼠60 d后，可出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力降低等AD病樣特征[4]。炎癥作為一個(gè)重要因素在AD的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用[5-6]，而核轉(zhuǎn)錄因子кB（NF- ?κB）是炎癥反應(yīng)細(xì)胞傳導(dǎo)通路的始動(dòng)因素之一，受到諸如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/磷酸化蛋白激酶（Akt）的調(diào)節(jié)，與AD發(fā)病具有重要關(guān)聯(lián)[7-9]。鑒于此，本研究利用D-半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合誘導(dǎo)復(fù)制小鼠AD模型，研究參蓉補(bǔ)腦膠囊對AD模型小鼠大腦皮層TNF-α、NF-кB p65、PI3K、Akt蛋白表達(dá)的影響，為初步闡明參蓉補(bǔ)腦膠囊通過抑制炎癥損傷治療AD的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（深圳瑞沃德生命科技有限公司）;RM2245石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）;KD-BM包埋機(jī)（浙江金華科迪有限公司）;XSZ-HS3顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）;Image-Pro Plus 多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

1.2 藥品與試劑

參蓉補(bǔ)腦膠囊（貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，批號(hào)：20170612，規(guī)格：每粒裝0.48 g）;吡拉西坦片（宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20170203，規(guī)格：0.4 g）;D-半乳糖（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：0902c052）;亞硝酸鈉（四川金山制藥有限公司，批號(hào)：170801）;TNF-α、NF-кB p65、PI3K、Akt兔抗小鼠多克隆抗體（美國Abcam公司）;生物素化山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠72只，SPF級(jí)，♀♂各半，體質(zhì)量（20±2） g，由原中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2015-0003]。實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)：20170728。小鼠購入后飼以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水，♀♂小鼠分籠飼養(yǎng)（6只/籠），飼養(yǎng)于人工黑暗和光照交替（12 h/12 h）、溫度22 ℃左右、濕度50%左右的環(huán)境中。所有小鼠的健康狀態(tài)均良好。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

參照文獻(xiàn)[4，10-11]復(fù)制AD小鼠模型。將小鼠隨機(jī)分成空白對照組、模型組、吡拉西坦片組（0.80 g/kg，人臨床用量的10倍）和參蓉補(bǔ)腦膠囊高、中、低劑量組（1.92、0.96、0.48 g/kg，分別為臨床人用量的20、10、5倍），每組12只。除空白對照組小鼠皮下注射等量生理鹽水，其余各組小鼠均皮下注射D-半乳糖（150 mg/kg）和腹腔注射亞硝酸鈉（50 mg/kg）復(fù)制AD小鼠模型，每天1次。并于造模的同時(shí)，灌胃相應(yīng)藥物（0.2 mL/10 g），連續(xù)給藥60 d;正常對照組和模型組小鼠同法給予生理鹽水。

2.2 指標(biāo)檢測

2.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測定小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力 于給藥第57 天時(shí)開始進(jìn)行水迷宮預(yù)實(shí)驗(yàn)，每天檢測2次，共檢測6次，每次檢測90 s，若小鼠90 s未找到平臺(tái)，將其拿到平臺(tái)上并停留15 s。第60天末次給藥1 h后，正式檢測并記錄小鼠從入水到找到平臺(tái)所需的時(shí)間（逃避潛伏期，s）;6 h后撤除平臺(tái)，觀察并記錄90 s內(nèi)小鼠穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)（穿越平臺(tái)次數(shù)）。

2.2.2 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察小鼠大腦皮層病理學(xué)變化 上述Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)取6只小鼠（♀♂各半），腹腔注射水合氯醛麻醉，取大腦，置于4%多聚甲醛固定48 h，常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制作多張石蠟切片（5 μm）。每只小鼠取一張石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、酒精復(fù)水、蘇木精染色、蒸餾水沖洗、酒精固定、伊紅復(fù)染、二甲苯透明后中性樹膠封片。每張HE染色切片在同一側(cè)同一部位大腦皮層區(qū)拍照，用Imagepro Plus軟件進(jìn)行圖像分析，觀察神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并計(jì)數(shù)200倍視野內(nèi)完整神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目。

2.2.3 免疫組織化學(xué)法測定小鼠大腦皮層TNF-α、NF- ?кB p65、PI3K、Akt蛋白表達(dá) 取“2.2.2”項(xiàng)下制備好的空白石蠟切片，常規(guī)脫蠟，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，微波抗原修復(fù)20 min，PBS漂洗，過氧化氫處理，PBS再次漂洗;滴加兔抗鼠TNF-α或NF-κB p65或PI3K或Akt抗體（1 ∶ 100），暗濕盒4 ℃孵育過夜;PBS漂洗，滴加生物素化山羊抗兔 IgG抗體，室溫孵育20 min;滴加鏈霉素親和素-生物素復(fù)合物（SABC），室溫孵育20 min，二喹啉甲酸（DAB）顯色，蘇木精輕度復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片，在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察同一側(cè)同一部位大腦皮層區(qū)TNF-α、NF-кB p65、PI3K、Akt陽性細(xì)胞，以神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。用Imagepro Plus軟件進(jìn)行圖像分析，測定積分光密度（IOD）值。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者用LSD法進(jìn)行比較，方差不齊者用Games-Howell 法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

與空白對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著延長（P<0.01），90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P<0.01）。與模型組比較，吡拉西坦片組和參蓉補(bǔ)腦膠囊高、中劑量組小鼠逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05），各給藥組小鼠90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P<0.05或P<0.01），表明參蓉補(bǔ)腦膠囊具有改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。各組小鼠逃避潛伏期和90 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)測定結(jié)果見表1。

3.2 小鼠大腦皮層病理學(xué)觀察結(jié)果

空白對照組小鼠大腦皮層可見少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整;模型組小鼠大腦皮層可見較多膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)細(xì)胞變性固縮，排列散亂，胞體皺縮，完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)較空白對照組明顯減少（P<0.01）;吡拉西坦片組小鼠大腦皮層可見少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，有少數(shù)變性固縮神經(jīng)細(xì)胞，完整神經(jīng)細(xì)胞較多;參蓉補(bǔ)腦膠囊高劑量組小鼠大腦皮層可見少數(shù)膠質(zhì)細(xì)胞增生，有少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞變性固縮，完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)較多，結(jié)果與吡拉西坦片組相似;參蓉補(bǔ)腦膠囊中劑量組小鼠大腦皮層病理情況與高劑量組相似;但參蓉補(bǔ)腦膠囊低劑量組小鼠大腦皮層可見較多膠質(zhì)細(xì)胞增生，較多神經(jīng)細(xì)胞變性固縮，完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)比參蓉補(bǔ)腦膠囊中劑量組少。各給藥組與模型組比較，神經(jīng)細(xì)胞變性固縮較少，結(jié)構(gòu)完整可辨的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)均顯著增多（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠大腦皮層完整神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量測定結(jié)果見表2、圖1。

3.3 小鼠大腦皮層TNF-α、NF-кB p56、PI3K、Akt蛋白表達(dá)測定結(jié)果

與空白對照組比較，模型組小鼠大腦皮層TNF-α、NF-кB p65、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，除參蓉補(bǔ)腦膠囊低劑量組外，其余各給藥組小鼠大腦皮層TNF-α、NF-кB p65、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠大腦皮層TNF-α、NF-кB p65、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果見圖2、表3。

4 討論

小鼠長期注射 D-半乳糖后造成自由基代謝紊亂，過量的自由基攻擊細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸形成脂質(zhì)過氧化物，破壞神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常;而亞硝酸鈉進(jìn)入機(jī)體后，能與血紅蛋白結(jié)合形成高鐵血紅蛋白，使其攜氧能力下降，引起腦組織缺血缺氧，從而出現(xiàn)記憶障礙[12]。吡拉西坦片是一種經(jīng)典的腦代謝活化劑，能夠增加腦血流量，促進(jìn)代謝，增強(qiáng)腦部左、右兩半球間神經(jīng)信息的傳遞，具有較強(qiáng)的抗腦缺氧作用，可保護(hù)外源性傷害性刺激對大腦的損害，改善學(xué)習(xí)和記憶能力，且具有顯著抑制炎癥反應(yīng)的作用[13]，故本研究以其為陽性對照藥。

炎癥作為一個(gè)獨(dú)立的因素在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用[5]。有研究人員指出，炎癥與癡呆密切相關(guān)[14-15]，藥物可通過抑制炎癥反應(yīng)改善AD動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力[11，13，16]。在AD的發(fā)展過程中，膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量的促炎因子（如TNF-α等）參與神經(jīng)炎癥，如果炎癥長時(shí)間得不到有效控制，會(huì)釋放大量的有毒物質(zhì)，進(jìn)一步損傷大腦，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡，從而影響患者的記憶力。NF-κB是炎癥反應(yīng)細(xì)胞傳導(dǎo)通路的始動(dòng)因素之一，受到諸如TNF-α及PI3K/ Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)[7-9，17]。P13K/Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路能調(diào)控神經(jīng)元存活，阻止神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)老齡神經(jīng)元突觸再生[18-19]。因此，在AD的治療過程中有效控制炎癥反應(yīng)顯得尤為重要。故本研究針對小鼠大腦皮層TNF-α、NF-κB、PI3K、Akt蛋白表達(dá)，探討了炎癥與AD治療的關(guān)系。

本研究結(jié)果表明，采用D-半乳糖和亞硝酸鈉聯(lián)合給藥成功復(fù)制了AD小鼠模型，模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低，大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷明顯，且大腦皮層TNF-α、NF-κB、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平顯著升高，說明炎癥損傷參與了AD的形成。參蓉補(bǔ)腦膠囊給藥治療后，能夠顯著降低AD模型小鼠大腦皮層TNF-α、NF-κB、PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平，保護(hù)大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞，改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。該研究結(jié)果為參蓉補(bǔ)腦膠囊臨床用于治療AD提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2019-06-20 修回日期：2019-09-26）

（編輯：林 靜）