葡萄糖對(duì)冷凍干燥血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響

宋 璇，侯成立，李 錚，王文婷，吳立國(guó)，朱 杰*，張德權(quán),*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，生物物理研究所，生物力學(xué)與工程研究室，陜西 楊凌 712100；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

葡萄糖對(duì)冷凍干燥血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響

宋 璇1,2，侯成立2，李 錚2，王文婷1,2，吳立國(guó)2，朱 杰1,*，張德權(quán)2,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，生物物理研究所，生物力學(xué)與工程研究室，陜西 楊凌 712100；

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

以豬血紅蛋白為研究對(duì)象，研究添加5 g/100 mL的葡萄糖對(duì)冷凍干燥血紅蛋白色差值和水分含量的影響，分析不同pH值、溫度和NaCl濃度對(duì)血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：添加葡萄糖能夠顯著提高血紅蛋白的亮度L*值和紅綠度a*值，并且降低高鐵血紅蛋白含量（P＜0.05）；添加葡萄糖可顯著提高血紅蛋白對(duì)pH值、溫度、NaCl濃度的穩(wěn)定性（P＜0.05）。當(dāng)pH 7、溫度低于60 ℃、NaCl濃度為0.6 mol/L時(shí)葡萄糖處理組中血紅蛋白的穩(wěn)定性最高。

血紅蛋白；葡萄糖；冷凍干燥；穩(wěn)定性

血液是動(dòng)物屠宰后的主要加工副產(chǎn)物，含有大量的蛋白質(zhì)，但目前血液的綜合利用率不足30%。血液由血漿（65%）和血細(xì)胞（35%）組成，其中血紅蛋白約占血細(xì)胞的90%。血紅蛋白具有天然的紅色，可以作為天然色素應(yīng)用于食品的加工中[1-3]。工業(yè)生產(chǎn)中為方便血紅蛋白色素的運(yùn)輸和保藏，將血紅蛋白干燥，制備為粉末產(chǎn)品，目前常見的干燥方式有噴霧干燥和真空冷凍干燥兩種，在噴霧干燥過程中蛋白質(zhì)會(huì)在短時(shí)的高溫條件下發(fā)生氧化和變性，影響蛋白質(zhì)的品質(zhì)。其在干燥過程中會(huì)發(fā)生各種物理、化學(xué)或生物學(xué)的變化，這些變化會(huì)導(dǎo)致血紅蛋白的穩(wěn)定性降低從而致使其利用率降低。主要原因?yàn)檠t蛋白含有亞鐵離子，在噴霧干燥過程中與空氣接觸后，與氧分子以配位鍵絡(luò)合，成為氧合血紅蛋白，呈鮮紅色；氧合血紅蛋白不穩(wěn)定，在氧或氧化劑的作用下，亞鐵被氧化成高鐵，配位的氧原子變成共價(jià)鍵連接的羥基，形成高鐵血紅蛋白，從而呈褐色[4]，因此限制了血紅蛋白的使用。

相對(duì)于噴霧干燥，真空冷凍干燥在低溫、低氧條件下進(jìn)行，能夠最大程度地保護(hù)蛋白質(zhì)等大分子活性物質(zhì)的性質(zhì)不受影響[5-6]。但蛋白質(zhì)在冷凍干燥過程中表面殘留的水分會(huì)形成冰晶，破壞蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。此前，有研究者通過加入多糖研究血紅蛋白的低溫穩(wěn)定性，結(jié)果表明多糖能夠維持血紅蛋白形態(tài)的穩(wěn)定，同時(shí)防止其氧化為高鐵血紅蛋白[7]。葡萄糖作為一種親水性物質(zhì)在冷凍干燥過程中能夠與血紅蛋白表面的水分結(jié)合，從而能夠保護(hù)血紅蛋白在冷凍干燥過程中的高級(jí)結(jié)構(gòu)不被破壞。但目前對(duì)于添加葡萄糖對(duì)血紅蛋白穩(wěn)定性研究較少。

本研究采用葡萄糖作為血紅蛋白冷凍干燥過程中的低溫保護(hù)劑，研究了添加葡萄糖對(duì)血紅蛋白色差值和水分含量的影響，分析了pH值、溫度變化和NaCl濃度對(duì)血紅蛋白穩(wěn)定性的影響，以期為推進(jìn)血紅蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬血 北京市第五肉聯(lián)廠；檸檬酸鈉、NaCl、NaOH、葡萄糖均為國(guó)產(chǎn)分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MS204S電子天平、FE20 pH計(jì)、MJ33快速水分測(cè)定儀 瑞士梅特勒-托利多公司；himac CR 22 GⅡ低溫冷凍高速離心機(jī) 日本日立制作所；DK-S28電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV1800紫外分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；Digieye電子眼英國(guó)Verivide公司；KH7200DE型數(shù)據(jù)超聲波清洗儀昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；EMS-19磁力攪拌器 天津歐諾儀器股份有限公司；LGJ-25型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；Tensor27傅里葉變換紅外光譜儀美國(guó)布魯克光譜儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 血紅蛋白的提取

電刺激后屠宰放血，向新鮮血液中按照1∶9（V/V）加入3.8 g/100 mL的檸檬酸鈉溶液。收集血液，輕微搖晃，使之與血液混勻。低溫（4～7 ℃）條件下運(yùn)回肉品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，將抗凝血置于離心管中以3 000 r/min離心20 min。棄去上清液，取下部分血細(xì)胞，加入等體積的生理鹽水清洗附著在紅細(xì)胞膜表面的血漿，收集血細(xì)胞[8-9]。采用超聲法對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行破碎[10-11]，按照血漿與超純水比例為1∶2的體積比例混合，超聲功率250 W、頻率25 kHz、超聲處理15 min，之后從超聲儀中取出置于離心管中，將溶液以8 000 r/min離心20 min，棄去沉淀，所得上清液為血紅蛋白粗提取液。在避光情況下，于60 ℃水浴加熱30 min。以6 000 r/min離心30 min，取上清液，得到血紅蛋白。

將提取的血紅蛋白平均分為6 份，其中3 份作為對(duì)照組不添加任何試劑；其他3 份作為葡萄糖處理組，在每份中加入5 g/100 mL的葡萄糖[12-13]，室溫條件下在磁力攪拌器中攪拌混勻。將以上不同處理的血紅蛋白置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥。凍干條件為：冷阱溫度－60 ℃、真空度1.0 Pa、干燥時(shí)間48 h。

1.3.2 血紅蛋白的紅外光譜分析

取添加5 g/100 mL葡萄糖及未添加葡萄糖的血紅蛋白干燥樣品，置于中紅外下掃描光譜，以空氣為空白對(duì)照。

1.3.3 血紅蛋白的紫外全波長(zhǎng)掃描

分別對(duì)添加葡萄糖和未添加葡萄糖的血紅蛋白樣品進(jìn)行紫外-可見光譜分析，觀察500～600 nm波長(zhǎng)處的血紅蛋白紫外吸收?qǐng)D譜，與報(bào)道的血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的紫外圖譜進(jìn)行對(duì)比[14-15]。

1.3.4 添加葡萄糖對(duì)血紅蛋白色差值和3 種形態(tài)血紅蛋白含量的影響

利用Digieye電子眼和水分測(cè)定儀分別測(cè)定不同處理的血紅蛋白凍干樣品的亮度L*值、紅綠度a*值、黃藍(lán)度b*值[16]和水分含量，其中測(cè)定色差值時(shí)每個(gè)樣品測(cè)定20 個(gè)點(diǎn)，水分含量測(cè)定中每個(gè)樣品做3 次重復(fù)。參考Benesch等[17]的方法測(cè)定配體血紅蛋白（ligand hemoglobin，LHb）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）、高鐵血紅蛋白（methemoglobin，MetHb）含量。分別測(cè)定血紅蛋白色素在560、576、630 nm波長(zhǎng)處的吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。其3 種不同狀態(tài)下的血紅蛋白含量計(jì)算如公式（1）～（3）所示。

1.3.5 血紅蛋白色素穩(wěn)定性影響因素

血紅蛋白在540 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)特征吸收峰，因此測(cè)定不同處理的樣品在540 nm波長(zhǎng)處的吸光度，作為血紅蛋白穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[18-20]，A540nm的大小反映了血紅蛋白穩(wěn)定性的強(qiáng)弱。

1.3.5.1 pH值對(duì)血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響

分別用1 mol/L HCl和0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值為3、4、5、6、7、8、9、10，將血紅蛋白按照1 mg/mL的質(zhì)量濃度溶解于以上不同pH值的溶液中，充分?jǐn)嚢?0 min，離心取上清液，測(cè)定A540nm。

1.3.5.2 溫度對(duì)血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響

用超純水將不同處理血紅蛋白配制為1 mg/mL的血紅蛋白溶液。分別置于2、20、40、60、80 ℃條件下30 min，離心取上清液，測(cè)定A540nm。

1.3.5.3 NaCl濃度對(duì)血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響

取不同處理血紅蛋白凍干樣品分別溶解于0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L的NaCl溶液中，使血紅蛋白的終質(zhì)量濃度均為1 mg/mL，離心取上清液，測(cè)定A540nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，利用SPSS 17.0程序中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行方差顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖對(duì)血紅蛋白結(jié)構(gòu)的影響

圖1 不同處理的血紅蛋白紅外光譜Fig. 1 IR spectra of hemoglobin with and without glucose addition

由圖1可知，樣品在3 400～3 000 cm－1處均可以觀察到尖銳的吸收峰，該位置為N—H伸縮振動(dòng)吸收峰，為蛋白質(zhì)的特征吸收峰。在低溫條件下，糖類可通過氫鍵和血紅蛋白共價(jià)結(jié)合。葡萄糖處理組在該處的吸收強(qiáng)度相對(duì)于對(duì)照組較為強(qiáng)烈且峰形較寬，這是由于糖類化合物中存在多個(gè)羥基，在和血紅蛋白共價(jià)結(jié)合后在3 570～3 050 cm－1處常出現(xiàn)多個(gè)O—H伸縮振動(dòng)吸收峰，這些吸收峰堆疊在一起形成較寬的吸收帶[21-22]。

圖2 血紅蛋白紫外-可見光吸收曲線Fig. 2 UV-Vis absorption spectra of hemoglobin with and without glucose addition

紫外-可見吸收光譜特性能夠反映血紅蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。血紅蛋白分子是由1分子珠蛋白和4分子亞鐵血紅素組成，其中血紅素是具有卟啉結(jié)構(gòu)的小分子，卟啉中的4 個(gè)吡咯環(huán)上的氮原子分別與血紅素中的亞鐵離子配位結(jié)合，當(dāng)與空氣接觸后，亞鐵離子與氧分子以配位鍵絡(luò)合，在約576 nm波長(zhǎng)處形成一個(gè)吸收峰，血紅蛋白以氧合的形式存在，其中鐵仍為二價(jià)[23]，但形成了六配體的復(fù)合物。如圖2所示，血紅蛋白的最大吸收峰分別位于576 nm和540 nm波長(zhǎng)處，其中540 nm為亞鐵血紅素的特征吸收峰，這與卟啉類化合物的Q帶特征一致[24]，因此可以用A540nm來反映血紅蛋白的穩(wěn)定性。在加入葡萄糖冷凍干燥后血紅蛋白的紫外吸收峰并未發(fā)生變化，這與Salvador等[13]的研究結(jié)果一致。

2.2 葡萄糖對(duì)血紅蛋白色差值和血紅蛋白狀態(tài)的影響

圖3 血紅蛋白色素的色澤變化Fig. 3 Change in color parameters of hemoglobin with glucose addition

由圖3可知，與對(duì)照組相比，加入葡萄糖后，血紅蛋白色素的L*和a*值均有顯著提高（P＜0.05），b*值無顯著差異（P＞0.05）；冷凍干燥后葡萄糖處理組和對(duì)照組的水分含量分別為：（19.55±0.52）%、（4.27±0.15）%。添加葡萄糖后的血紅蛋白水分含量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。這是由于葡萄糖作為一種親水性物質(zhì)，能夠在冷凍干燥過程中與蛋白質(zhì)表面殘留的水結(jié)合形成水化膜，從而保護(hù)蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)在低溫狀況下變性沉淀，維持血紅蛋白的原有特性[25]。由圖4可知，在加入葡萄糖后同一狀態(tài)的血紅蛋白含量在不同處理組之間差異顯著（P＜0.05）。加入葡萄糖后配體血紅蛋白的含量顯著增高（P＜0.05）；高鐵血紅蛋白含量顯著降低（P＜0.05）。說明在冷凍干燥過程中葡萄糖減少了血紅蛋白的氧化程度。結(jié)合不同處理的血紅蛋白色素的色差值分析原因如下：亞鐵血紅蛋白為鮮紅色，高鐵血紅蛋白呈紅褐色。在加入葡萄糖后，高鐵血紅蛋白的含量降低，因此加入葡萄糖后的血紅蛋白L*值和a*值有一定程度的升高。

圖4 血紅蛋白衍生物的相對(duì)含量Fig. 4 Relative contents of hemoglobin derivatives

2.3 pH值對(duì)不同處理血紅蛋白穩(wěn)定性的影響

圖5 pH值對(duì)血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of pH on stability of hemoglobin

pH值的改變會(huì)影響蛋白質(zhì)的解離程度和帶電性，從而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[26]。由圖5可知，pH值對(duì)血紅蛋白的穩(wěn)定性影響顯著（P＜0.05），其穩(wěn)定性呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH值在3～4之間時(shí)，葡萄糖處理組的穩(wěn)定性相對(duì)于對(duì)照組較低，這是由于在水溶液中，葡萄糖本身呈酸性，因此在低pH值條件下，葡萄糖不能起到保護(hù)血紅蛋白的作用。當(dāng)pH值在5～10之間時(shí)，加入葡萄糖后血紅蛋白的穩(wěn)定性高于對(duì)照組。除在pH 8條件下，葡萄糖處理組吸光度均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；當(dāng)溶液的pH值為7時(shí)，血紅蛋白的吸光度最高，這是由于血紅蛋白溶液的pH值為7左右[27]，高于或低于血紅蛋白溶液的pH值，血紅蛋白的吸光度均有不同程度下降。溶液pH值低于血紅蛋白溶液的pH值時(shí)，血紅蛋白帶負(fù)電，反之，血紅蛋白分子帶正電，pH值過高或過低都會(huì)引起蛋白質(zhì)的充水膨脹而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而使穩(wěn)定性降低。

2.4 溫度對(duì)不同處理血紅蛋白穩(wěn)定性的影響

圖6 溫度對(duì)血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響Fig. 6 Effect of temperature on stability of hemoglobin

由圖6可知，隨著溫度的變化，葡萄糖處理組和對(duì)照組的血紅蛋白的穩(wěn)定性呈現(xiàn)出由平穩(wěn)到下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度在2～80 ℃時(shí)，葡萄糖處理組的血紅蛋白吸光度均顯著高于對(duì)照組血紅蛋白的A540nm吸光度（P＜0.05）；在葡萄糖處理組中，溫度為60 ℃時(shí)血紅蛋白的吸光度最大；當(dāng)溫度為2 ℃時(shí)，對(duì)照組中的血紅蛋白吸光度最大，但與60 ℃時(shí)血紅蛋白的吸光度差異并不明顯；溫度在60～80 ℃時(shí)，血紅蛋白的吸光度驟然下降，這是由于蛋白質(zhì)的變性產(chǎn)生沉淀，溶液中可溶性物質(zhì)的濃度降低，導(dǎo)致溶液的吸光度下降。由此可見，血紅蛋白的變性溫度在60 ℃左右，并且加入葡萄糖后能夠顯著提高血紅蛋白的穩(wěn)定性[28]。

2.5 NaCl濃度對(duì)不同處理血紅蛋白穩(wěn)定性的影響

圖7 鹽濃度對(duì)血紅蛋白吸光度的影響Fig. 7 Effect of NaCl concentration on stability of hemoglobin

由圖7可知，血紅蛋白的吸光度隨著NaCl濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。NaCl濃度在0.2～0.4 mol/L時(shí)，不同處理組的血紅蛋白的吸光度并無顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)NaCl濃度在0.6～1.0 mol/L之間時(shí)，葡萄糖處理組的血紅蛋白吸光度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分析主要原因是在一定的NaCl濃度條件下，NaCl溶液中的金屬離子通過離子鍵能夠與血紅蛋白絡(luò)合形成穩(wěn)定配體，因此血紅蛋白的吸光度升高，但當(dāng)NaCl濃度過高時(shí)，離子強(qiáng)度增加使血紅蛋白的溶解度降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)作用減弱，蛋白分子之間的斥力增強(qiáng)[29]，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而穩(wěn)定性降低，從而使吸光度降低。

3 結(jié) 論

添加葡萄糖能夠提高冷凍干燥血紅蛋白的色澤和穩(wěn)定性。主要表現(xiàn)為，添加葡萄糖能夠降低高鐵血紅蛋白的含量同時(shí)增加配體血紅蛋白的含量，從而提高血紅蛋白L*值和a*值；另添加葡萄糖會(huì)增加血紅蛋白的水分含量；此外，葡萄糖能夠顯著增加冷凍干燥后血紅蛋白對(duì)pH值、溫度和NaCl的穩(wěn)定性。因此，葡萄糖可用來提高血紅蛋白色素的穩(wěn)定性。

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Effect of Glucose on the Stability of Freeze-Dried Hemoglobin

SONG Xuan1,2, HOU Chengli2, LI Zheng2, WANG Wenting1,2, WU Liguo2, ZHU Jie1,*, ZHANG Dequan2,*

(1. Laboratory of Biomechanics and Engineering, Institute of Biophysics, College of Science, Northwest A & F University, Yangling 712100, China;

2. Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

We studied the effect of adding 5 g/100 mL glucose on the color and residual water content of freeze-dried hemoglobin and explored the influences of pH, temperature and NaCl concentration on the stability of freeze-dried hemoglobin. The results showed that glucose could improve the L* and a* values of hemoglobin, and decrease the relative content of methemoglobin. Besides, glucose could signif i cantly enhance the stability of hemoglobin to pH, temperature and NaCl concentration. Meanwhile, the stability of glucose-treated hemoglobin was the highest under the conditions of pH 7,temperatures below 60 ℃ and NaCl concentration of 0.6 mol/L.

hemoglobin; glucose; freeze-drying; stability

10.7506/spkx1002-6630-201717013

TS251.93

A

1002-6630（2017）17-0072-05引文格式：

宋璇, 侯成立, 李錚, 等. 葡萄糖對(duì)冷凍干燥血紅蛋白色素穩(wěn)定性的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 72-76.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717013. http://www.spkx.net.cn

SONG Xuan, HOU Chengli, LI Zheng, et al. Effect of glucose on the stability of freeze-dried hemoglobin[J]. Food Science,2017, 38(17): 72-76. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717013. http://www.spkx.net.cn

2016-06-21

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉羊）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-39）；國(guó)家農(nóng)業(yè)創(chuàng)新工程項(xiàng)目

宋璇（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)。E-mail：songxuan120@163.com

*通信作者：朱杰（1980—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)。E-mail：jiezhu@nwafu.edu.cn

張德權(quán)（1972—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)與技術(shù)。E-mail：dequan_zhang0118@126.com