不同品系甘孜州梨果仙人掌果多糖的含量及初步生物活性研究

鄧海云 夏陳 李燕君 鄧俊琳

摘 要：目的：比較不同品系甘孜州梨果仙人掌果果皮和果肉多糖的抗氧化活性及體外對(duì)α-葡糖糖苷酶活性的作用。方法：將新鮮仙人掌果果皮和果肉分離、干燥、打粉、熱水浸提、過濾、80%乙醇醇沉、脫蛋白、脫色、透析、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，并通過羥自由基清除實(shí)驗(yàn)、還原力實(shí)驗(yàn)（FRAP）、ABTS清除實(shí)驗(yàn)測(cè)定多糖抗氧化活性，測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用。結(jié)果：品系1、2梨果仙人掌果果肉多糖含量分別為6.59±0.12、6.95±0.28g/100g，品系1、2果皮的多糖含量分別為5.53±0.22、6.46±0.18g/100g;品系1、2對(duì)ABTS自由基清除能力的IC50分別是果肉0.23、0.60mg/mL和果皮0.85、0.88mg/mL，品系1果肉多糖的IC50值最?。≒<0.05）;品系2果肉多糖還原力較強(qiáng)（P<0.05）;品系2果皮多糖有較強(qiáng)的羥自由基的清除能力和較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶促進(jìn)作用（P<0.05）。結(jié)論：兩品系梨果仙人掌果多糖含量較高（5%～7%）且無差別。兩品系梨果仙人掌果多糖都表現(xiàn)出一定的抗氧化能力和對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：梨果仙人掌果;多糖;抗氧化性;α-葡萄糖苷酶活性

近年來，植物多糖備受研究者關(guān)注，現(xiàn)有研究證明，仙人掌果中所含的多糖類物質(zhì)具有抗腫瘤[1-4]、降血脂[5]、降血壓[6]、降血糖[7]、抗氧化[8]、抑制菌生長和調(diào)節(jié)免疫[9]等功能。四川甘孜仙人掌果水分含量充足，食用時(shí)口感香甜，但目前未見對(duì)甘孜州梨果仙人掌果多糖的含量、理化性質(zhì)及生物活性研究。本文選用甘孜兩種不同品系梨果仙人掌果（圖1，a為品系1，果實(shí)圓實(shí);b為品系2，果實(shí)細(xì)長），研究其多糖含量和多糖抗氧化活性并作比較，且初步探討梨果仙人掌果多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的作用，為將梨果仙人掌果開發(fā)成具有保健功能的增值產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)，服務(wù)民族地區(qū)特色經(jīng)濟(jì)作物的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

品系1和品系2梨果仙人掌果（康定市姑咱鎮(zhèn)），由四川省甘孜農(nóng)科所提供。α-葡萄糖苷酶（北京索萊寶生物科技有限公司）、對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）（北京索萊寶生物科技有限公司）、木瓜蛋白酶（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、AB-8大孔樹脂，抗壞血酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、多聚甲醛、硫酸亞鐵、過氧化氫、鐵氰化鉀、三氟乙酸、氯仿、氯化亞鐵、菲洛嗪、正丁醇均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器

FA2104型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;DHG-9075A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;FW-100高速萬能粉碎機(jī)，北京科偉永興儀器有限公司;TD-4Z型臺(tái)式低速離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司;KH2200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;ELX-800型號(hào)酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司;UV-6100型號(hào)紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司;PHS-3C型酸度計(jì)，上?？朴觾x器儀表有限公司。

1.3 仙人掌果多糖的提取及含量測(cè)定

去除梨果仙人掌果表面的毛刺，分離果皮和果肉，50℃烘干，打粉，過60目篩，得到仙人掌果果皮和果肉粉末樣品。稱取一定質(zhì)量樣品，按料液比1∶15加入蒸餾水，70℃熱水浸提2h，重復(fù)提取2次[10]，以8 000r/min離心10min，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，80%的乙醇醇沉，用無水乙醇洗滌3次，得到粗多糖。然后將粗多糖用Sevag法脫蛋白，AB-8大孔樹脂脫色，透析法去除低聚糖、鹽類等小分子雜質(zhì)，得到初步純化的梨果仙人掌多糖濃縮液。

1.4 仙人掌多糖含量的測(cè)定

多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法。參照文獻(xiàn)[10]方法，并作適當(dāng)修改。取多糖濃縮液0.1mL于15mL試管，并加蒸餾水補(bǔ)充到1mL，加入6%的新蒸苯酚溶液0.5mL，搖勻后并加入2.5mL的濃硫酸，搖勻后放置5min，然后沸水浴15min，冷卻至室溫后，于490nm處測(cè)定吸光度值。按照同樣方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為A=0.0038C+0.0045，R2=0.999（A為吸光度值，C為葡萄糖質(zhì)量濃度，μg/mL）。多糖得率計(jì)算公式為式（1）：

梨果仙人掌果多糖得率（%）=C×E×VW×106×100（1）

式（1）中，C為樣品多糖濃度（μg/mL）;E為稀釋倍數(shù);V為樣品提取液體積（mL）;W為樣品質(zhì)量（g）。

1.5 仙人掌果多糖抗氧化活性的測(cè)定

1.5.1 對(duì)羥自由基的清除能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[12]中的方法，并作適當(dāng)修改。向10mL試管中以此加入9mmol/L的FeSO4溶液1mL，9mmol/L水楊酸-乙醇溶液2mL，一定濃度的多糖溶液2mL（0.25、0.5、1、2、3、4mg/mL），然后加入8.8mmol/L H2O2溶液2mL啟動(dòng)反應(yīng)，室溫下反應(yīng)1h，在510nm處測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以維生素C為陽性對(duì)照。清除率計(jì)算公式為式（2）：

羥自由基的清除率（%）=（1-A1-A2A0）×100（2）

式（2）中，A0為空白對(duì)照組吸光度值（以去離子水代替多糖溶液）;A1是實(shí)驗(yàn)組吸光度值;A2是樣品本底吸光度值（以去離子水代替H2O2）。

1.5.2 還原能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[13]中的方法，并作適當(dāng)修改。取不同濃度多糖溶液0.2mL（0.5、1、2、3、4、5mg/mL）置于5mL離心管中，并依次加入0.2mol/L（pH=6.6）的磷酸鹽緩沖液0.5mL、1%鐵氰化鉀溶液0.5mL，混勻后，50℃恒溫水浴20min，取出冷卻至室溫，加入10%三氯乙酸溶液0.5mL，再次混勻，3 000r/min離心10min，取上清液1.25mL于試管，并加入蒸餾水1.25mL、0.1%三氯化鐵溶液0.5mL，搖勻后靜置10min，在700nm波長處測(cè)定吸光度值，以蒸餾水作空白參比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.3 ABTS清除能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]中的方法，并作適當(dāng)修改。將ABTS溶液和過硫酸鉀溶液混合，使混合液中ABTS濃度為7mmol/L、過硫酸鉀濃度為2.45mmol/L，在室溫下，將混合液避光孵育16h，然后用PBS（pH=7.0）稀釋混合液，使混合液在734nm波長處吸光度值為0.70±0.02，得到ABTS工作液。將一定濃度的多糖溶液（0.25、0.5、0.75、1、1.25、2.5mg/mL）和ABTS工作液以1∶1混合，室溫下孵育6min，在734nm波長處測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 仙人掌果多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

參照文獻(xiàn)[14]中的方法，并作適當(dāng)修改。向96孔板分別加入80μL不同濃度多糖溶液（0.1、0.5、1、2、4、6mg/mL），再向每孔中加入20μL α-葡糖糖苷酶液（2.5 U/mL，用0.1mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液配制），37℃孵育10min，迅速向各孔加入20μL PNPG溶液（20mmol/L，用0.1mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液配制），37℃孵育10min，向每孔中加入160μL碳酸鈉溶液（0.2mol/L）終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在405nm波長下檢測(cè)定吸光度值。

α-葡萄糖苷酶活性抑制率計(jì)算公式為式（4）：

酶活性抑制率（%）=（1-A1-A2A0）×100（4）

式（4）中，A0為空白對(duì)照組吸光度值（以蒸餾水水代替多糖溶液）;A1是實(shí)驗(yàn)組吸光度值;A2是樣品本底組吸光度值（以磷酸鹽緩沖液代替α-葡糖糖苷酶液）。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示（正態(tài)分布），或以中位數(shù)和四分位數(shù)表示（非正態(tài)分布），多組間比較用單因素方差分析和兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平為0.05，用OriginLab 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量

如表1所示，4組樣品多糖含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=8.789，P=0.031），在品系1仙人掌果中，果皮多糖含量低于多肉（P=0.021），而品系2仙人掌果果皮和果肉多糖含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.165），兩品系仙人掌果果肉多糖含量無差別（P=0.286），而品系1果皮多糖含量相對(duì)較低（P=0.032）。4個(gè)樣品多糖含量都在5%～7%內(nèi)。分別是品系1、2梨果仙人掌果果肉多糖含量分別為6.59±0.12、6.95±0.28g/100g，品系1、2果皮的多糖含量分別為5.53±0.22、6.46±0.18g/100g。傳統(tǒng)的梨果仙人掌果的食用方法是只食用果肉，丟棄質(zhì)量比較大的果皮部分，造成資源的浪費(fèi)，可以將果皮部分作為多糖提取的原料。

2.2 對(duì)羥自由基的清除能力

羥自由基是活性氧中對(duì)人體危害最大的一種自由基，可以引起大多數(shù)生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，甚至死亡。如圖2a所示，4種樣品的多糖對(duì)羥自由基的清除能力表現(xiàn)出劑量反應(yīng)關(guān)系，劑量越大，清除能力越強(qiáng)，在多糖濃度為2～4mg/mL范圍內(nèi)，品系2果皮多糖具有較高的羥自由基清除能力（P<0.05）。在多糖濃度為4mg/mL時(shí)，品系1果肉多糖、品系2果肉多糖、品系1果皮多糖、品系2果皮多糖的羥自由基清除率分別為28.3%、31.4%、21.4%、39.0%。清除羥自由基的機(jī)制有多種，例如抑制過氧化物的生成、分解，降低羥自由基的生成。而多糖清除羥自由基的作用機(jī)制可能是通過與自由基結(jié)合，終止自由基引起的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[16]。

2.3 還原能力（FRAP）

活性物質(zhì)可以提供電子與自由基反應(yīng)生成穩(wěn)定的化合物，生成物越多，吸光度值越大，物質(zhì)還原力越強(qiáng)。如圖2b所示，4種樣品多糖的還原力比較接近，總體表現(xiàn)出劑量反應(yīng)關(guān)系，在多糖濃度為5mg/mL時(shí)，品系1果肉多糖、品系2果肉多糖、品系1果皮多糖和品系2果皮多糖的吸光度值分別為0.20、0.25、0.16、0.19，品系2果肉多糖的還原力較強(qiáng)（P<0.05）。

2.4 ABTS清除能力

如圖2c所示，4種樣品多糖和維生素C（VC）對(duì)ABTS自由基具有較強(qiáng)的清除能力，表現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，對(duì)比4種仙人掌多糖樣品，在多糖濃度為0～1.25mg/mL范圍內(nèi)，品系1果肉多糖具有較高的ABTS自由基清除能力，僅比維生素C的清除能力稍弱。維生素C、品系1果肉多糖、品系2果肉多糖、品系1果皮多糖和品系2果皮多糖對(duì)ABTS自由基清除能力的IC50分別是0.26μg/mL、0.23mg/mL、0.60mg/mL、0.85mg/mL、0.88mg/mL。在樣品濃度為2.5mg/mL時(shí)，5種物質(zhì)對(duì)ABTS自由基清除能力達(dá)到最大值，即維生素C（95.9%）、品系1果肉多糖（92.7%）、品系2果肉多糖（91.8%）、品系1果皮多糖（88.6%）、品系2果皮多糖（94.2%）。品系1、2果肉多糖和果皮多糖對(duì)ABTS自由基的最大清除能力無差異（P>0.05）。

2.5 對(duì)α-葡萄糖苷酶活性作用

如圖2d所示，4種樣品多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，并且存在一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，在4種樣品多糖中，品系2果皮多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性有較強(qiáng)的促進(jìn)作用（P<0.05），在多糖濃度為6mg/mL時(shí)，品系1果肉多糖（酶促活性最大值35.7%）、品系2果肉多糖（酶促活性最大值55.3%）、品系1果皮多糖（酶促活性最大值60.9%）和品系2果皮多糖（酶促活性最大值85.0%）對(duì)α-葡萄糖苷酶的促進(jìn)作用幾乎達(dá)到最大值。有研究表明，植物多糖降血糖的機(jī)制十分復(fù)雜，可以促進(jìn)胰島素的分泌[17];通過清除自由基，保護(hù)胰島β細(xì)胞[18];調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)酶活性，促進(jìn)肝糖原合成[19];調(diào)節(jié)免疫功能，改善糖尿病癥狀[20];抑制升血糖激素分泌等[21]。不同的植物多糖其降血糖機(jī)制可能不同，研究發(fā)現(xiàn)，茶葉多糖可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，但是銀耳、靈芝等多糖可以促進(jìn)α-葡萄糖苷酶活性，與本次研究結(jié)果相同。高潔等[22]通過給糖尿病大鼠飼喂仙人掌果多糖提取液，發(fā)現(xiàn)其具有降血糖作用，并且可以明顯改善糖尿病大鼠的癥狀，推測(cè)仙人掌果多糖可以保護(hù)胰島β細(xì)胞。劉華鋼等[23]研究發(fā)現(xiàn)，仙人掌果多糖可以促進(jìn)糖尿病大鼠胰島素的分泌，達(dá)到降血糖的作用。

3 結(jié)論

品系1和品系2梨果仙人掌果的多糖含量都在5%～7%內(nèi)，且差別較小，果皮和果肉所含的多糖相當(dāng)，可以在食用果肉的基礎(chǔ)上，加大對(duì)果皮的開發(fā)利用。在抗氧化性實(shí)驗(yàn)中，品系1和品系2的果肉、果皮4種樣品的多糖都表現(xiàn)出一定的羥自由基清除能力、還原力和較高的ABTS自由基清除能力;其中品系2果肉多糖的還原力較強(qiáng)，品系1果肉多糖具有較高的ABTS自由基清除能力（IC50為0.23mg/mL）。4種樣品多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，其中品系2果皮多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性最強(qiáng)（酶促活性最大值85.0%）。根據(jù)研究結(jié)果，加之梨果仙人掌果本身富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物等營養(yǎng)物質(zhì)，提示可以將其開發(fā)為平衡降血糖或其他健康功能的功能食品?！?/p>

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