超高效液相色譜—三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中種色氨酸代謝物

劉悅 賈曼 崔婧 甘敏 陳剛

摘 要：為研究色氨酸在細(xì)胞水平上代謝成為吲哚乙酸、吲哚甲醛及FICZ的轉(zhuǎn)化率，本文建立了用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的方法，采用C18色譜柱、5mmol乙酸銨水及100%乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行分離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）負(fù)離子模式對(duì)3種物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法進(jìn)行定量。同時(shí)采用空白基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)對(duì)方法的回收率及精密度進(jìn)行了測(cè)量。方法線性較好，線性范圍廣，相關(guān)系數(shù)均為0.999，回收率在85%～102%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.75%～8.75%之間。吲哚甲醛檢出限及定量限分別為0.5、1.5ng/mL;吲哚乙酸檢出限及定量限分別為5、10.0ng/mL;FICZ的檢出限及定量限分別為0.3、1ng/mL。該方法為研究色氨酸代謝打下基礎(chǔ)，同時(shí)也為評(píng)價(jià)高色氨酸飲食的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供新的思路。

關(guān)鍵詞：吲哚甲醛;吲哚乙酸;FICZ;定量檢測(cè)

色氨酸參與人體各項(xiàng)生理過程，調(diào)節(jié)機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)及免疫功能[1-5]。色氨酸屬于必須氨基酸，維持機(jī)體正常生理功能所需的色氨酸必須依靠飲食獲得[6]，色氨酸的含量是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)品質(zhì)的指標(biāo)之一[7]。

目前，色氨酸的生理功能主要集中在對(duì)其犬尿氨酸及血清素代謝通路的研究，對(duì)吲哚丙酮酸通路的關(guān)注度很低，但作為吲哚丙酮酸途徑的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ對(duì)人體健康至關(guān)重要。一方面，攝入的色氨酸可被腸道中的微生物代謝產(chǎn)生吲哚乙酸及吲哚甲醛，調(diào)節(jié)人體細(xì)胞色素酶系統(tǒng)[8-9]，維持腸道免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定。吲哚甲醛還具有一定的抗菌活性。同時(shí)，尿液中吲哚乙酸含量的升高也被視為苯丙酮尿癥的癥狀之一[10]。色氨酸的光解產(chǎn)物6-甲酰基吲哚并[3，2-b]咔唑（FICZ）能夠誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)免疫系統(tǒng)活化[11]。另一方面，吲哚乙酸也是最早被發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性植物生長(zhǎng)激素，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用于果蔬催熟及改良品質(zhì)等方面[12-13]，在植物各個(gè)器官中均有分布[12]。吲哚乙酸在可食用農(nóng)產(chǎn)品，尤其是植物性農(nóng)產(chǎn)品中的含量也與人體健康密切相關(guān)。

色氨酸存在于大多數(shù)可食用蛋白質(zhì)中，且?guī)缀醮嬖谟谒行问降闹参锏鞍字?，大米、雞蛋及牛奶等是色氨酸的主要食物來源。因此，有必要建立一套準(zhǔn)確、可靠的色氨酸代謝物定量方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)人體攝入色氨酸代謝通路的研究，為評(píng)價(jià)色氨酸的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供新的思路。目前對(duì)吲哚乙酸的檢測(cè)方法主要有液質(zhì)聯(lián)用法、液相色譜法、離子色譜法及生物傳感器法，目標(biāo)基質(zhì)大多為水果、蔬菜等植物類[16-19];對(duì)吲哚甲醛的檢測(cè)目前報(bào)道較少，主要是液質(zhì)聯(lián)用法;FICZ也普遍采用液質(zhì)聯(lián)用方法檢測(cè)[14-15，20]。為了研究色氨酸被細(xì)胞代謝為吲哚乙酸、吲哚甲醛及FICZ的轉(zhuǎn)化率，建立了利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的方法，靈敏度高、線性范圍廣、方法簡(jiǎn)單，為研究色氨酸的體內(nèi)外代謝提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜（Agilent QQQ 6470，安捷倫公司）、離心機(jī)（Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge，Thermo Fisher公司），渦旋混合儀（GENIUS 3，德國(guó)IKA公司）、電子天平（AG245，瑞士Metler Toledo公司）、0.22μm濾膜、菲洛門C18色譜柱（粒徑2.6μm，內(nèi)徑4.6 mmol，長(zhǎng)度100 mmol）。

1.1.2 試劑 吲哚甲醛標(biāo)準(zhǔn)品（99%，Sigma）、吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（99%，Sigma）、FICZ標(biāo)準(zhǔn)品（99%，Sigma）、甲醇（色譜純，Thermo公司）、乙腈（色譜純，Thermo公司）、純凈水（娃哈哈）、DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen公司）、胎牛血清（Invitrogen公司）、乙酸銨（≥98%，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 吲哚甲醛和吲哚乙酸用甲醇配制成濃度為1mg/mL的母液，置于-20℃冰箱中保存。FICZ標(biāo)準(zhǔn)品用DMSO溶液配制成濃度為1mg/mL的母液，置于-20℃冰箱中保存。分別取吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ母液適量，用乙腈逐級(jí)稀釋為工作液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為菲洛門C18色譜柱（粒徑2.6μm、內(nèi)徑4.6mmol、長(zhǎng)度100 mmol），流動(dòng)相A為5mmol/L乙酸銨水，流動(dòng)相B為乙腈;進(jìn)樣量5μL，流速0.4mL/min，柱溫為35℃，后運(yùn)行時(shí)間為2min（表1）。

1.2.3 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源負(fù)離子掃描（ESI-），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），鞘氣溫度250℃，鞘氣流速11L/min，干燥氣溫度300℃，干燥氣流速5L/min，毛細(xì)管電壓-3 500V，霧化器壓力45psi，噴嘴電壓-500V（表2）。

2.2 檢出限及定量限

本方法以信噪比（S/N）≥3的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為檢出限（LOD），以信噪比（S/N）≥10的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為定量限（LOQ）。FICZ的檢出限和定量限最低，分別為0.3、1ng/mL。其次為吲哚甲醛，檢出限和定量限分別為0.5、1.5ng/mL。吲哚乙酸的檢出限和定量限分別為5、10ng/mL，為3種化合物之最高檢出限和定量限濃度（表4）。

2.3 方法準(zhǔn)確度及精密度

分別在空白培養(yǎng)基中添加高、中、低3種不同濃度的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ溶液，使培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)品終濃度分別為10、100、500ng/mL，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行，重復(fù)3次。將空白培養(yǎng)基及加標(biāo)培養(yǎng)基按前述前處理方法處理之后上機(jī)檢測(cè)。回收率在85%～102%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.75%～8.75%之間（表5）。

2.4 樣品測(cè)定

收集用普通商業(yè)DMEM培養(yǎng)基、外源添加2mmol或5mmol色氨酸的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24h或48 h 后的293T細(xì)胞上清，對(duì)培養(yǎng)上清中的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ進(jìn)行檢測(cè)，從而判定人體細(xì)胞體外代謝色氨酸產(chǎn)生吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組2個(gè)平行。由Graphpad軟件完成方差分析，P>0.05時(shí)為差異性顯著，定量限以下視為未檢出。由表6可以看出，293T代謝色氨酸產(chǎn)生吲哚甲醛及吲哚乙酸的水平與外源色氨酸濃度及培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)，F(xiàn)ICZ在各組含量沒有顯著差異或未檢出。結(jié)果表明，色氨酸能被293T細(xì)胞在體外代謝為吲哚甲醛、吲哚乙酸，為進(jìn)一步研究色氨酸的體內(nèi)吲哚丙酮酸代謝通路提供了科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié)論

本方法樣品前處理程序簡(jiǎn)單，操作便捷?？紤]到細(xì)胞培養(yǎng)基成分相對(duì)單一，干擾雜質(zhì)較少，因此前處理采用離心后過濾的方式去除大分子蛋白或其他雜質(zhì)。本方法采用C18色譜柱分離，流動(dòng)相5mmol乙酸銨水、100%乙腈實(shí)現(xiàn)了化合物的分離，峰型好、響應(yīng)高。本方法的靈敏度高、線性范圍廣、回收率高且重現(xiàn)性好，為細(xì)胞代謝色氨酸產(chǎn)生的吲哚甲醛、吲哚乙酸及FICZ定量研究打下基礎(chǔ)?！?/p>

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