白鮮堿對小鼠脾淋巴細胞活力的體外抑制作用及機制研究

叢歡 楊瑩 包亞男 洪博 郭麗娜

中圖分類號 R285;R992 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）21-2963-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.17

摘 要 目的：研究白鮮堿對小鼠脾淋巴細胞活力的體外抑制作用并探討其可能的作用機制。方法：分離并培養(yǎng)小鼠原代脾淋巴細胞，以0（空白對照）、50、100、150 μmol/L白鮮堿作用細胞24 h后，采用MTT法檢測細胞活力，乳酸脫氫酶（LDH）法檢測細胞LDH釋放率，流式細胞術檢測細胞早期凋亡率，Hoechst 33342和碘化丙啶（PI）雙染法檢測細胞壞死率，Western blot法檢測細胞中胱天蛋白酶3（Caspase 3）、剪切體Caspase 3（Cleaved-Caspase 3）蛋白表達水平以及彗星試驗法檢測細胞DNA損傷（以DNA拖尾區(qū)域比例反映）。結果：與空白對照比較，100、150 μmol/L白鮮堿可顯著抑制細胞活力（P<0.01）;150 μmol/L白鮮堿可顯著增加細胞LDH的釋放（P<0.05），釋放率達到79.37%;50、100、150 μmol/L白鮮堿均可提高細胞的早期凋亡率，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;150 μmol/L白鮮堿可顯著增加細胞壞死率（P<0.05），壞死率達到78.64%;50、100、150 μmol/L白鮮堿均可升高Caspase 3蛋白表達水平，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），然而50、100 μmol/L白鮮堿可顯著提高Cleaved-Caspase 3蛋白表達水平（P<0.05）;白鮮堿可呈劑量依賴性地引起DNA損傷，其中100、150 μmol/L白鮮堿可顯著增加DNA拖尾區(qū)域比例（P<0.01）。結論：白鮮堿可以抑制脾淋巴細胞活力，其作用機制可能與誘導脾淋巴細胞壞死和造成DNA損傷有關。

關鍵詞 白鮮堿;脾淋巴細胞;凋亡;壞死;DNA損傷;體外試驗

Study on the Viability Inhibitory Effects and Mechanism of Dictamnine on Mice Spleen Lymphocyte in vitro

CONG Huan，YANG Ying，BAO Yanan，HONG Bo，GUO Lina（College of Pharmacy， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effect of dictamnine on the viability of mice spleen lymphocyte in vitro and explore its potential mechanism. METHODS： The primary spleen lymphocytes of mice were isolated and cultured. The cells were treated with 0 （blank control）， 50， 100， 150 μmol/L dictamnine for 24 h. MTT assay was used to determine the cell viability; Lactic dehydrogenase （LDH） assay was used to determine release rate of LDH. Early apoptosis rate was detected by flow cytometry. Necrosis rate was detected by Hoechst 33342 and PI double staining; Western blot assay was used to detect the protein expressions of Caspase 3 and Cleaved-Caspase 3 in cells. Comet assay was used to detect DNA damage in cells （reflected in the proportion of DNA tail area）. RESULTS： Compared with blank control， 100， 150 μmol/L dictamnine could significantly inhibit the viability of lymphocytes （P<0.01）. 150 μmol/L dictamnine could significantly increase the release of LDH （P<0.05）， and release rate reached 79.37%. 50， 100， 150 μmol/L dictamnine could improve the early apoptotic rate of lymphocyte， but there was no statistical significance （P>0.05）. 150 μmol/L dictamnine could significantly increase the necrosis rate （P<0.05）， and necrosis rate reached 78.64%. 50， 100， 150 μmol/L dictamnine could increase the protein expression of Caspase 3， but there was no statistical significance （P>0.05）， while 50， 100 μmol/L dictamnine could improve the protein expression of Cleaved-Caspase 3 significantly （P<0.05）. DNA damage was induced in a dose-dependent manner by dictamnine， in which 100 and 150 μmol/L dictamnine could significantly increase DNA tail area （P<0.01）. CONCLUSIONS： Dictamnine can inhibit spleen lymphocyte viability， and the mechanism may be related to inducing spleen lymphocyte necrosis and DNA damage.

KEYWORDS Dictamnine; Spleen lymphocytes; Apoptosis; Necrosis; DNA damage; In vitro test

在濕疹、過敏特應性皮炎等病理條件下的免疫反應遷延難愈，嚴重危害著人類的健康。白鮮皮為多年生草本植物白鮮和狹葉白鮮的根皮，有清熱燥濕、祛風解毒的功效，是治療各種皮膚病的常見藥物[1-3]，具有抗炎[4]、抗過敏[5]、抗輻射[6]等諸多藥理作用，在臨床上得到了廣泛的應用。但白鮮皮的毒性作用也不能忽視，白鮮皮入肝經(jīng)，表現(xiàn)出肝毒性[7]。白鮮堿作為白鮮皮的主要活性成分，也具有一定的肝毒性，如郭曉培等[8]報道了白鮮堿可以呈劑量依賴性地增加HepG2細胞上清液中丙氨酸轉氨酶（AST）和天冬氨酸轉氨酶（ALT）活性，使線粒體膜電位下降，造成細胞損傷;再如Li ZQ等[9]報道了白鮮堿可以通過升高細胞色素P4503A4酶（ CYP3A4）活性引起亞慢性肝損傷。白鮮皮雖善于治療免疫系統(tǒng)疾病，可白鮮皮是否對免疫系統(tǒng)有損傷作用卻未見報道。故本研究選用白鮮皮的有效成分白鮮堿作用于體外脾淋巴細胞，考察其對脾淋巴細胞的活力的影響及機制，為白鮮皮對免疫系統(tǒng)可能存在的損傷作用作出初步探索。

1 材料

1.1 儀器

3001型酶標儀、3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）;DXFLEX型流式細胞儀（美國Beckman公司）;C300型凝膠成像儀（美國Azure Biosystems公司）;H-2050R型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）;DYY-6D型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）;TH4-200型熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）。

1.2 藥品與試劑

白鮮堿標準品（北京壇墨質檢科技有限公司，批號：484-29-7，純度：≥98%）;小鼠淋巴細胞提取液（深圳達科為生物技術有限公司，批號：33R021607）;RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）;胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞凋亡與壞死檢測試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司，批號：C1062M、C1056、C0016）;CD3-FITC鼠單克隆熒光抗體、CD19-PE鼠單克隆熒光抗體（美國Biolegend公司，批號：100204、115508）;低熔點瓊脂糖凝膠、MTT試劑（北京索萊寶科技有限公司）;高熔點瓊脂糖凝膠（法國Biowest公司）;胱天蛋白酶3（Caspase 3）兔多克隆抗體、β-肌動蛋白（β-actin）兔多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美國Proteintech公司，批號：19677-1-AP、20536-1-AP、SA00001-2）;ECL發(fā)光試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0049M）。

1.3 動物

健康SPF級ICR小鼠，6～8周齡，體質量（18～20）g，購自遼寧省長生生物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（遼）2015-0001。動物實驗部分符合齊齊哈爾醫(yī)學院實驗動物倫理要求。

2 方法

2.1 小鼠原代脾淋巴細胞的分離及鑒定

斷頸處死小鼠，醫(yī)用酒精浸泡5 min，無菌分離小鼠脾組織，置于200目尼龍網(wǎng)上，加入5 mL小鼠淋巴細胞提取液，緩慢研磨，將細胞懸液置于15 mL離心管中，加入1 mL的RPMI-1640培養(yǎng)基，在室溫下以800×g離心30 min，取中間淋巴細胞層，置于15 mL離心管中，加入10 mL 的RPMI-1640培養(yǎng)基，顛倒洗滌，在室溫下再以250×g離心10 min，傾倒上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞，此時臺盼藍拒染率≥90%，即活細胞比例≥90%。調整脾淋巴細胞密度為每1 mL 1×106個，取200 ? μL細胞懸液，按 CD3-FITC熒光抗體、CD19-PE熒光抗體說明書加入抗體，4 ℃避光靜置30 min后，加入600 ? ?;μL 的PBS（含1%胎牛血清），吹勻，室溫下以250×g離心10 min，棄上清，加入500 μL的 PBS，吹勻，進行流式細胞術檢測，試驗重復3次。發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞比率為（75.50±1.05）%、T淋巴細胞比率為（14.53±0.65）%（CD3-FITC標記的為T淋巴細胞，CD19-PE標記的為B淋巴細胞），總淋巴細胞純度≥90%。脾淋巴細胞鑒定的流式細胞圖見圖1。

2.2 小鼠原代脾淋巴細胞的分組及給藥

調整脾淋巴細胞密度為每1 mL 2×106個，鋪于96孔板中，每孔100 μL，設置4個試驗組：其中，空白對照組加入RPMI-1640培養(yǎng)基100 μL（終體積為200 μL，細胞終密度為每1 mL 1×106個）;3個白鮮堿組均加入含藥RPMI- 1640培養(yǎng)基100 μL（終體積為200 μL，細胞終密度為每1 mL 1×106個，DMSO終濃度為0.05%，白鮮堿終濃度分別為50、100、150 μmol/L）。每組設6個復孔，振蕩混勻。

2.3 MTT法測定細胞活力抑制率

將“2.2”項下各組細胞置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 h后每孔加入MTT溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，DMSO溶解，然后于570 nm波長下用酶標儀測定各孔吸光度（A）值，計算細胞活力抑制率[細胞活力抑制率（%）= （A空白對照組-A給藥組）/A空白對照組×100%]。試驗重復6次。

2.4 LDH法檢測脾淋巴細胞LDH釋放率

將“2.2”項下各組細胞置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在室溫下以100×g離心5 min，取上清液，按LDH細胞毒性檢測試劑盒說明操作并計算細胞LDH釋放率，試驗重復6次。

2.5 流式細胞術檢測細胞早期凋亡

將“2.2”項下各組細胞置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細胞置于1.5 mL離心管中，在室溫下以100×g離心5 min，棄上清，加入1 mL PBS重懸，再在室溫下以100×g離心5 min，PBS反復洗滌3次，按細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，經(jīng)流式細胞儀檢測，設定（Annexin Ⅴ-FITC）+/PI-象限為早期凋亡區(qū)，計算各組細胞早期凋亡細胞的比例，記為早期凋亡率。試驗重復3次。

2.6 Hoechst 33342和PI雙染法檢測細胞壞死

將“2.2”項下各組細胞置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細胞置于1.5 mL離心管中，在室溫下以100×g離心5 min，棄上清，加入800 μL細胞染色緩沖液，按照細胞凋亡與壞死檢測試劑盒說明書操作，經(jīng)熒光顯微鏡觀察，設定弱藍色熒光細胞為正常細胞，強紅色熒光細胞為壞死細胞，計算各組細胞壞死率。試驗重復3次。

2.7 Western blot法檢測細胞中Caspase 3、Cleaved- Caspase 3蛋白表達

將細胞置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用PBS沖洗細胞2～3次，轉移至1.5 mL離心管中，加入適當體積RIPA（含蛋白酶抑制劑、磷酸化抑制劑），冰上孵育30 min，移液器反復吹打，確保細胞完全裂解，然后以12 000 ×g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量后，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳分離，轉入醋酸纖維素印跡膜上，5%脫脂奶粉封閉2.5 h，Caspase 3、β-actin一抗（1 ∶ 500）孵育過夜，TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（1 ∶ 3 000）孵育1 h，TBST洗膜3次，置于凝膠成像儀中，ECL發(fā)光，觀察反應條帶，Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶與內參（β-actin）條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。試驗重復3次。

2.8 彗星試驗檢測細胞DNA損傷

將細胞置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，各組取200 μL細胞懸液，置于1.5 mL離心管中，與低熔點瓊脂糖凝膠以體積比為1 ∶ 1的比例混勻，鋪于用高熔點瓊脂糖凝膠制備后的載玻片上，4 ℃固化18 min，隨后將載玻片置于新鮮配制的4 ℃預冷的細胞裂解液當中1.5 h，蒸餾水漂洗，置于電泳槽中，18 V、300 mA下電泳30 min，隨后蒸餾水漂洗，用0.4 mol/L的Tris-Hcl緩沖液中和3次，每次5 min，加入無水乙醇固定1 h，室溫下過夜。閱片時，在載玻片表面滴加2 mL溴化乙錠，熒光顯微鏡觀察，CASP-1.2.3軟件進行結果分析，測定DNA拖尾區(qū)域比例[拖尾面積/（拖尾面積+頭部面積）]，比例越大代表DNA損傷越嚴重。每組選30個細胞進行測定，試驗重復3次。

2.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對結果進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)資料以x±s表示，采用單因素方差分析，方差齊時兩組間比較采用LSD-t檢驗，方差不齊則采用Kruskal-Wallis檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 白鮮堿對脾淋巴細胞活力的影響

在細胞孵育24 h后，與空白對照組比較，白鮮堿100、150 μmol/L組脾淋巴細胞活力顯著受到抑制（P<0.01），并在設定濃度范圍內呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢，其中150 μmol/L白鮮堿組脾淋巴細胞的活力抑制率達到40%以上，結果詳見表1。

3.2 白鮮堿對脾淋巴細胞LDH釋放率的影響

在細胞孵育24 h后，與空白對照組比較，白鮮堿50、100、150 μmol/L組脾淋巴細胞中LDH的釋放量均不同程度增加，且呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢。其中，白鮮堿150 ? ?μmol/L組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其LDH的釋放率接近80%，結果見表2。

3.3 白鮮堿對脾淋巴細胞早期凋亡的影響

在細胞孵育24 h后，與空白對照組比較，白鮮堿50、100、150 μmol/L組脾淋巴細胞的早期凋亡比例雖有升高，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），結果見圖2、表3。

3.4 白鮮堿對脾淋巴細胞壞死的影響

在細胞孵育24 h后，與空白對照組比較，白鮮堿50、100、150 μmol/L組脾淋巴細胞壞死率均不同程度升高，并呈劑量依賴性趨勢;其中，白鮮堿150 μmol/L組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），結果見圖3、表4。

3.5 白鮮堿對脾淋巴細胞Caspase 3、Cleaved-Caspase 3蛋白表達的影響

在細胞孵育24 h后，與空白對照組比較，白鮮堿50、100、150 μmol/L組細胞中Caspase 3蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;但白鮮堿50、100 μmol/L組細胞中Cleaved-Caspase 3蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），結果見圖4、表5。

3.6 白鮮堿對脾淋巴細胞DNA損傷影響

在細胞孵育24 h后，與空白對照組比較，白鮮堿50、100、150 μmol/L組脾淋巴細胞DNA拖尾區(qū)域比例均不同程度升高，呈劑量依賴性趨勢;其中，白鮮堿100、150 μmol/L組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），結果見圖5、表6。

4 討論

本研究采用50、100、150 μmol/L 3個濃度的白鮮堿作用于體外培養(yǎng)的原代小鼠脾淋巴細胞，以篩選出對原代小鼠脾淋巴細胞具有損傷作用的藥物濃度，并初步闡述損傷機制，此濃度梯度亦在白鮮堿產(chǎn)生肝細胞損傷的濃度范圍內[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，150 μmol/L白鮮堿可以顯著抑制細胞活力、增加細胞LDH釋放率，這提示白鮮堿對脾淋巴細胞確有一定的損傷。細胞凋亡可以導致細胞活力下降，脾淋巴細胞自身在體外存在著自發(fā)性凋亡[10]。流式細胞術檢測中發(fā)現(xiàn)，不同濃度白鮮堿組中代表早期凋亡-象限[（Annexin Ⅴ-FITC）+/PI-]中細胞比例較空白對照組并無顯著性差別，而（Annexin Ⅴ-FITC）+/PI+象限中細胞比例較空白對照組呈顯著的劑量依賴性增加（數(shù)據(jù)未列出，代表晚期凋亡和/或壞死的喪失細胞膜完整性的細胞），與細胞活性檢測結果相一致。細胞凋亡途徑包括線粒體依賴性途徑和非線粒體依賴性途徑，Caspase 3為此兩類凋亡途徑的關鍵蛋白[11-12]。Cleaved-Caspase 3為Caspase 3活化過程中經(jīng)剪切產(chǎn)生的活性片段，實行凋亡“執(zhí)行者”功能，該剪貼體蛋白表達的變化反映著凋亡水平的變化。本研究顯示，低濃度（50、100 μmol/L）白鮮堿可以顯著增加細胞中Cleaved- Caspase 3蛋白的表達，說明凋亡參與了此進程;但隨著白鮮堿濃度的增加，Cleaved-Caspase 3蛋白的表達量逐漸減少，凋亡也減少，但細胞活力卻依然下降，這提示壞死機制可能參與到此過程中。經(jīng)Hoechst 33342和PI雙染法檢驗，隨著白鮮堿濃度的增加，壞死的細胞比例逐漸增多，說明在設定濃度范圍內，凋亡并未參與到細胞活力下降的整個過程中，而壞死是此進程的主要誘因。

某些細胞中，Caspase依賴性的細胞凋亡可以轉換為非Caspase依賴性的細胞死亡。比如，糖皮質激素作用的胸腺細胞，會產(chǎn)生Caspase依賴性凋亡，在使用Caspase廣譜抑制劑之后，細胞仍會以一種類似于凋亡動力學的方式死亡[13-14]。胸腺細胞主要由T淋巴細胞組成，同時，T淋巴細胞也是脾淋巴細胞的重要組成部分。在本研究中，低濃度（50、100 μmol/L）的白鮮堿可促進脾淋巴細胞Cleaved-Caspase 3蛋白表達，高濃度（150 μmol/L）的白鮮堿可抑制Cleaved-Caspase 3蛋白表達，然而凋亡減少的同時壞死卻在增加，表現(xiàn)為細胞活力的持續(xù)下降，這提示高濃度白鮮堿可能作用于脾淋巴細胞中的T淋巴細胞，并將細胞凋亡轉換為壞死進程。DNA的完整性調控著細胞的各種蛋白表達，維持著細胞穩(wěn)定，DNA損傷會改變遺傳物質的結構，阻止細胞復制機制的正常運作[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，白鮮堿可以引起脾淋巴細胞的凋亡和壞死。而細胞凋亡與壞死均可引起DNA規(guī)則和不規(guī)則地斷裂，當損傷超過DNA自身修復功能時，則會引起細胞活力下降。所以，100、150 μmol/L白鮮堿作用后細胞DNA拖尾區(qū)域比例顯著升高。

綜上所述，白鮮堿在體外可以抑制脾淋巴細胞活力，其機制可能與白鮮堿誘導細胞壞死、造成細胞DNA損傷有關，但其更多的作用機制和影響有待進一步研究證實。

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（收稿日期：2019-05-29 修回日期：2019-09-01）

（編輯：林 靜）