奇異變形桿菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展

劉亞?wèn)| 王育偉 劉卜瑋 賴爽 張曉暉 李廷見(jiàn) 周愛(ài)民 肖龍

摘要：奇異變形桿菌（Proteus mirabilis， PM）是一種能導(dǎo)致人和動(dòng)物感染的重要條件致病菌。近年，隨著PM造成人類食物中毒的事件及畜禽發(fā)病的數(shù)量不斷增多，該菌受到高度重視。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用，現(xiàn)在檢測(cè)PM的技術(shù)多樣，該文對(duì)奇異變形桿菌檢測(cè)方法進(jìn)行綜合概述，并簡(jiǎn)要綜述了PM的培養(yǎng)特性以及相關(guān)檢測(cè)手段，以期為今后對(duì)PM的有效防控和進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：奇異變形桿菌;檢測(cè)方法;診斷

中圖分類號(hào)：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.21.001

0 引言

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是一種兩端鈍圓、兼性厭氧、屬于腸桿菌科變形桿菌屬的革蘭氏陰性菌[1]，以桿狀為主，大小為（0.4～0.6） μm×（1.0～3.0） μm，沒(méi)有芽抱和莢膜，大小形態(tài)各異，有鞭毛和菌毛，具有粘附性。該菌主要存在于人與動(dòng)物的體表黏膜與消化道，生成的相關(guān)毒素可導(dǎo)致食物中毒，有些可以和化膿性球菌混合感染，引起繼發(fā)性感染等。容易引起尿道炎、腎孟腎炎、中耳炎和菌血癥等多種疾病。1989年，江益民[2]等首次從病死肉雞中分離到奇異變形桿菌，染病的肉雞表現(xiàn)出熱應(yīng)激反應(yīng)，具有較高的發(fā)病率與死亡率。該菌包括內(nèi)源性與外源性2種傳染方式，通常由污染的水與飼料經(jīng)消化道傳染，或吸人污染的空氣與塵埃經(jīng)呼吸道感染。當(dāng)飼料霉變、衛(wèi)生狀況差、溫度急劇變化、轉(zhuǎn)群時(shí)容易引起應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而誘發(fā)該病。近年多種動(dòng)物相繼都感染該菌，如鵪鶉、鴿子、貂，給畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

1 奇異變形桿菌菌落及生化鑒定

1.1 菌落鑒定

奇異變形桿菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在不同培養(yǎng)基中，PM的顏色形態(tài)各不相同，該菌不耐熱，通常在55℃的條件下持續(xù)加熱60 min能消除該菌[3]。PM適宜的生長(zhǎng)溫度為10～43℃，在這一溫度范圍內(nèi)均能順利繁殖。若將奇異變形桿菌放在濃度為0.5%～3.0%的瓊脂平板上可表現(xiàn)出遷徙生長(zhǎng)現(xiàn)象。在SS瓊脂平板生長(zhǎng)時(shí).呈現(xiàn)圓形、扁薄、半透明的菌落，易與其他腸道致病菌混淆;在血瓊脂平板生長(zhǎng)時(shí)，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，能迅速分解尿素;在麥康凱平板生長(zhǎng)時(shí)，易于分解單個(gè)菌落。在0.1%石碳酸或0.4%硼酸平板生長(zhǎng)時(shí)，奇異變形桿菌擴(kuò)散生長(zhǎng)受到抑制，形成單個(gè)菌落：在固體

平板生長(zhǎng)時(shí)，其形態(tài)特征為短桿菌與纖細(xì)狀長(zhǎng)條菌的交替改變，通常將其稱為Swimmer細(xì)胞與Swarmmer細(xì)胞。相關(guān)學(xué)者圍繞其生物學(xué)特征將其命名為繁殖體與潛生體，英文名稱分別是vegetative cells， VC與Cryptic growth cells，CGC[4]。

1.2 細(xì)菌生化鑒定

生化鑒定是細(xì)菌鑒定中最重要也是最傳統(tǒng)的一種方法，主要是借助細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解能力的不同及其代謝產(chǎn)物的差異對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，包括蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物試驗(yàn)、糖分解產(chǎn)物試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、凝固酶試驗(yàn)等。將待檢細(xì)菌接種至對(duì)應(yīng)的微量生化管內(nèi)，置于37℃條件下培養(yǎng)，24h后觀察并做好記錄。根據(jù)ATB微生物鑒定系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)開(kāi)展鑒定工作，取接種環(huán)輕輕沽取該菌落，將其放入準(zhǔn)備好的滅菌生理鹽水中，借助API麥克法蘭標(biāo)準(zhǔn)比濁管把菌液濃度調(diào)為1.5，最后將生化試條加入其中。之后把試條置于溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，溫度設(shè)為37℃，參照ATB微生物鑒定說(shuō)明書(shū)中試條顏色標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定結(jié)果陰陽(yáng)性，然后把結(jié)果錄入生化鑒定軟件內(nèi)作進(jìn)一步判斷。該菌較為明顯的生化特點(diǎn)就是尿素酶、硫化氫、苯丙氨酸脫氫酶均呈陽(yáng)性[5]，此鑒定方法繁瑣復(fù)雜、耗時(shí)耗力。

2 血清學(xué)診斷

2.1 平板凝集反應(yīng)檢測(cè)法

有學(xué)者于2006年為有效方便地對(duì)奇異變形桿菌的血清進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，進(jìn)而建立一種平板凝集反應(yīng)檢測(cè)方法[5]。方法如下：取待檢血清，用PM平板凝集診斷抗原開(kāi)展平板凝集反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以及空白對(duì)照。當(dāng)陰性對(duì)照結(jié)果為陰性，陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，空白對(duì)照未發(fā)生自凝現(xiàn)象時(shí)對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果予以判定。此外，選取分離菌制作染色抗原，并與PM陽(yáng)性血清進(jìn)行平板凝集反應(yīng)，記錄好結(jié)果。此法能短時(shí)間內(nèi)診斷該菌，進(jìn)而為奇異變性桿菌的流行病學(xué)調(diào)查提供了極大便利。

2.2 免疫熒光抗體診斷法

此法是基于免疫反應(yīng)的特異性與靈敏性特點(diǎn)，并與顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的一種免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，已在現(xiàn)代免疫學(xué)研究中廣泛應(yīng)用。通常選用的標(biāo)記物包括四甲基異硫氰酸羅達(dá)明、異硫氰酸熒光素（FITC）等熒光素。標(biāo)記物與已知抗體結(jié)合作為檢測(cè)試劑，共同檢測(cè)未知抗原。然后借助熒光顯微鏡可發(fā)現(xiàn)有熒光特異性的相關(guān)抗原抗體結(jié)婚晚，進(jìn)而清楚抗原所在具體部位。朱明華[6]等研究了一種直接熒光抗體檢測(cè)方法，利用了該菌的外膜蛋白（OMP）、用FITC標(biāo)記的相關(guān)純化IgG以及兔抗雞奇異變形桿菌外膜蛋白高免血清。據(jù)相關(guān)研究顯示，此法不僅操作簡(jiǎn)便，而且特異性高、敏感性好，為PM的臨床檢測(cè)提供了技術(shù)保障。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法

外國(guó)學(xué)者于1971年通過(guò)堿性磷酸酶對(duì)相關(guān)抗原與抗體進(jìn)行標(biāo)記，進(jìn)而研發(fā)出酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法，即ELISA法[7]。該檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒的血清學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，目前也已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)。2001年，裴標(biāo)[8]等建立了一種對(duì)嗜堿耐鹽奇異變形桿菌病原學(xué)鑒定的ELISA法。此法的操作流程如下：把相關(guān)抗原或抗體吸附在固載體上面，然后對(duì)其進(jìn)行免疫酶染色處理，底物經(jīng)顯色后可直接通過(guò)肉眼觀察結(jié)果或則利用分光光度計(jì)判斷結(jié)果。

3 細(xì)菌鑒定分子生物學(xué)方法

3.1 PCR檢測(cè)法

該技術(shù)具有良好的敏感性與特異性，屬于臨床微生物檢驗(yàn)的最佳方法。 目前，此法已用于很多細(xì)菌與病毒感染疾病的早期診斷、相關(guān)遺傳病的診斷、基因分析等領(lǐng)域，現(xiàn)已衍生出多種PCR技術(shù)，如多重PCR、原位PCR、巢式PCR等。在奇異變形桿菌檢測(cè)中PCR技術(shù)受到日益重視，外國(guó)學(xué)者將16SrRNA、ureC等基因作為靶基因，研究出了專門檢測(cè)奇異變形桿菌屬的PCR檢測(cè)法，為后來(lái)該菌的PCR檢測(cè)工作打下基礎(chǔ)。圍繞編碼奇異變形桿菌的脲酶調(diào)節(jié)子（ureR）的基因序列設(shè)計(jì)2條引物建立PCR方法，該方法有效區(qū)別了奇異變形桿菌和普通變形桿菌;畢水蓮[[91等發(fā)現(xiàn)了atPD基因、tut基因，將其作為靶基因，研發(fā)出新的PCR法，用于檢測(cè)奇異變形桿菌。以上PCR方法均具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

此法英文簡(jiǎn)稱為real-time PCR，將熒光基團(tuán)添加到PCR反應(yīng)體系內(nèi)，借助熒光信號(hào)積累進(jìn)而對(duì)PCR的整個(gè)過(guò)程加以實(shí)時(shí)監(jiān)控，最后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析研究未知模板。此法不僅靈敏度好、特異性好、可重復(fù)，而且定量精準(zhǔn)、快速，屬于全封閉反應(yīng)。 目前應(yīng)用較多的real-time PCR檢測(cè)方法包括TaqMan探針與SYBR Green標(biāo)記。畢水蓮0等人于2008年就新發(fā)現(xiàn)的PM菌屬的atpD基因序列設(shè)計(jì)了相關(guān)引物，構(gòu)建出SYBR Green熒光定量PCR法。ZHANG[10]等于2013年找到了SYBR Green熒光定量PCR法，能快速鑒別PM，并能對(duì)該菌的DNA以及細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行定量。2017年，史瑞雅[11]等針對(duì)雞奇異變形桿菌全基因序列設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，建立檢測(cè)雞奇異變形桿菌的SYBR Green I LC-PCR檢測(cè)方法，該方法可用于雞奇異變形桿菌的監(jiān)測(cè)和早期臨床診斷。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

日本學(xué)者在2000年研發(fā)出一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermalamplification，簡(jiǎn)稱LAW） 。該技術(shù)通過(guò)在恒溫條件下使用一種能鏈置換的DNA聚合酶以及可以識(shí)別靶序列上面6個(gè)位點(diǎn)的4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的高效、迅速、特異擴(kuò)增。由于該技術(shù)不佳操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短、而且靈敏性與特異性好，產(chǎn)物易檢查，已大量應(yīng)用在食品安全檢測(cè)行業(yè)中。蘇良[12]等在2010年研究了一種檢測(cè)奇異變形桿菌的LAMP檢測(cè)法，它是根據(jù)奇異變形桿菌a酶調(diào)節(jié)子編碼基因（ureR）特異序列的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的4個(gè)LAMP引物。王鵬[13]等在2011年圍繞變形桿菌屬atpD基因序列，設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的6個(gè)引物，包括內(nèi)引物、外引物、環(huán)引物各2個(gè)，構(gòu)建出檢測(cè)PM菌屬的LAMP法。此法能檢測(cè)普通變形桿菌以及奇異變形桿菌，可直接檢測(cè)食品樣品。

4 結(jié)束語(yǔ)

奇異變形桿菌造成的畜禽感染事件在近年經(jīng)常發(fā)生，它屬于僅次于沙門氏菌的一種強(qiáng)致病菌?，F(xiàn)在很多學(xué)者通過(guò)采用新型技術(shù)去檢測(cè)奇異變形桿菌，如高興[14]等在2013年將UreR基因作為靶基因，利用多重PCR制作出檢測(cè)細(xì)菌基因芯片的檢測(cè)方法，可以檢測(cè)11種食源性細(xì)菌基因芯片。此法還能對(duì)多種病原體與多種基因進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)與分析。MEZGER[15]等在2015年建立了檢測(cè)致病菌的可伸縮的基于DNA的磁性納米顆粒凝集方法，該方法不需要改變溫度就能制備大量的DNA，可用于平行檢測(cè)多種病源菌。通過(guò)檢測(cè)奇異變形桿菌技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，為后續(xù)該菌屬的耐藥特征和防控機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，可用于獸醫(yī)臨床分離鑒定以及臨床合理用藥指導(dǎo)，進(jìn)而減少耐藥菌株產(chǎn)生。

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基金項(xiàng)目：四川省“十三五”肉雞育種攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：20164YZ0043） ，國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系四川獸藥創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（項(xiàng)目編號(hào)：CARS-SVDIP）

作者簡(jiǎn)介：劉亞?wèn)|（1991-） ，女，河南人，碩士，助理獸醫(yī)師，

研究方向：動(dòng)物檢疫。

通信作者：劉亞?wèn)|。