某院2015—2019年肺炎克雷伯菌的耐藥性及耐藥基因分析

胡小騫 王琴

(安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，合肥 230601)

肺炎克雷伯菌(KP)最初于1882年由Friedlander[1]發(fā)現(xiàn)，其廣泛存在于自然界中，包括土壤、水質(zhì)及動物體內(nèi)。KP是人體內(nèi)的常見病原菌，當機體免疫力低下或定植部位發(fā)生變化時，可引起呼吸道、泌尿道、血液感染，甚至是敗血癥[2]。近年來，由于第三代頭孢菌素及碳青霉烯類抗生素的不合理使用，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)及耐碳青霉烯類的肺炎克雷伯菌逐年增加[3-4]。CR-KP的泛耐藥性、強致病性、高傳染性，增大了臨床抗感染治療及耐藥菌防控的難度[5-6]。本研究通過分析安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院2015—2019年2416株KP的臨床分布及對常用抗菌藥物的耐藥情況，研究5年來KP耐藥性的變遷，分析CR-KP的耐藥基因型，為臨床抗感染治療及合理用藥提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

回顧性分析安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院2015年1月—2019年12月臨床分離的肺炎克雷伯菌，剔除同一患者的重復菌株，共計2416株。選取2019年內(nèi)科重癥監(jiān)護病區(qū)(ICU)的19株CR-KP進行全基因組測序。

1.1.2 試劑與儀器

采用法國VITEK-2 Compat全自動細菌分析系統(tǒng)和配套試劑GN/GN13，進行革蘭陰性菌的鑒定及藥敏試驗，藥敏試驗采用微量稀釋法(MIC法)和K-B紙片擴散法，藥敏紙片及M-H培養(yǎng)基購自O(shè)xoid公司，質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603購自國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心，使用天根生化科技有限公司的試劑盒進行細菌基因組DNA的提取，DNA Marker D、4S Red plus核酸染色劑、上樣緩沖液均購于上海生工生物工程股份有限公司，DNA產(chǎn)物濃度及純度測定使用英國Biochrom公司的超微量分光光度計，運用上海一恒科學儀器有限公司恒溫培養(yǎng)搖床進行細菌液體培養(yǎng)，使用美國Bio-Rad公司的電泳儀進行瓊脂糖凝膠電泳，采用美國Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進行瓊脂糖凝膠的成像。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)、鑒定及藥敏實驗

依據(jù)《臨床微生物樣本采集規(guī)范》采集標本，參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程(第4版)》，在血瓊脂平皿、麥康凱瓊脂平皿上按照四區(qū)劃線原則進行接種，于CO2恒溫培養(yǎng)箱(36℃±1℃)培養(yǎng)24～48 h，采用法國VITEK-2 Compat全自動細菌分析系統(tǒng)進行革蘭陰性菌的鑒定及藥敏試驗。參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)當年標準判定細菌的藥敏結(jié)果，使用微量稀釋法(MIC法)和K-B紙片擴散法對CR-KP菌株進行表型確認，CR-KP藥敏結(jié)果判定標準為對任一種碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美羅培南、多尼培南或厄他培南)耐藥的肺炎克雷伯菌。

1.2.2 細菌基因組DNA提取

復蘇CR-KP菌株于LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取單克隆CR-KP菌株于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min搖菌過夜。取細菌培養(yǎng)液1 mL，10000 r/min離心1 min，吸凈上清液，保留菌體沉淀，使用DNA提取試劑盒提取菌株DNA。

1.2.3 基因組DNA提取物質(zhì)量控制標準

將DNA提取產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并用超微量分光光度計檢測純度和濃度。純度要求菌株DNA產(chǎn)物的A260:A280在1.8～2.0范圍之內(nèi)，避免RNA污染；DNA濃度≥20 ng/μL，條帶清晰無雜帶，總量在1.0～2.0 μg范圍內(nèi)。

1.2.4 細菌全基因組測序

運用上海生工生物有限公司Illumina Hiseq2500測序平臺對菌株進行全基因組測序，基于Illumina平臺的測序，是對核酸提取樣本進行建庫、擴增測序、質(zhì)控的3個主要步驟。

1.2.5 測序結(jié)果組裝

在Linux或Centos系統(tǒng)中運行SPAdes-2.0軟件將測序原始FASTQ結(jié)果拼接為FASTA文件，運行命令參考SPAdes-2.0軟件網(wǎng)址https://github.com/ablab/spades。

1.2.6 耐藥基因檢測

運用丹麥技術(shù)大學(DTU)基因組流行病學中心(CGE)網(wǎng)站(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)的ResFinder 4.0工具，對19株CR-KP的contigs進行耐藥基因型篩選，獲得其攜帶的耐藥基因。運用MORPHEUS網(wǎng)站(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)在線制作19株CR-KP的耐藥基因熱圖，實現(xiàn)耐藥基因分布可視化。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

采用WHONET5.6軟件對菌株的標本來源、科室分布、檢出率及耐藥率進行數(shù)據(jù)收集，運用SPSS 20.0軟件對5年期間菌株的檢出率、耐藥率進行比較及趨勢統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以百分比表示，率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，趨勢性分析采用趨勢χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌分布

2015—2019年期間，肺炎克雷伯菌的分離率分別為8.61%(378/4392)、9.84%(448/4555)、8.66%(381/4401)、10.5 1%(622/5916)、11.09%(587/5294)，5年分離率之間的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=26.800，P＜0.001)，呈上升趨勢(χ2趨勢=18.190，P＜0.001)，見表1。2015—2019年肺炎克雷伯菌構(gòu)成比較高的科室為內(nèi)科ICU23.2%(561/2416)、外科ICU 19.1%(461/2416)、呼吸內(nèi)科18.8%(454/2416)、神經(jīng)內(nèi)科10.9%(263/2416)。2015—2019年肺炎克雷伯菌構(gòu)成比較高的標本為痰液51.7%(1249/2416)、尿液11.3%(273/2416)、血液7.5%(181/2416)、分泌物5.8%(140/2416)。

表1 2015—2019年肺炎克雷伯菌在全部臨床分離株中的分離情況Tab.1 Isolation of Klebsiella pneumoniae in all clinical isolates from 2015 to 2019

2.2 肺炎克雷伯菌抗菌活性

2015—2019年期間，肺炎克雷伯菌對18種抗菌藥物的耐藥率呈上升趨勢，除替加環(huán)素的耐藥率差異無法統(tǒng)計外，對其他各類抗菌藥物的耐藥率差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。對亞胺培南、美羅培南耐藥率分別從2015年的2.9%和3.0%上升至2019年的16.0%和13.7%，頭孢他啶和頭孢吡肟耐藥率分別從12.7%和10.1%上升至24.2%和21.1%，頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率分別從2015年的3.2%和4.2%上升至2019年的16.8%和16.5%，環(huán)丙沙星、左氧氟沙星耐藥率分別從18.3%和14.8%上升至29.1%和26.6%，阿米卡星和慶大霉素耐藥率分別從4.2%和18.5%上升至12.8%和28.3%。本院自2017年開始對替加環(huán)素的MIC值進行監(jiān)測，2017—2019年肺炎克雷伯菌對替加環(huán)素的耐藥率均為0，見表2。

表2 2015—2019年各年份肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的抗菌活性比較Tab.2 Comparison of the antibacterial activity of Klebsiella pneumoniae against commonly used antibiotics in various years from 2015 to 2019

2.3 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌分布

2015—2019年各年度檢出CR-KP占肺炎克雷伯菌比例分別為3.70%(14/378)、10.04%(45/448)、18.90%(72/381)、19.29%(120/622)、17.55%(103/587)，5年檢出率之間的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=63.973，P＜0.001)，呈上升趨勢(χ2趨勢=46.176，P＜0.001)，見表3。2015—2019年CR-KP構(gòu)成比較高的科室為外科ICU 14.4%(51/354)、內(nèi)科ICU 10.2%(36/354)、呼吸ICU 8.5%(30/354)、急診ICU 2.0%(7/354)。2015—2019年CR-KP構(gòu)成比較高的標本為痰液43.8%(155/354)、尿液10.7%(38/354)、分泌物7.1%(25/354)、血液6.5%(23/354)。

表3 2015—2019年耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的檢出情況Tab.3 Detection of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae from 2015 to 2019

2.4 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌抗菌活性

2015—2019年CR-KP對各類抗菌藥物呈現(xiàn)出不同程度的耐藥，總體呈現(xiàn)上升趨勢。除對慶大霉素的耐藥率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.105)、替加環(huán)素的耐藥率差異無法統(tǒng)計外，對其他各類抗菌藥物的耐藥率差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別從2015年的92.9%和77.8%上升至2019年的100.0%和98.8%，對頭孢菌素的耐藥率呈上升趨勢，對頭孢他啶和頭孢曲松的耐藥率分別從2015年的64.3%和78.6%上升至2019年的98.1%和99.0%，對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別從50.0%和42.9%上升至91.3%和91.3%，對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率分別從42.9%和71.4%上升至68.0%和83.5%。對替加環(huán)素的耐藥率均為0(表4)。

表4 2015—2019年各年份耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的抗菌活性比較Tab.4 Comparison of antibacterial activities of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae against commonly used antibiotics in various years from 2015 to 2019

2.5 ICU耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測結(jié)果

選取2019年內(nèi)科ICU的19株CR-KP進行WGS檢測及耐藥基因分析，檢測出15種耐藥基因，繪制耐藥基因熱圖，見圖1。其中，攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrS1)、磷霉素耐藥基因(fosA)、四環(huán)素耐藥基因(tetA)、氯霉素耐藥基因(catA2)均有19株(100%)；氨基糖苷類耐藥基因為aadA2b和rmtB，同時攜帶兩者的菌株有17株(89.5%)；磺胺類藥物耐藥基因為sul1和sul2，同時攜帶兩者的菌株有17株(89.5%)；攜帶甲氧芐啶耐藥基因(dfrA14)有18株(94.7%)；β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因為blaLAP-2、blaTEM-1B、blaKPC-2、blaSHV-12、blaSHV-15和blaSHV-66，同時攜帶此6種耐藥基因的菌株有15株(78.9%)。

3 討論

KP是院內(nèi)感染的常見致病菌之一，易造成創(chuàng)面、肺部、泌尿系統(tǒng)和血液系統(tǒng)感染[7]。本研究期間，本院KP的分離率呈逐年上升趨勢(χ2趨勢=18.190，P＜0.001)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=26.800，P＜0.001)。2416株KP有51.7%分離自痰液，表明KP主要感染部位為呼吸道，與其他監(jiān)測報道一致[8-10]。KP主要分布于ICU、呼吸內(nèi)科，可能由于住院患者病情危重且抵抗力低下，接受呼吸道侵入性治療多，抗菌藥物的使用較為頻繁[11]，易誘導引起細菌耐藥。

本研究中，由于近幾年臨床廣泛使用抗生素，KP的耐藥率總體呈升高趨勢。耐藥率較高的抗生素有頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢曲松、氨曲南、慶大霉素、環(huán)丙沙星、復方磺胺甲惡唑，結(jié)果顯示KP對頭孢菌素的耐藥率呈逐年攀升趨勢。對碳青霉烯類藥物(如亞胺培南、美羅培南)的耐藥率相比較低，但有持續(xù)增高的趨勢[12]，對亞胺培南、美羅培南耐藥率分別從2015年的2.9%、3.0%上升至2019年的16.0%、13.7%，2019年CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果報道，36所三級醫(yī)院的KP對亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別從2005年的3.0%、2.9%增至2019年的25.3%、26.8%[13]，耐藥率高于本研究結(jié)果。提示臨床應(yīng)強化碳青霉烯類藥物的管理，防止藥物對多重耐藥菌及泛耐藥菌的選擇。本研究中KP對常用抗生素的耐藥率偏高，未發(fā)現(xiàn)替加環(huán)素耐藥的KP，其原因與KPC能夠水解青霉素類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、碳青霉烯類等抗菌藥物有關(guān)[8]。

近年來，CR-KP呈現(xiàn)全球蔓延趨勢，引起了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[14]。本研究顯示2015—2019年本院的CR-KP的檢出率呈上升趨勢(χ2趨勢=46.176，P＜0.001)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=63.973，P＜0.001)。標本主要來源于痰液(43.8%)，表明CR-KP的感染部位以呼吸系統(tǒng)居多，與Li等[15]的報道一致。分布科室主要集中于ICU，考慮與ICU患者常接受侵入性操作(如氣管插管、呼吸機輔助通氣)、氣道黏膜屏障易受損等因素相關(guān)，提示臨床和感控部門應(yīng)加強重點部位三管的感染防控管理，以降低呼吸道CR-KP的感染率。

碳青霉烯類抗菌藥物是耐藥腸桿菌科細菌治療的最后一道防線[16]，CR-KP的檢出率和耐藥率逐年增高，給臨床抗感染治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。引起這種結(jié)果的主要原因為臨床抗菌藥物濫用、患者使用抗菌藥物時未遵照醫(yī)囑執(zhí)行，以及抗生素在農(nóng)牧業(yè)中的超量使用等[17]。目前，我國臨床針對CRE的有效用藥為替加環(huán)素、多黏菌素，也可同其他種類抗生素聯(lián)合使用[18]。本研究結(jié)果顯示，2015—2019年CR-KP對各類抗菌藥物的耐藥率總體呈升高趨勢，除慶大霉素、替加環(huán)素以外，其對各類藥物不同年份間的耐藥率差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CR-KP除了對替加環(huán)素的耐藥率較低以外，對絕大部分抗菌藥物的耐藥率均偏高，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達100%和98.8%。提示臨床應(yīng)重視抗菌藥物使用的科學化管理，改善抗菌藥物應(yīng)用策略，重點關(guān)注替加環(huán)素、碳青霉烯類等抗菌藥物使用的監(jiān)督管理。

CR-KP耐藥機制較為復雜，主要有產(chǎn)碳青霉烯酶、高產(chǎn)AmpC酶、外膜孔蛋白的缺失或低通透性、外排泵的過表達、藥物作用位點的改變等分子生物學機制導致[19]。其中，產(chǎn)碳青霉烯酶最為重要。A、B、D類β-內(nèi)酰胺酶為產(chǎn)碳青霉烯酶的主要分類，主要為KPC、VIM、IMP、NDM、OXA-48[20]。位于質(zhì)粒上的耐藥基因可在不同菌株間水平或垂直傳播，引起耐藥菌的播散，甚至是院感暴發(fā)的發(fā)生[21]。細菌耐藥性研究主要包括耐藥表型和耐藥基因型研究。耐藥表型常用藥敏試驗檢測，但常局限于藥物種類的不全面和少數(shù)菌株培養(yǎng)的嚴格環(huán)境；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為目前主要的基因研究方法，但僅局限于已知的基因型，分辨率較低[22]。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，WGS與生物信息學結(jié)合的方法已逐漸成為精準研究細菌耐藥性的主流方法[23]。

本研究選取CR-KP檢出率較高的內(nèi)科ICU，收集其2019年檢出的19株CR-KP進行WGS及耐藥基因檢測。結(jié)果顯示，19株CR-KP呈現(xiàn)出多種耐藥基因型。其中，blaKPC-2是引起耐碳青霉烯的重要機制，已廣泛存在于19株CR-KP中，其他β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因可能導致頭孢菌素耐藥。本研究中的菌株均攜帶喹諾酮類耐藥基因(qnrS1)，Qnr蛋白是一種五肽重復蛋白家族，可以保護細菌DNA螺旋酶和拓撲異構(gòu)酶IV免受喹諾酮類藥物的抑制，qnrS1是質(zhì)粒介導的7大qnr耐藥基因家族之一，Monarrez等[24]報道證實環(huán)丙沙星可誘導細菌質(zhì)粒上qnrS1的表達。17株CR-KP攜帶的aadA2b和aadA2b是aadA耐藥基因中最常見的一種類型[25]，aadA基因最初于1985年發(fā)現(xiàn)，有研究表明Ⅰ類整合素中存在aadA基因，該基因編碼氨基糖苷3'-9-腺苷酸轉(zhuǎn)移酶，對鏈霉素和壯觀霉素具有抗性[26]。rmtB耐藥基因位于質(zhì)粒上，其通過水平轉(zhuǎn)移和克隆傳播進行傳播[27]，rmtB通過促進16S RMTA酶編碼基因的激活和轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)16S RMTA酶誘導細菌對氨基糖苷類的高水平耐藥，影響了氨基糖苷類藥物在CR-KP感染治療中的作用[28]，本研究中的19株CR-KP均攜帶rmtB基因。本研究中的藥敏試驗未檢測磷霉素，WGS耐藥基因檢測到19株CR-KP均攜帶磷霉素耐藥基因(fosA)，磷霉素可能對于CR-KP的治療無效。本研究中CR-KP對替加環(huán)素均敏感，其攜帶的四環(huán)素耐藥基因均為tetA，屬于MFS型外排泵，此型不產(chǎn)生替加環(huán)素耐藥。本研究未檢測出多黏菌素耐藥基因。同時，本研究中的耐藥基因結(jié)果顯示，19株CR-KP的同源相關(guān)性較高，說明CR-KP在該病區(qū)存在院內(nèi)傳播的可能，但由于檢測菌株數(shù)目較少、代表性不強，在預測院內(nèi)傳播路徑方面的研究仍具有一定的局限性。

綜上所述，近年來本院KP及CR-KP耐藥形勢嚴峻，耐藥基因多樣化，醫(yī)務(wù)部、醫(yī)院感染管理辦公室、藥學部、感染性疾病科、微生物室、醫(yī)學信息科等多學科抗菌藥物管理組，應(yīng)持續(xù)加強耐藥菌監(jiān)測，規(guī)范管理抗菌藥物，有效開展抗菌藥物知識培訓，落實精準的感染預防控制措施，預防耐藥菌的流行播散。 WGS結(jié)合生物信息學分析技術(shù)在細菌耐藥性研究方面表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景[29]，未來將會成為耐藥菌研究最主流的方法之一。