HPLC法測(cè)定葉黃素葡萄籽軟膠囊中葉黃素的含量

鄭海云　 趙海譽(yù)　 翟永松

摘要：目的：建立葉黃素葡萄籽軟膠囊中葉黃素含量測(cè)定的高效液相色譜法。方法：參考GB5009.248方法，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定了本產(chǎn)品的色譜條件。以甲醇-甲基叔丁基醚為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.0mL/min，柱溫 25℃，經(jīng)由 YMC Carotenoid 色譜柱分離，采用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)器在 445nm 下進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積外標(biāo)法定量。結(jié)果：加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)中，三個(gè)添加水平下，葉黃素的平均回收率在93.6%-104.7%之間，RSD為1.26%-2.25%。方法檢出限為0.03g/100g，定量限為0.10g/100g。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便易行，穩(wěn)定性好，是檢測(cè)葉黃素葡萄籽軟膠囊中葉黃素的有效定量方法。

關(guān)鍵詞：葉黃素葡萄籽軟膠囊;葉黃素;含量測(cè)定;高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R969.4???? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A?????? 【文章編號(hào)】1004-7484（2019）10-0070-03

Determination of Lutein in Yehuangsuputaozi Softgel by HPLC

ZHENG Hai-yun1，ZHAO Hai-yu2，ZHAI Yong-song3，GONG Wei-hong4 （1.Collaborating Center for TCM and Scientific Technology，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2.Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;3.Beijing Pharmaceutical Education Training Center， Beijing 100079， China ;4.School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China.）

【Abstract】 Objective To establish the determination of lutein in Yehuangsuputaozi Softgel by HPLC.Methods Consulting GB 500.9.248 and experiments，using methanol-methyl tert-butyl ether as mobile phase，gradient elution，flow rate was 1.0mL/min，column temperature was 25℃，separated by YMC Carotenoid column，detected by HPLC with photo-diode array detector （PDA） at 445 nm，and quantified by the external standard method. Results At different spiked levels，the average recoveries of lutein were between 93.6%-104.7%，with the RSDs of 1.26%-2.25%.Limit of detection and limit of quantitation were 0.03g/100g，0.10g/100g， respectively.Conclusion The method is simple， rapid and accurate， which can be applied to the analysis of the content of lutein in Yehuangsuputaozi Softgel.

【Key words】Yehuangsuputaozi Softgel;Lutein;Determination;HPLC

葉黃素提取自萬(wàn)壽菊中，是存在于視網(wǎng)膜黃斑處的主要色素，有抗氧化和過(guò)濾藍(lán)光的作用[1]。越來(lái)越多流行病學(xué)和臨床試驗(yàn)表明，膳食或血清中較高含量的葉黃素可降低眼部疾病患病風(fēng)險(xiǎn)[2]。作為生理活性物質(zhì)，葉黃素在醫(yī)學(xué)和功能食品領(lǐng)域具有廣闊的研究開發(fā)前景[3]。葉黃素葡萄籽軟膠囊主要由葉黃素、葡萄籽提取物、維生素E等成分組成的復(fù)方制劑，主要用于緩解視疲勞，具有一定的改善視力的作用，適用于視力易疲勞者。本文研究了本產(chǎn)品中有效成分葉黃素的含量測(cè)定方法。結(jié)合本產(chǎn)品的配方、制備工藝等特點(diǎn)，參考GB 5009.248食品中葉黃素的測(cè)定[4]及實(shí)驗(yàn)結(jié)果制定了本產(chǎn)品中葉黃素的高效液相含量測(cè)定方法，完善產(chǎn)品的技術(shù)要求，保證產(chǎn)品的質(zhì)量可控。

1 儀器與試劑

1.1儀器：Waters Alliance e2695高效液相色譜儀，附二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)waters公司）;BP-211D型十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius公司）;UV-2800H型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）;CH-300型超聲波清洗機(jī)（北京創(chuàng)新德超超聲電子研究所）

1.2樣品與試劑：葉黃素對(duì)照品（純度≥95%，來(lái)源于萬(wàn)壽菊，美國(guó) ChromaDex 公司）;葉黃素葡萄籽軟膠囊（由北京福壽堂生物科技發(fā)展有限公司提供）;丙酮、甲醇、甲基叔丁基醚、二氯甲烷為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件：色譜柱：YMC Carotenoid 4.6*250mm，5μm;柱溫：25℃;流動(dòng)相：甲醇-甲基叔丁基醚，梯度洗脫，梯度條件見表1;流速：1.0mL/min;進(jìn)樣體積：10μL;檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng)：445nm。

2.2試液的配制

2.2.1 0.1%丙酮：稱取2.0gBHT于2000mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度。

2.2.2對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：稱取葉黃素對(duì)照品150mg于100mL棕色容量瓶中，二氯甲烷溶解并定容至刻度，其濃度約為1.5mg/mL。該溶液避光于-80℃下保存，六個(gè)月內(nèi)使用。使用前需校正。

2.2.3供試品溶液：取本品10粒，取出內(nèi)容物混勻，精確稱取樣品0.3g于100mL棕色容量瓶中，加0.1%BHT丙酮超聲提取15min，冷卻至室溫后，定容至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取1.00mL該溶液于10mL棕色容量瓶中，用0.1%BHT丙酮稀釋至刻度。搖勻，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣。

2.2.4陰性樣品溶液：取不含葉黃素的陰性樣品，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備得陰性樣品溶液。

2.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液2.50mL于100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。該溶液避光于-80℃下保存。精密吸取1.00mL標(biāo)準(zhǔn)中間溶液至25mL棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度。以乙醇作空白，在445nm處測(cè)定吸光度A。按公式計(jì)算儲(chǔ)備液中葉黃素的濃度（mg/mL）。式中A為樣品測(cè)得的吸光度;2550為葉黃素在乙醇溶液中的百分吸光系數(shù)。經(jīng)校正后其儲(chǔ)備液濃度為1.352mg/mL。

2.4專屬性實(shí)驗(yàn)：按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別記錄取陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液，見圖1、2、3。結(jié)果顯示，對(duì)照品色譜圖中，葉黃素的出峰時(shí)間合適，峰形良好附近，供試品色譜圖中葉黃素峰分離良好，無(wú)雜峰干擾，陰性樣品色譜圖中葉黃素保留時(shí)間處無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明陰性樣品對(duì)葉黃素測(cè)定無(wú)干擾，符合專屬性要求。

2.5線性關(guān)系考察：分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.25mL、0.50mL、1.00mL、2.50mL、5.00mL、10.00mL于10mL棕色容量瓶中，用0.1%丙酮稀釋成工作溶液，其濃度分別為：0.8450μg/mL、1.690μg/mL、3.380μg/mL、8.450μg/mL、16.90μg/mL、33.80μg/mL。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制曲線方程。曲線方程Y=74613X-3.8093，r=0.9995。葉黃素在0.8450μg/mL-33.80μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性良好。

2.6精密度試驗(yàn)：稱取6份樣品（批號(hào)20171107），按照“2.2.3”項(xiàng)下樣品前處理操作，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)試方法精密度，結(jié)果見表2。本方法精密度良好。

2.7準(zhǔn)確度試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20171107），各稱取3份樣品，分別加入濃度為1.352mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液6mL、7mL和8mL，按法操作，按照低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下的標(biāo)準(zhǔn)添加，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，三個(gè)添加濃度水平下，葉黃素的平均回收率在93.6%-104.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.26%-2.25%。結(jié)果見表3。本方法準(zhǔn)確度良好。

2.8方法檢測(cè)限和定量限：當(dāng)取樣量為0.3g，定容體積為100mL，稀釋倍數(shù)為10倍時(shí)，按3倍信噪比計(jì)算，該方法葉黃素的檢測(cè)限為0.03g/100g，定量限為0.10g/100g。

2.9樣品的含量測(cè)定：取三批葉黃素葡萄籽軟膠囊，按照“2.2.3”項(xiàng)下樣品的處理方法操作，并“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表4。

3 討論

本測(cè)定方法主要參考GB5009.248進(jìn)行，結(jié)合自身產(chǎn)品的屬性，改進(jìn)了提取方法及測(cè)定條件。

3.1樣品前處理的考察：本產(chǎn)品中添加的葉黃素原料為游離狀態(tài)，未進(jìn)行包埋，因此容易提取出來(lái)。葉黃素對(duì)光非常敏感，因此本產(chǎn)品采用避光超聲方法進(jìn)行提取。對(duì)同一樣品分別用丙酮及 0.1% BHT 丙酮為提取溶劑，測(cè)定提取后的葉黃素含量，提取溶劑中加入了BHT葉黃素的穩(wěn)定性更好[5]，故選擇以 0.1% BHT 丙酮為提取溶劑。分別考察超聲 10，15，20 min 葉黃素的提取效果，結(jié)果顯示，超聲15min和20min差異不大，均優(yōu)于超聲10min，故選擇超聲時(shí)間為15min。

3.2色譜條件的優(yōu)化：按照GB5009.248的色譜條件，在高效液相中進(jìn)樣，色譜圖中峰的分離度不好，經(jīng)過(guò)多次摸索和改進(jìn)，確定了以甲醇-甲基叔丁基醚為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫條件詳見表1的色譜條件。

4 結(jié)論

參考GB5009.248，結(jié)合產(chǎn)品自身性質(zhì)，我們建立了葉黃素葡萄籽軟膠囊中葉黃素的測(cè)定方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此方法專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性、方法檢測(cè)限和定量限均符合相關(guān)要求，是檢測(cè)葉黃素軟膠囊中葉黃素的有效定量方法。

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課題：重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng) 2019ZX09201-005-006-002