含雄黃中藥復(fù)方牛黃解毒片毒性的研究進(jìn)展

徐文峰　金鵬飛　徐碩　張閃閃　鄺詠梅　姜文清

[摘要] 牛黃解毒片是著名的清熱解毒藥物，被2015年版《中國藥典》一部收載，臨床上使用廣泛。因為方中包含有毒中藥雄黃，其安全性廣受關(guān)注。本文從安全性研究，牛黃解毒片配伍對雄黃毒性、可溶性砷以及砷形態(tài)的影響等方面對含雄黃中藥復(fù)方牛黃解毒片毒性的研究進(jìn)展加以總結(jié)，為其深入研究及臨床合理應(yīng)用提供參考。

[關(guān)鍵詞] 牛黃解毒片;雄黃;毒性;配伍減毒

[中圖分類號] R285.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）06（c）-0038-04

Research progress of toxicity of Niuhuang Jiedu Tablets containing realgar

XU Wenfeng ? JIN Pengfei ? XU Shuo ? ZHANG Shanshan ? KUANG Yongmei ? JIANG Wenqing

Department of Pharmacy， Beijing Hospital， National Center of Gerontology， Assessment of Clinical Drugs Risk and Individual Application Key Laboratory， Bejing ? 100730， China

[Abstract] Niuhuang Jiedu Tablets （NJT） is an effective and widely used traditional Chinese medicine （TCM） in clearing heat and detoxicating， and it is fficially listed in the Chinese Pharmacopeia （2015）. As a TCM that contains realgar， its toxicity and safety has always been concerned. This article reviewed the research progress of safety study， toxicity， soluble arsenic and arsenic form of realgar influenced by compatibility of NJT， so as to provide a reference for its further researches and rational clinical uses.

[Key words] Niuhuang Jiedu Tablets; Realgar; Toxicity; Toxicity alleviation effects

牛黃解毒片是著名的清熱解毒藥物，處方雛形早在元代的《咽喉脈癥通論》一書中即有收載，歷史上幾經(jīng)修改和變動，最終發(fā)展為目前2015年版《中國藥典》一部的收載處方，即：人工牛黃5 g、雄黃50 g、石膏200 g、大黃200 g、黃芩150 g、桔梗100 g、冰片25 g、甘草50 g，經(jīng)過各工序最終壓制成1000片（大片）或1500片（小片）[1]。牛黃解毒片作為經(jīng)典的中成藥品種，臨床上主要用于火熱內(nèi)盛、咽喉腫痛、牙齦腫痛、口舌生瘡、目赤腫痛等癥狀[1]。經(jīng)過幾百年的臨床實踐，其療效已得到中醫(yī)藥界的廣泛認(rèn)可，并已成為臨床最為常用的中成藥之一。

處方中雄黃的主要成分為二硫化二砷（As2S2），國際衛(wèi)生組織早在1981年已將砷認(rèn)定為人類致癌物[2]。國務(wù)院在《醫(yī)療用毒性藥品管理辦法》中特別載明含砷中藥雄黃為28種毒性中藥之一。牛黃解毒片每日服用量中雄黃的含量高達(dá)0.2～0.3 g，相當(dāng)于2015年版《中國藥典》規(guī)定的雄黃最高服用量的2～3倍（藥典規(guī)定雄黃的日服用量是0.05～0.1 g），其安全性問題已引起國內(nèi)外藥品監(jiān)管部門的關(guān)注。本文對近年來牛黃解毒片毒性的研究進(jìn)展加以總結(jié)，以對其深入研究及臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 牛黃解毒片的安全性研究

根據(jù)臨床觀察和文獻(xiàn)查閱，隨意增加藥量、延長用藥時間等，導(dǎo)致長期、大量使用牛黃解毒片是造成其不良反應(yīng)和慢性砷中毒的主要原因[3-7]。但是，除了患者機(jī)體因素以及不合理用藥會導(dǎo)致牛黃解毒片不良反應(yīng)和慢性砷中毒外，牛黃解毒片所含雄黃對其安全性的影響仍然需要深入研究。

1.1 臟器毒性研究

一項研究[8]發(fā)現(xiàn)大鼠連續(xù)單劑量灌胃服用牛黃解毒片（0.217 g/kg），在各設(shè)定時間段體重與對照組比較未見明顯變化，白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、血小板計數(shù)及白細(xì)胞計數(shù)與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。給藥組大鼠肝和腎的臟體比值未見明顯差異，也未見病理學(xué)改變。將給藥劑量增加為6.43 g/kg（臨床用量的50倍）時，牛黃解毒片對大鼠依然無明顯急性毒性[9]。牛黃解毒片對昆明小鼠的急性毒性的研究顯示牛黃解毒片各劑量組（60、180、600 mg/kg）小鼠的肝腎功能和病理檢查與對照組相似，未見異常。雄黃組（600 mg/kg）小鼠肝、腎組織發(fā)生輕度病理變化[10]。

1.2 生殖毒性研究

污染物至突變（Ames）試驗、染色體畸變分析及單細(xì)胞凝膠電泳實驗（SCGE）可分別從基因、染色體和DNA水平對藥物的體外遺傳毒性進(jìn)行研究。骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗、精子畸形試驗以及單細(xì)胞凝膠電泳實驗可對藥物的體外遺傳毒性進(jìn)行研究[11]。

研究顯示牛黃解毒片水溶液（0.05～5 mg/皿）未見明顯基因突變作用;而且其水溶液（13.5～54 μg/mL）對CHL細(xì)胞染色體畸變率均小于5%，未見明顯染色體畸變作用;但當(dāng)其水溶液為54 μg/mL時，在DNA水平會對CHL細(xì)胞產(chǎn)生遺傳毒性;并且牛黃解毒片（835、1670、3345 mg/kg）經(jīng)口給藥6周，在小鼠體內(nèi)無明顯遺傳毒性作用[11]。

2 牛黃解毒片配伍對雄黃減毒作用研究

配伍是中藥組方的特色優(yōu)勢，藥性類同者相須相使，發(fā)揮協(xié)同作用，以增強(qiáng)療效;藥性不同者相互制約，解毒降毒，緩和藥性。牛黃解毒片配伍對雄黃具有減毒作用。

一項研究表明牛黃解毒片可以使雄黃引起的小鼠外周血細(xì)胞DNA損傷、骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成率、精子畸變率及肝、腎損傷明顯降低，全方去掉甘草、黃芩和大黃三味中藥后，DNA損傷作用明顯增加，且肝細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞水腫增加，微核形成率、精子畸變率及肝、腎組織結(jié)構(gòu)未見明顯改變[12]。研究者又進(jìn)而發(fā)現(xiàn)抑制雄黃誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡可認(rèn)為是牛黃解毒片配伍減低雄黃肝損傷的分子機(jī)制之一，抑制過程可能是通過促進(jìn)Bcl-2表達(dá)而阻礙Bax表達(dá)來實現(xiàn)的，調(diào)控機(jī)制與甘草、黃芩和大黃三味中藥有關(guān)[13]。

一項研究將血清生化指標(biāo)測定，肝、腎組織病理學(xué)檢查與血清、尿液代謝組學(xué)方法相結(jié)合，系統(tǒng)比較了雄黃和牛黃解毒片對大鼠的肝、腎毒性[14]。血清生化實驗與病理學(xué)檢查結(jié)果顯示雄黃對大鼠肝臟、腎臟造成損傷，而牛黃解毒片組大鼠血清生化指標(biāo)及肝組織和腎組織病理檢查結(jié)果與空白組大鼠無顯著性差異。代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示雄黃組大鼠代謝輪廓與空白組差異顯著，牛黃解毒片組大鼠代謝輪廓向空白組回歸，雄黃造成大鼠的能量代謝、膽堿代謝、氨基酸代謝和腸道微生物代謝等方面的紊亂可在牛黃解毒片配伍后得到明顯改善。另一項研究還發(fā)現(xiàn)牛黃解毒片中牛黃的來源不同（天然牛黃、人工牛黃、體外培育牛黃），對牛黃解毒片配伍降低雄黃肝毒性不產(chǎn)生影響[15]。

3 牛黃解毒片配伍對雄黃可溶性砷及砷形態(tài)的影響

雄黃的主要成分As2S2幾乎不溶于水，在酸性和中性的胃腸道環(huán)境中也不易溶解而從糞便排出，毒性較小或無毒，在胃腸道中被吸收的可溶性砷才可能是引起砷中毒的來源[16-17]，故不宜片面使用總砷含量來評價牛黃解毒片的砷毒性，而且牛黃解毒片全方配伍可降低雄黃可溶性砷的溶出量，從而降低雄黃的砷毒性。

3.1 牛黃解毒片配伍對雄黃可溶性砷的影響

有學(xué)者分別采用石墨爐原子吸收分光光度（GF-AAS）法[18]和二乙基二硫代氨基甲酸銀法（DDC-Ag）[19]建立了雄黃和牛黃解毒片中可溶性砷的測定方法。GF-AAS法測得雄黃的稀鹽酸提取液中可溶性砷的含量為7.821 μg/mL，而不同廠家生產(chǎn)的牛黃解毒片的鹽酸提取液中可溶性砷的含量為0.602～1.144 μg/mL;雄黃的人工胃液提取液中可溶性砷的含量為8.723 μg/mL，牛黃解毒片的人工胃液提取液中可溶性砷的含量為0.915～2.096 μg/mL。DDC-Ag法測定結(jié)果與GF-AAS法無顯著性差異，說明牛黃解毒片配伍可降低雄黃可溶性砷的含量。董菊等[20]同樣發(fā)現(xiàn)經(jīng)人工胃液或人工腸液提取后，牛黃解毒片全方的可溶性砷含量明顯低于雄黃，但牛黃解毒片全方去掉甘草、黃芩和大黃后，其可溶性砷的含量又明顯升高。

另一項研究發(fā)現(xiàn)雄黃與牛黃解毒片處方中其他7味中藥單獨配伍后，可溶性砷含量均有不同程度降低，其中大黃和甘草對雄黃可溶性砷含量的減少最為明顯，分別為84.9%和81.1%，其次為黃芩和石膏，分別為66.3%和60.2%，然后為牛黃和桔梗和冰片，分別為40.9%、39.4%和6.4%[21]。

3.2 牛黃解毒片砷形態(tài)研究

可溶性砷包括亞砷酸鹽（AsⅢ）、砷酸鹽（AsV）等無機(jī)砷，一甲基砷酸鹽（MMA）、二甲基砷酸鹽（DMA）、三甲基氧化砷（TMAO）、砷膽堿（AsC）、砷甜菜堿（AsB）等有機(jī)砷。砷元素不同價態(tài)和形態(tài)間，毒性差異非常大[22-24]。不同價態(tài)和形態(tài)砷的毒性大小為AsⅢ>AsⅤ>MMA>DMA>TMAO>AsC>AsB[25-26]。牛黃解毒片中其他中藥對雄黃不同形態(tài)的可溶性砷的體內(nèi)外過程也會產(chǎn)生影響。

金鵬飛等[27-28]對牛黃解毒片的水提物、人工胃液及人工腸液提取物進(jìn)行砷形態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，各提取物中只檢出AsⅢ、AsV以及微量未知砷形態(tài)，未檢出MMA、DMA、AsC 與AsB等有機(jī)砷形態(tài)，說明牛黃解毒片在水和胃腸液中的溶出砷均以無機(jī)砷形態(tài)為主。另一項研究結(jié)果顯示大鼠口服牛黃解毒片后血清中的砷形態(tài)主要為DMA，另外含有少量的AsB[29]。說明經(jīng)胃腸道吸收的無機(jī)砷形態(tài)，在大鼠體內(nèi)會代謝為毒性相對較低的有機(jī)砷形態(tài)。

研究發(fā)現(xiàn)比格犬分別服用牛黃解毒片和雄黃后，血漿中的主要砷形態(tài)均為DMA，并有少量AsⅤ，并未測得AsⅢ和MMA。而且雄黃經(jīng)牛黃解毒片配伍后，在比格犬體內(nèi)DMA的轉(zhuǎn)化量會增加并且消除加快[30-31]。張云靜等[32]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃牛黃解毒片和雄黃后，血漿中的主要形態(tài)為DMA，且AsⅢ、AsⅤ和MMA在各時間點均未檢測到。牛黃解毒片組大鼠比雄黃組大鼠DMA的清除率和表觀分布容積顯著增加，表明雄黃經(jīng)配伍后，DMA更容易從中央室向周邊室分布，且清除加速。分析原因可能是牛黃解毒片配伍后，使雄黃進(jìn)入體循環(huán)的砷相對量減少。上述研究均表明牛黃解毒片方中其他中藥對雄黃可溶性砷的藥動學(xué)影響可能是降低雄黃毒性的一種途徑。

4 結(jié)語

以總砷的含量來評價牛黃解毒片的砷毒性缺乏科學(xué)性，大量實驗已經(jīng)證實牛黃解毒片配伍對雄黃具有減毒作用，其毒性遠(yuǎn)低于雄黃。雄黃的毒性物質(zhì)為其可溶性砷部分，牛黃解毒片中其他中藥可減少雄黃可溶性砷的溶出以及對不同形態(tài)可溶性砷在動物體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄等過程產(chǎn)生影響。另外，動物實驗數(shù)據(jù)并不能完全代表臨床實際情況。牛黃解毒片的安全性評價及砷毒性的研究還應(yīng)與臨床相結(jié)合，通過大量臨床樣本的測試與臨床數(shù)據(jù)的分析以獲得更加科學(xué)合理的用藥依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ?國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2015：661-662.

[2] ?World Health Organization，United Nations Environment Programme，International Labour Organisation. Environment Health Criteria 18 （Arsenic） [S]. Geneva：WTO，1981.

[3] ?高兵.牛黃解毒片在臨床應(yīng)用中的問題分析[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2017，11（19）：140-141.

[4] ?顧冰.89例牛黃解毒片/丸不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析[J].中國藥物警戒，2016，13（6）：359-363.

[5] ?劉寶生，王少俠.牛黃解毒片在臨床應(yīng)用中的問題分析[J].臨床合理用藥雜志，2014，7（33）：116-117.

[6] ?姜艷，馮雷.我院牛黃解毒片門診處方安全性評價[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（12）：101-102.

[7] ?王利梅.房山區(qū)良鄉(xiāng)醫(yī)院247張牛黃解毒片處方分析[J].北京中醫(yī)藥，2011，30（7）：536-537.

[8] ?杜宏舉，張鵬，寧鈞宇，等.牛黃解毒片多次給藥對大鼠血液系統(tǒng)及主要臟器毒性作用的實驗研究[J].毒理學(xué)雜志，2018，32（3）：233-236.

[9] ?傅麗玲，周宗燦，宮恩聰.牛黃解毒片經(jīng)口對大鼠的急性和14天毒性[J].北京大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，1997，29（6）：546-547.

[10] ?苗加偉，劉曉麗，梁世霞，等.牛黃解毒片、雄黃與其他砷化物急性毒性的比較研究[J].毒理學(xué)雜志，2011，25（3）：217-221.

[11] ?董菊.牛黃解毒片的遺傳毒性研究及其方藥配伍減毒作用初探[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[12] ?董菊，嚴(yán)曉鷹，王明艷，等.牛黃解毒片配伍影響雄黃砷毒性的動物實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2014，25（2）：317-319.

[13] ?董菊，項馨立，王子妤，等.牛黃解毒片配伍對雄黃肝毒性的影響及其與凋亡調(diào)控的關(guān)系[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（24）：79-83.

[14] ?Xu W，Wang H，Chen G，et al. 1H NMR-based metabonomics study on the toxicity alleviation effect of other traditional Chinese medicines in NiuhuangJiedu tablet to realgar （As2S2） [J]. J Ethnopharmacol，2013，148（1）：88-98.

[15] ?湯家銘，顧祖曦，趙源，等.不同來源牛黃與雄黃配伍的牛黃解毒片對小鼠毒性的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2017，23（24）：164-169.

[16] ?王紅芯，韓旭，駱驕陽，等.雄黃及其成方制劑的藥效和毒性研究進(jìn)展[J].中南藥學(xué)，2017，15（4）：467-471.

[17] ?劉芳，曹麗梅，周勤梅，等.淺析牛黃解毒片中砷含量及對其安全性的影響[J].中藥與臨床，2015，6（4）：22-24.

[18] ?肖安菊，尹美珍，喻昕，等.石墨爐原子吸收分光光度法測定雄黃和牛黃解毒片中可溶性砷的含量[J].中國藥房，2011，22（28）：2676-2678.

[19] ?肖安菊，喻昕，尹美珍，等.2種測定雄黃和牛黃解毒片中可溶性砷含量的方法比較[J].中國藥房，2011，22（8）：747-749.

[20] ?董菊，陳輝，吳娟，等.原子熒光光譜法檢測牛黃解毒片及其拆方可溶性砷的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011， 17（18）：77-80.

[21] ?徐智，俞珊珊，黃可龍.牛黃解毒片中不同單味組分對雄黃可溶性砷含量影響的比較研究[J].中國生化藥物雜志，2009，30（2）：121-123.

[22] ?Contreras-Acuna M，García-Barrera T，García-Sevillano MA，et al. Arsenic metabolites in human serum and urine after seafood （Anemonia sulcata） consumption and bioaccessibility assessment using liquid chromatography coupled to inorganic and organic mass spectrometry [J]. Microchem J，2014，112：56-64.

[23] ?Cao Y，Duan J，Guo J，et al. Pharmacokinetic properties of arsenic species after oral administration of Sargassum pallidum extract in rats using an HPLC-HG-AFS method [J]. J Pharmaceut Biomed，2014，96（2）：213-219.

[24] ?顧晶晶，黃珍禎，谷穎敏，等.雄黃可溶性砷和價態(tài)砷與小鼠急性毒性關(guān)系的研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011， 17（8）：230-233.

[25] ?Vega L，Styblo M，Patterson R，et al. Differential effects of trivalent and pentavalent arsenicals on cell proliferation and cytokine secretion in normal human epidermal keratinocytes [J]. Toxicol Appl Pharm，2001，172（3）：225-232.

[26] ?Aposhian HV，Aposhian MM. Arsenic toxicology：five questions [J]. Chem Res Toxicol，2006，19（1）：1-15.

[27] ?金鵬飛，夏路風(fēng)，梁曉麗，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜研究牛黃解毒片在水和胃腸液中溶出砷的形態(tài)[J].中國藥學(xué)雜志，2013，48（24）：2162-2165.

[28] ?Jin P，Liang X，Xia L，et al. Determination of 20 trace elements and arsenic species for a realgar containing traditional Chinese medicine Niuhuang Jiedu tablets by direct inductively coupled plasma-mass spectrometry and high performance liquid chromatography inductively coupled plasma-mass spectrometry [J]. J Trace Elem Med Bio，2016，33：73-80.

[29] ?陳紹占，劉麗萍，杜宏舉，等.高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析經(jīng)牛黃解毒片暴露后大鼠血清中砷形態(tài)[J].質(zhì)譜學(xué)報，2017，38（2）：177-186.

[30] ?強(qiáng)淑萍，張云靜，孫晶，等.比格犬經(jīng)口給予雄黃和牛黃解毒片后血漿中砷化學(xué)態(tài)的研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報，2013，44（2）：141-146.

[31] ?Zhang Y，Qiang S，Sun J，et al. Liquid chromatography-hydride generation-atomic fluorescence spectrometry determination of arsenic species in dog plasma and its application to a pharmacokinetic study after oral administration of Realgar and Niu Huang Jie Du Pian [J]. J Chromatogr B，2013，917-918：93-99.

[32] ?張云靜，強(qiáng)淑萍，宋敏，等.大鼠口服雄黃和牛黃解毒片后血漿中砷形態(tài)的研究[J].藥學(xué)學(xué)報，2016，51（7）：1130-1135.