Twist通過EMT促使結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞獲得干性及化療抵抗能力的作用及機(jī)制研究

鄧君健　張帆　包文庭　熊琳　劉遠(yuǎn)識　 范黎　徐細(xì)明

[摘要] 目的 研究Twist對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、腫瘤干細(xì)胞表型及化療抵抗能力的影響。 方法 收集2012年1～12月武漢大學(xué)人民醫(yī)院結(jié)直腸癌患者臨床樣本共30例，分析Twist在結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)差異;通過過表達(dá)手段，檢測Twist對SW480細(xì)胞的EMT表型轉(zhuǎn)換調(diào)控情況;分析Twist對SW480細(xì)胞的成球能力、干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)、化療抵抗的影響。 結(jié)果 Twist在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P < 0.05）。體外實驗證實Twist可促使SW480細(xì)胞EMT表型轉(zhuǎn)換，表現(xiàn)為Twist促使SW480細(xì)胞形態(tài)變化及上調(diào)間質(zhì)相關(guān)的N-鈣黏蛋白表達(dá)，而顯著抑制上皮相關(guān)的E-鈣黏蛋白表達(dá)（P < 0.05）。Twist上調(diào)SW480細(xì)胞的成球能力及腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi-1、Nanog、CD44的表達(dá)（P < 0.05）;Twist可通過ABCB1/P-gp途徑使SW480細(xì)胞獲得化療藥物抵抗能力。 結(jié)論 Twist可促使結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生EMT、獲得干細(xì)胞特性及耐藥能力，Twist可作為潛在的結(jié)直腸癌化療抵抗治療靶點。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌;Twist;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;腫瘤干細(xì)胞;化療抵抗

[中圖分類號] R735.3 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）06（c）-0004-06

Effect and mechanism of twist promoting stem cell ability obtaining and chemotherapy resistance of colorectal cancer SW480 cells by EMT

DENG Junjian1 ? ZHANG Fan2 ? BAO Wenting1 ? XIONG Lin1 ? LIU Yuanshi1 ? FAN Li1 ? XU Ximing1

1.Tumor Center， Renmin Hospital， Wuhan University， Hubei Province， Wuhan ? 430060， China; 2.Department of Pharmacy， Renmin Hospital， Wuhan University， Hubei Province， Wuhan ? 430060， China

[Abstract] Objective To study the effect of Twist on epithelial-mesenchymal transition （EMT）， cancer stem cell phenotype and chemotherapy resistance of SW480 cells. Methods From January to December 2012， 30 colorectal cancer samples were collected in Renmin Hospital， Wuhan University. And the expression of Twist in colon cancer tissues and adjacent tissues were analyzed; the effect of Twist on SW480 cells EMT phenotype switching was detected through the over expression assay. The role of Twist in SW480 cells mammospheres number， cancer stem cell markers expression and chemotherapy resistance were investigated. Results The expression of Twist in colon cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues （P < 0.05）. Twist could promote EMT phenotype switching， evidenced by the changes in cell morphology， the up-regulation of interstitial-associated N-cadherin expression， and the significant inhibition of epithelial-associated E-cadherin expression （P < 0.05）. Twist increased mammospheres number and the expression of cancer stem cell markers SW480 cells， such as Bmi-1， Nanog， CD44 in （P < 0.05）. Twist could promote SW480 cells to obtain chemotherapy resistance ability through ABCB1/P-gp pathway. Conclusion Twist could promote SW480 cells EMT phenotype switching， stem cell characteristics and chemotherapy resistance ability obtaining， indicating that Twist could serve as a potential target for chemotherapy resistance of colorectal cancer.

[Key words] Colorectal cancer; Twist; Epithelial-mesenchymal transition; Cancer stem cell; Chemotherapy resistant

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是癌細(xì)胞中部分胚胎基因重編程的病理過程，這一過程具有可逆的特點[1-2]。EMT行為導(dǎo)致的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是多種癌細(xì)胞獲得侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的基礎(chǔ)，其中包括了結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）細(xì)胞[3-4]。EMT行為的標(biāo)志是上皮細(xì)胞間連接的溶解及細(xì)胞骨架的整體重組，這一變化是由基因的差異表達(dá)所決定的[5-6]。EMT發(fā)生時，眾多基因表達(dá)重編程[7]。經(jīng)典研究認(rèn)為，EMT變化只增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力，而最新研究提示，腫瘤細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)換，還有促使癌細(xì)胞獲得放化療抵抗、逃避衰老、干性獲得、加速細(xì)胞分裂等能力的功能[8-9]。扭曲因子Twist，是一種具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)了胚胎的發(fā)育[10]。既往研究證實，Twist可調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT行為[11]，然而其在結(jié)直腸癌細(xì)胞中更多的作用，目前尚不明確。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Twist在結(jié)直腸癌患者的病理樣本中，相較于癌旁組織，其在癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。因此，本研究采用結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480作為研究工具，分析Twist對結(jié)直腸癌細(xì)胞多種生物學(xué)行為的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1～12月武漢大學(xué)人民醫(yī)院結(jié)直腸癌患者臨床樣本共30例，患者的納入以臨床手術(shù)后組織切片細(xì)胞學(xué)染色確診結(jié)直腸癌為準(zhǔn)，取遠(yuǎn)離癌組織的正常結(jié)直腸黏膜樣本癌旁組織（距離癌組織5 cm以上）30例作為對照，且納入患者均未接受過任何腫瘤相關(guān)治療的初診患者。本研究已通過武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的審批，參與研究者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 ?研究方法

1.2.1 主要儀器、試劑 ?本研究中的抗體相關(guān)信息如下：E-cadherin一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，N-cadherin一抗、vimentin一抗、Twist一抗、P-gp一抗、α-tubulin一抗購自美國Santa Cruz Biotechnol公司。Bmi-1一抗、Nanog一抗購自美國Epitomics公司。Alexa Fluor 488/594標(biāo)記的二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、DAPI染液及Lipofectamine 2000購自美國 Invitrogen公司。PrimeScript？誖一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RT及熒光定量PCR SYBR染液購自日本TAKARA公司。

1.2.2 組織及細(xì)胞RNA的提取 ?患者樣本組織置于液氮中保存，提取RNA時，將組織置于將研缽液氮中碾成粉末狀，加入Trizol，再以氯仿萃取，隨后吸出上層水相，加入異丙醇沉淀RNA，混勻后4℃低溫過夜。次日，差速離心并依次以75%、95%乙醇洗滌RNA，隨后溶解RNA。細(xì)胞的RNA提取為：向細(xì)胞培養(yǎng)板中加入Trizol，反復(fù)吹打，吸取至EP管，后續(xù)操作同組織的酚氯仿法萃取。

1.2.3 cDNA合成 ?本研究中的cDNA合成，采用日本TAKARA公司的一步法逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒。每次反應(yīng)體系為：RNA 1 μg，總體積20 μL反應(yīng)程序為：37℃ 15 min，85℃ 5 s，降溫至4℃。反應(yīng)完成后，立即將樣本置于-80℃冰箱低溫保存，直至使用。

1.2.4 熒光定量PCR ?本研究中采用TAKARA公司生產(chǎn)的熒光定量PCR mix buffer進(jìn)行定量擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min，隨后進(jìn)行39個循環(huán)擴(kuò)增，包括95℃ 1 min，57℃ 30 s，最后5 min溶解曲線。PCR的結(jié)果采用GAPDH校正，以校正值為統(tǒng)計值。引物信息見表1。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 ?SW480細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞典藏中心，培養(yǎng)條件：DMEM basic培養(yǎng)基，10%胎牛血清。孵箱設(shè)置為5% CO2，37℃。本研究中的過表達(dá)，采用脂質(zhì)體包裹載體轉(zhuǎn)染。實驗前，將細(xì)胞種于6孔板中，細(xì)胞數(shù)量為2×105個，次日將培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基，饑餓2 h后，以Lipofectamine 2000試劑包裹2 μg的空載體pcDNA3.1或是pcDNA3.1-Twist載體，轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，孵箱培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞。

1.2.6 細(xì)胞侵襲檢測 ?細(xì)胞檢測采用Boyden chambers，預(yù)先包被基質(zhì)膠于小室內(nèi)。將300 μL體積內(nèi)的1×105個細(xì)胞（培養(yǎng)基胎牛血清濃度為1%）分別轉(zhuǎn)染后種植于小室上層。隨后將600 μL胎牛血清濃度為10%的培養(yǎng)基加至小室下的孔板內(nèi)，作為趨化劑。細(xì)胞種植48 h后，終止培養(yǎng)，4%的多聚甲醛固定30 min，隨后結(jié)晶紫染色，拍照分析。

1.2.7 Western blot分析 ?細(xì)胞以預(yù)冷的PBS洗滌后，加入RIPA裂解液裂解并置于冰上超聲破碎，再次冰上裂解30 min。12 000 r/min 4℃低溫離心15 min后吸取上清，測定濃度后，加入蛋白loading buffer 100℃煮至蛋白變性，至于-80℃冰箱低溫保存，直至使用。以Bio-rad公司的蛋白電泳系統(tǒng)檢測各組各蛋白表達(dá)差異情況，以SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)運至聚偏二氟乙烯膜，以5%的脫脂牛奶室溫下封閉2 h，加入一抗工作液過夜（濃度為1∶1000）。次日，室溫下復(fù)溫1 h，隨后以TBST洗脫，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液進(jìn)行孵育，依次洗滌，曝光，獲得圖像并分析。

1.2.8 細(xì)胞活力測定 ?細(xì)胞活力的測定采用噻唑藍(lán)比色法（MTT）試劑盒，以細(xì)胞密度為1×104種植于96孔板中后，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并按濃度梯度加入奧沙利鉑（孵育24 h后，PBS洗滌細(xì)胞，加入MTT試劑，于570 nm波長處檢測各組細(xì)胞活力差異情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism Software Version 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間的比較采用One-way ANOVA分析，兩組間比較采用非配對t檢驗;計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扭曲基因Twist在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織

為初步探索Twist在結(jié)直腸癌中的作用，本研究首先通過熒光定量PCR檢測了Twist在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄本存在差異情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，扭曲基因Twist在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），見圖1。提示在結(jié)直腸癌細(xì)胞中可能發(fā)揮癌基因的作用。

2.2 過表達(dá)Twist促使SW480細(xì)胞發(fā)生EMT形態(tài)變化

將Twist在SW480細(xì)胞進(jìn)行過表達(dá)后，SW480細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了急劇變化，由圓形向長梭形態(tài)分化，提示可能發(fā)生了EMT能力的變化。細(xì)胞侵襲能力檢測發(fā)現(xiàn)，Twist可顯著上調(diào)SW480的侵襲能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

2.3 Twist可顯著上調(diào)EMT分子表達(dá)

熒光定量PCR及Western blot檢測EMT相關(guān)分子表達(dá)發(fā)現(xiàn)：Twist可顯著上調(diào)間質(zhì)相關(guān)的N-鈣黏蛋白表達(dá)，顯著抑制上皮相關(guān)的E-鈣黏蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

2.4 Twist可促使SW480細(xì)胞獲得部分干細(xì)胞特性

過表達(dá)Twist后，調(diào)SW480細(xì)胞成球能力顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），且干性分子Bmi-1、Nanog、CD44的表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖4。

2.5 Twist可上調(diào)SW480細(xì)胞化療藥物抵抗的能力

SW480細(xì)胞暴露于梯度濃度的奧沙利鉑（Oxaliplatin）后，聯(lián)合進(jìn)行Twist過表達(dá)，隨后通過MMT試劑盒檢測各組細(xì)胞的活力差異情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Twist可保護(hù)奧沙利鉑對SW480細(xì)胞的殺傷。進(jìn)一步，本研究檢測了腫瘤化療抵抗分子ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCG2、ERCC1、XRCC1、MSH2、TUBB3、POLH、GSTπ及γ-GT1的表達(dá)變化情況，結(jié)果提示Twist可顯著上調(diào)ABCB1的表達(dá)，而對其他分子的表達(dá)變化并無明顯影響。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，Twist可顯著上調(diào)ABCB1編碼的P-gp蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖5。

3 討論

結(jié)直腸癌是臨床常見的腫瘤之一，具有發(fā)病率、死亡率高的特點，其發(fā)病率位居世界第三，死亡率為世界第四[12-14]。結(jié)直腸癌的好發(fā)中位年齡為70歲，且隨著年紀(jì)增長，患病率依次升高[13-14]。既往相關(guān)研究取得了長足進(jìn)展，然而其機(jī)制仍然不明確。當(dāng)前關(guān)于結(jié)直腸癌的治療措施主要集中于傳統(tǒng)手術(shù)切除及放化療，術(shù)后復(fù)發(fā)及放化療抵抗等遠(yuǎn)期不良預(yù)后因素依舊較為常見[15]，腫瘤細(xì)胞放化療抵抗是患者不良預(yù)后產(chǎn)生的主要原因[16-17]。

腫瘤放化療打擊后的異質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生及腫瘤干性獲得的過程中，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組重編程，眾多基因簇表達(dá)失衡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)扭曲基因Twist在癌組織中表達(dá)上調(diào)，扭曲基因Twist是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵分子，提示其可能作為癌基因發(fā)揮作用，為明確其是否也在放化療抵抗中發(fā)揮作用，本研究首先在結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞系中進(jìn)行過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Twist可促使SW480細(xì)胞往侵襲表型轉(zhuǎn)換，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮停忠u能力增強(qiáng)，EMT相關(guān)標(biāo)志物急劇變化。研究表明，腫瘤細(xì)胞往腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)變時，其轉(zhuǎn)錄組重編程，而EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子snail、Twist可驅(qū)動相關(guān)基因表達(dá)，促使其干性獲得[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)Twist在腫瘤組織高表達(dá)，同時Twist可促使EMT轉(zhuǎn)變，snail是EMT的關(guān)鍵分子，那么，Twist是否可以促使SW480細(xì)胞往干細(xì)胞分化，從而獲得抗打擊能力呢？為此，本研究檢測了Twist對SW480細(xì)胞成球能力的影響，細(xì)胞聚聚成球是干細(xì)胞的一大特性，研究發(fā)現(xiàn)，Twist可促使SW480細(xì)胞成球并可以上調(diào)干細(xì)胞標(biāo)志物Bmi-1、Nanog、CD44的表達(dá)。進(jìn)一步，本研究對SW480細(xì)胞進(jìn)行了奧沙利鉑打擊，由結(jié)果可知，隨著奧沙利鉑濃度增加，對照細(xì)胞的活性急劇下調(diào)，而Twist可保護(hù)大部分SW480細(xì)胞存活，提示獲得干性的SW480細(xì)胞對化療藥物的打擊失去了敏感性。隨后研究發(fā)現(xiàn)，該作用是通過ABCB1/P-gp實現(xiàn)的。P-gp是能量依賴性“藥泵”調(diào)節(jié)分子，通過消耗ATP將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物逆濃度泵至細(xì)胞外，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度從而產(chǎn)生耐藥性[21-22]。

綜上所述，Twist可促使結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞發(fā)生EMT表型轉(zhuǎn)換，獲得干細(xì)胞特性，進(jìn)一步通過ABCB1/P-gp途徑，增強(qiáng)其自身耐藥。本研究揭示了新的結(jié)直腸癌化療抵抗作用機(jī)制，提供了潛在的治療靶點。

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