右美托咪定調(diào)控Nrf2/HO-1信號通路對氣腹大鼠肺臟氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用*

閆焱, 佘守章

廣州市第一人民醫(yī)院麻醉科(廣東廣州 510180)

腹腔鏡手術(shù)具有創(chuàng)傷小、住院時間短、并發(fā)癥少、康復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)，手術(shù)過程中常用的氣腹壓力是10～15 mmHg，氣腹時發(fā)生缺血再灌注，導(dǎo)致氧化和抗氧化之間失衡，即氧化應(yīng)激反應(yīng)，是氣腹致器官損傷的重要機(jī)制。與其他器官相比，肺臟處于較高氧濃度下，對于氧化應(yīng)激反應(yīng)尤其敏感，肺臟形成了許多抗氧化防御機(jī)制以減少氧化物和維持肺臟的氧化平衡。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)可促進(jìn)抗氧化基因如血紅素加氧酶-1(HO-1)的轉(zhuǎn)錄，激活的HO-1催化血紅素分解釋放膽綠素，進(jìn)一步降解為具有強(qiáng)大抗氧化能力的膽紅素[1]，因此Nrf2/HO-1在抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)作為腎上腺素能受體激動劑，對α2受體具有高選擇性，用于臨床鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及全麻輔助用藥，可抑制全身炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，對炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病起到保護(hù)作用[2]。2018年3—11月，本研究建立CO2氣腹大鼠模型，探討Dex可否通過調(diào)控Nrf2/ HO-1信號傳導(dǎo)通路，改善氣腹對大鼠肺臟氧化應(yīng)激的損傷。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 鹽酸右美托咪定注射液由江蘇恒瑞醫(yī)藥公司生產(chǎn)；大鼠組織MDA和8-iso PGF2α ELISA檢測試劑盒購自美國Cayman公司；兔抗鼠Nrf2抗體、HO-1抗體、β-actin購自美國 Santa Cruz公司，山羊抗兔二抗購自美國Cell Signaling公司；引物由大連TaKaRa公司合成。

1.2 實驗動物 由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供SD雄性大鼠60只，選取3～4周齡大鼠，體重250～280 g。遵循實驗動物倫理學(xué)，實驗動物統(tǒng)一飼養(yǎng)在動物實驗中心，課題研究通過醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查批準(zhǔn)。將動物置于安靜，自然光的環(huán)境飼養(yǎng)48 h以上，保持動物在恒溫(23℃±3℃)，相對濕度(50±10)%，12 h～12 h晝夜節(jié)律，自然飲水、進(jìn)食。

1.3 氣腹模型建立與分組 大鼠隨機(jī)分為3組(n=20)：對照組(C組)、氣腹組(P組)、右美托咪定組(D組)。參照文獻(xiàn)[3]建立大鼠氣腹模型，經(jīng)大鼠腹腔注射Ketamine 80 mg/kg實施麻醉，根據(jù)需要追加腹腔內(nèi)用藥。大鼠麻醉后，仰臥于手術(shù)臺，由臍下向腹腔內(nèi)插入20號套管針，C組不充入CO2氣體；P組和D組通過氣腹導(dǎo)管連接氣腹機(jī)(Stryker)，以12 mmHg壓力充入CO2氣體2 h。D組于氣腹前30 min腹腔內(nèi)注射Dex 100 μg/kg，C組和P組注射相同容量的0.9%生理鹽水。實驗結(jié)束后，氣腹放氣，將大鼠送返籠中，籠子底部鋪有軟鋸屑，在安靜的環(huán)境中自由喂養(yǎng)。

1.4 實驗樣本獲取與處理 分別在氣腹2 h(T1)、放氣2 h(T2)、放氣6 h(T3)、放氣12 h(T4)各組隨機(jī)選取5只大鼠，分離暴露雙側(cè)肺臟及氣管，取右肺組織用冰生理鹽水漂洗、稱重，置研磨器中，加入1 mL PBS研磨至10%勻漿，離心機(jī)4℃，3 000 r/min離心10 min，取上清分裝，-20℃保存待測。取左肺組織，液氮冷凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 肺組織MDA、8-iso PGF2α水平測定 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肺組織MDA、8-iso PGF2α水平。取步驟1.4制備的10%肺組織勻漿，按照試劑說明步驟測定肺組織MDA和8-iso PGF2α含量。

1.6 Western blot檢測肺組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá) 分離左肺部分肺組織提取蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉膜1 h后加入Nrf2(1∶1 500)、HO-1(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶3 000)，4℃過夜。第2天洗膜后用二抗生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG雜交(1∶5 000)。

1.7 RT-PCR檢測Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá) 取已制備勻漿，用Trizol一步法提取肺臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，作為Real-time PCR擴(kuò)增模板。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參照，Nrf2和HO-1為待測基因。利用Primer 5.0軟件設(shè)計特異引物，序列及擴(kuò)增片段長度[3](表1)，所得靶基因相對定量=2-ΔΔCt。

表1 RT-PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，應(yīng)用完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析。使用重復(fù)測量數(shù)據(jù)多重比較配對的t檢驗法(Bonferroni法)，對組間和組內(nèi)不同觀測時間點(diǎn)進(jìn)行兩兩比較；使用多元方差分析法，對各時點(diǎn)進(jìn)行組間兩兩比較。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dex降低氣腹大鼠肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA和8-iso PGF2α水平的升高 T1時MDA和8-iso PGF2α P組和D組明顯高于C組，且P組高于D組(P<0.01)。T2時測得P組和D組開始下降，P組明顯低于T1，但高于D組和C組(P<0.01)；D組明顯下降，仍高于C組(P<0.01)。至T3，P組和D組呈持續(xù)下降趨勢，低于T2時點(diǎn)，D組已接近C組水平，P組仍高于D組和C組(P<0.01)。T4測得的MDA(F=1.335，P=0.3)和8-iso PGF2α(F=2.111，P=0.164)水平3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2 Dex上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白表達(dá) T1時，P組和D組Nrf2和HO-1的蛋白高于C組，且D組高于P組(P=0.001)；在T2時P組和D組Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)持續(xù)增高，T3表達(dá)有所下降，但是D組仍高于P組和C組(P=0.001)，至T4，D組和P組Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)接近C組，3組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Nrf2：F=0.589，P=0.57；HO-1：F=0.322，P=0.731)。見圖1、表3。

表2 3組各時點(diǎn)MDA、8-iso PGF2α水平比較

表2 3組各時點(diǎn)MDA、8-iso PGF2α水平比較

項目組別T1T2T3T4MDAC組327.1±3.2328.9±4.3327.2±3.1329.5±4.4P組513.2±10.1?421.7±12.7?#352.9±6.5?#▲332.1±4.4#▲D組426.8±18.1?△369.0±4.7?△#332.5±3.8?△#▲327.8±2.8#▲8-isoPGF2αC組83.9±1.982.9±3.683.2±1.781.6±1.8P組178.2±5.2?107.1±5.2?#91.8±2.2?#▲83.9±1.1#▲D組118.3±3.3?△90.8±3.2?△#85.7±2.0?△#83.1±2.1#▲

*與C組同時點(diǎn)比較P<0.01；△與P組同時點(diǎn)比較P<0.01；#組內(nèi)與T1時點(diǎn)比較P<0.01；▲組內(nèi)與T2時點(diǎn)比較P<0.01

A、B:3組Nrf2蛋白表達(dá);C、D:3組HO-1蛋白表達(dá)

2.3 Dex激活Nrf2/HO-1信號通路 以C組肺組織Nrf2 mRNA 為對照樣品，其相對表達(dá)量為1，計算各組肺組織Nrf2 mRNA 的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示P組和D組Nrf2的mRNA表達(dá)在T1增加，高于C組(P=0.001)；Dex可引起表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，D組明顯高于P組(P=0.001)。在T2、T3時，D組Nrf2 mRNA表達(dá)明顯高于P組和C組，T4時已逐漸回復(fù)，3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.6，P=0.115)。HO-1 mRNA表達(dá)趨勢與Nrf2基本是一致的，在氣腹T1、T2和T3，D組HO-1 mRNA表達(dá)明顯高于P組和C組，T4時，3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.0，P=0.088)。見圖2、表4。

表3 3組各時點(diǎn)Nrf2和HO-1蛋白相對表達(dá)量的比較(n=5)

表3 3組各時點(diǎn)Nrf2和HO-1蛋白相對表達(dá)量的比較(n=5)

項目組別T1T2T3T4Nrf2C組0.528±0.0310.526±0.0290.536±0.0360.534±0.023P組0.751±0.027?0.882±0.019?0.974±0.027?0.549±0.032D組1.084±0.048?△1.232±0.033?△1.464±0.038?△0.551±0.053HO-1C組0.644±0.0260.650±0.0390.643±0.0200.634±0.023P組1.062±0.027?1.591±0.029?1.886±0.054?0.648±0.025D組1.408±0.05?△2.218±0.065?△2.831±0.08?△0.651±0.034

*與C組同時點(diǎn)比較P<0.01；△與P組同時點(diǎn)比較P<0.01

A:3組Nrf2 mRNA表達(dá);B:3組HO-1 mRNA表達(dá)

表4 3組各時點(diǎn)Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量的比較(n=5)

表4 3組各時點(diǎn)Nrf2和HO-1 mRNA相對表達(dá)量的比較(n=5)

項目組別T1T2T3T4Nrf2C組1111P組1.322±0.24?1.586±0.42?1.01±0.34?1.00±0.05D組 1.461±0.27?△ 1.834±0.31?△ 1.564±0.27?△1.01±0.05HO-1C組1111P組2.03±0.25?2.35±0.21?1.43±0.23?1.01±0.10D組 2.83±0.23?△ 3.13±0.33?△ 1.87±0.21?△1.01±0.11

*與C組同時點(diǎn)比較P<0.01； △與P組同時點(diǎn)比較P<0.01

3 討論

腹腔鏡手術(shù)時，CO2氣腹導(dǎo)致缺血-再灌注可使機(jī)體產(chǎn)生多種自由基，損害細(xì)胞功能，從而發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。再灌注過程中活性氧(ROS)及其毒性產(chǎn)物大量釋放導(dǎo)致DNA損傷、脂質(zhì)過氧化、線粒體膜和細(xì)胞損害，在生理狀態(tài)下，肺臟的骨髓過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶等途徑都可以產(chǎn)生ROS，因此維持細(xì)胞內(nèi)外氧化和抗氧化平衡是保證肺臟穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。

Dex在藥物研究領(lǐng)域廣泛用于從肺損傷到肺癌等肺臟疾病的治療[4-5]，可減輕缺血再灌注引起的肺臟損傷[6]，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮肺保護(hù)作用，目前日益得到臨床關(guān)注和認(rèn)可[7]。有研究[8]發(fā)現(xiàn)Dex通過抑制ROS的釋放減輕氧化應(yīng)激引起的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，Dex預(yù)處理可降低單肺通氣中MDA水平，增強(qiáng)抗氧化酶活性[9]。本研究建立CO2氣腹大鼠模型，檢測到P組和D組肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)記物MDA和8-iso PGF2α水平明顯高于C組，而D組的水平明顯低于P組，證明Dex在降低CO2氣腹引起的肺臟氧化應(yīng)激損傷中起到重要的作用。我們推斷Dex調(diào)節(jié)超氧化與抗氧化間的平衡，從而保護(hù)氣腹所致肺損傷。

Nrf2是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，對氧化還原反應(yīng)敏感，調(diào)控多種抗氧化蛋白在肺臟的表達(dá)，其調(diào)控的抗氧化物及抗氧化物酶大多位于支氣管和肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和細(xì)胞外環(huán)境[10]，保護(hù)肺臟免受氧化物損傷。氧化應(yīng)激損傷時，Nrf2發(fā)生核移位，與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，激活包括應(yīng)激蛋白——HO-1等抗氧化物酶的轉(zhuǎn)錄。HO-1是Nrf2調(diào)控的下游基因，被認(rèn)為是最強(qiáng)的抗氧化蛋白，Nrf2上調(diào)HO-1表達(dá)，HO-1及其產(chǎn)物通過保護(hù)氧化損傷、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等發(fā)揮保護(hù)作用[11]，Nrf2和HO-1被認(rèn)為是抗氧化防御機(jī)制中關(guān)鍵的調(diào)控因子[12]。在單肺通氣中，Dex能夠增高HO-1表達(dá)，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]。而在脂多糖誘發(fā)肺損傷的大鼠，Dex預(yù)處理可通過激活Nrf2減輕肺臟損傷[13]。本研究結(jié)果，CO2氣腹刺激肺臟Nrf2和HO-1蛋白及mRNA表達(dá)明顯增高，反映肺臟氧化應(yīng)激的發(fā)生，Dex預(yù)處理進(jìn)一步增加氣腹引起的肺臟Nrf2和HO-1表達(dá)增高。因此，Dex在CO2氣腹引起的肺損傷中的抗氧化應(yīng)激作用可通過Nrf2/HO-1信號通路的激活來實現(xiàn)。

綜上所述，Dex可降低CO2氣腹大鼠肺臟氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA和8-iso PGF2α水平，增強(qiáng)肺組織Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。證明CO2氣腹所致肺臟氧化應(yīng)激損傷，Nrf2及其調(diào)控基因HO-1表達(dá)上調(diào)，Dex通過激活Nrf2/HO-1信號通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，對CO2氣腹大鼠產(chǎn)生肺保護(hù)作用。