乳腺癌組織中TCR-ζ 鏈的表達及外周血中CD8+CD28+和CD8+CD28-、CD95表達臨床意義

王艷梅　吳博　艾慶燕　趙豫鳳　楊加周　劉宇宏

[摘要] 目的 分析TCR-ζ鏈在乳腺癌組織中的表達及臨床意義。 方法 收集2015年5月～2017年8月延安大學附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）經(jīng)過手術及病理證實的乳腺癌患者30例（對應腫瘤組織標本，癌旁組織），收集同期來我院體檢及治療健康人群、乳腺纖維腺瘤、乳腺囊性增生病各30例作為對照，采用流式細胞技術對乳腺癌組織、癌旁組織及正常乳腺組織TCR-ζ鏈進行檢測，并且檢測乳腺癌患者血清CD8+CD28+和CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ鏈的表達，分析乳腺癌組織、正常乳腺組織及癌旁組織TCRζ鏈的表達;外周血中各組CD8+CD28+和CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ鏈表達對比及外周血、癌組織中TCRζ鏈表達與乳腺癌病理特征的關系。 結(jié)果 正常乳腺組織、癌旁組織、乳腺癌組織TCR-ζ鏈相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），其中癌旁組織、乳腺組織表達水平均高于正常乳腺組織（P < 0.05）。外周血中CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ鏈等免疫指標在乳腺癌、乳腺纖維腺瘤、乳腺囊性增生病四種類型患者間差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），其中乳腺癌患者血清CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ鏈表達水平高于乳腺纖維腺瘤、乳腺囊性增生病及健康人群相應水平，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;外周血TCR-ζ鏈表達水平與癌原發(fā)灶大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、手術前后及CA125水平關系分析差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結(jié)論 檢測外周血TCR-ζ鏈對乳腺癌患者進行提前篩選、診斷或了解患者病情狀況，其在臨床上是非常有意義的指標。

[關鍵詞] 乳腺癌;TCR-ζ鏈;CD8+CD28+;CD8+CD28-;CD95

[中圖分類號] R737.9? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）06（b）-0097-04

Expression of TCR-ζ chain in breast cancer and the clinical significance of CD8+CD28+ and CD8+CD28- and CD95 expression in peripheral blood

WANG Yanmei1? ?WU Bo1? ?AI Qingyan1? ?ZHAO Yufeng1? ?YANG Jiazhou1? ?LIU Yuhong2

1.Department of Histology and Embryology， Medical College of Yan′an University， Shaanxi Province， Yan′an? 716000， China; 2.Department of Rheumatology and Immunology， Yan′an University Affiliated Hospital， Shaanxi Province， Yan′an? 716000， China

[Abstract] Objective To analyze the expression and clinical significance of TCR-ζ chain in breast cancer tissues. Methods Thirty patients with breast cancer confirmed by surgery and pathology in Affiliated Hospital of Yan′an University （"our hospital" for short） from May 2015 to August 2017 （corresponding to tumor tissue specimens and adjacent tissues） were collected. 30 healthy people， 30 patients with breast fibroadenoma and 30 patients with cystic hyperplasia of breast were examined and treated in our hospital during the same period as control. Flow cytometry was used. TCR-ζ chain was detected in breast cancer tissues， adjacent tissues and normal breast tissues， and the expression of serum CD8+CD28+， CD8+CD28-， CD95， TCR-ζ chain was detected in breast cancer patients. The expression of TCR-ζ chain in breast cancer tissues， normal breast tissues and adjacent tissues was analyzed. CD8+CD28+ and CD8+CD28-， CD95， TCR-ζ chain list in peripheral blood of each group was analyzed. The expression of TCR zeta chain in peripheral blood and cancer tissues was correlated with the pathological characteristics of breast cancer. Results The relative expression of TCR-ζ chain in normal breast tissue， paracancerous tissue and breast cancer tissue was significantly different （P < 0.05）. The expression of CD8+CD28+， CD8+CD28-， CD95， TCR-ζ chain in peripheral blood was higher than that in normal breast tissue （P < 0.05）. There were significant differences among the four types of adenofibroadenoma and cystic hyperplasia of breast （P < 0.05）. The expression levels of CD8+CD28+， CD8+CD28-， CD95， TCR-ζ chain in breast cancer patients were higher than those in breast fibroadenoma， cystic hyperplasia of breast and healthy people （P < 0.05）. The expression of TCR-ζ chain in peripheral blood was significantly correlated with the size of primary tumor， lymph node metastasis， pre-and post-operative levels of CA125 （P < 0.05）. Conclusion TCR-ζ chain in peripheral blood can be used to screen， diagnose and understand the condition of breast cancer patients in advance， which is a very meaningful index in clinical practice.

[Key words] Breast cancer; TCR-ζ chain; CD8+CD28+; CD8+CD28-; CD95

乳腺癌是婦科最為常見的惡性腫瘤之一，流行病學調(diào)查資料顯示，目前該病的發(fā)病率及患病率較高，如果早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，乳腺癌的5年生存率高達90%[1]，因此發(fā)現(xiàn)早期篩檢特異性指標或者診斷指標，詳細了解患者病情及免疫狀態(tài)，對于提高患者治愈率，提高患者生活質(zhì)量至關重要[2-3]。TCR-ζ鏈（T cell receptor -ζ chain，CD247）是一種受體激活的蛋白酪氨酸激酶底物，當受體與配體結(jié)合后，TCR-ζ鏈發(fā)生酪氨酸磷酸化[4]，參與淋巴細胞活化信號的轉(zhuǎn)導，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TCR-ζ鏈表達與功能改變與慢性炎癥和自身免疫性疾病密切相關，主要在T細胞的活化過程中起著作用[5]，具有將受體與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑連接的功能[6]，因此設想通過檢測該指標的定量表達，對于了解患者病情狀況及免疫狀況具有重要意義。本研究通過收集乳腺癌相關標本，分析TCR-ζ鏈在乳腺癌組織中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年5月～2017年8月延安大學附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）經(jīng)過手術及病理證實的乳腺癌患者30例，年齡35～55歲，平均（43.29±3.45）歲，均抽取患者術前和術后外周血5 mL。收集患者腫瘤組織標本30例;收集同期來我院體檢及治療健康人群、乳腺纖維腺瘤、乳腺囊性增生病各30例作為對照?；颊呤杖⊙寮鞍┙M織樣本，對照組經(jīng)過協(xié)議及研究對象同意抽取血清標本及乳腺組織，整個研究通過我院醫(yī)學倫理委員會批準同意。

1.2 儀器與試劑

儀器：流式細胞儀（ACEA NovoCyte）、PCR儀（美國賽默飛世爾Piko系列）、電泳儀;試劑：細胞裂解液（RIPA Lysis Buffer）、FITC標記流式細胞術用抗體、抗鼠1抗、2抗均購自南京建成生物工程所、破膜劑及固定劑購自Epitomics公司、DEPC溶液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Trizol總RNA提取液，逆轉(zhuǎn)錄酶均購自Takara公司、2%瓊脂糖凝膠、SYBR GreenⅠ染料、

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品收集? 正常乳腺組織、癌旁組織、乳腺癌組織均來自同一人，癌旁組織為癌組織3 cm以內(nèi)，正在乳腺組織為癌組織8 cm以外的組織;抽取乳腺癌、乳腺纖維腺瘤、乳腺囊性增生病、健康人群外周血5 mL置于EDTA管中，3000 r/min離心10 min，從-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 外周血中CD3+CD247+細胞含量測定? 取出血樣，3000 r/min離心10 min，收集白細胞層，加入細胞裂解液，混勻后置于4℃冰箱，并且定時混勻;然后1500 r/min離心5 min，再次加入裂解液，混勻;然后PBS緩沖液洗滌兩次，然后1 mL PBS混勻后細胞常規(guī)計數(shù);根據(jù)細胞濃度，取適量體積細胞懸液于流式細胞管中，并且經(jīng)過重懸，按照相關實驗要求加入5 μL抗體，常溫避光孵育后加入100 mL固定液，然后PBS沖洗3次。加入100 μL破膜劑及對應抗體，常溫孵育20 min，3 mL PBS沖洗3次，繼續(xù)離心，取適量的PBS容易重懸后上機檢測。均設置對照組。

1.3.3 乳腺癌組織中TCR-ζ鏈基因的定量? ①RNA提取及cDNA合成：采用Trizol總RNA提取試劑盒，然后逆轉(zhuǎn)錄酶及隨機引物合成母鏈cDNA，按照常規(guī)方法進雙鏈合成。②引物設計：引物委托西安天盾生物科技有限公司設計，TCR-ζ鏈：Forward primer：GAGGCCTACAGTGAGATTGGG（5′-3′），Tm 59.86，GC% 57.44%;Rever seprimer：GACCCTGGTAAAGGCCATCG（5′-3′），Tm 60.46，GC% 60%。β-ation：Forward primer：AGGAGCGCTCAGTGAGGATTG（5′-3′）;Rever seprimer：GGGGACTCCGCGGAAGGTAATCC（5′-3′）。③RT-PCR實時定量：采用SYBR GreenⅠ染料檢測內(nèi)參與目的基因擴增效率一致性。每個標本進行TCR-ζ鏈和內(nèi)參基因檢測，總反應體積為25 μL。PCR條件：95℃，2 min，45循環(huán)（95℃ 15 s、60℃ 1 min、82℃ 1 s），然后以一定速度，變化溫度（95～55℃），并且記錄熒光值。④TCR-ζ鏈定量分析：經(jīng)過β-actin的RT-PCR確定需要合成cDNA的質(zhì)量Ct，基因差異表達的倍數(shù)即為2-ΔΔCt。其中ΔΔCt=ΔCt乳腺癌（初發(fā)）-ΔCt乳腺癌（CR），ΔCt=Ct（總）-Ct（內(nèi)參）。

1.4 研究指標

比較乳腺癌組織、正常乳腺組織及癌旁組織TCR-ζ鏈的表達;外周血中各組CD8+CD28+和CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ鏈表達對比;分析外周血、癌組織中TCR-ζ鏈表達與乳腺癌的關系。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數(shù)資料用百分比表示，比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織TCR-ζ鏈表達比較

經(jīng)過檢測正常乳腺組織、癌旁組織、乳腺癌組織TCR-ζ鏈相對表達量分別為（8.29±3.14）%、（24.84±5.14）%、（18.83±7.89）%，三組間差異有統(tǒng)計學意義（F = 6.783，P < 0.05），其中癌旁組織、乳腺癌組織表達水平均高于正常乳腺組織（P < 0.05），癌旁組織與乳腺組織表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

2.2 外周血中各組免疫指標表達比較

外周血中CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ鏈等免疫指標在乳腺癌、乳腺纖維腺瘤、乳腺囊性增生病四種研究對象間差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），其中乳腺癌患者血清CD8+CD28+、CD8+CD28-、CD95、TCR-ζ鏈表達水平高于乳腺纖維腺瘤、乳腺囊性增生病及健康人群相應水平，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.3 外周血及癌組織TCR-ζ鏈表達與乳腺癌病理特征關系

癌組織TCR-ζ鏈表達水平在癌原發(fā)灶大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及CA125水平差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），外周血TCR-ζ鏈表達水平與癌原發(fā)灶大小、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、手術前后及CA125水平相關分析差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

乳腺癌在全球是一種高發(fā)的惡性腫瘤疾病，近年來我國乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，已成為當前社會的重大公共衛(wèi)生問題，自20世紀90年代全球乳腺癌死亡率呈現(xiàn)出下降趨勢[6];究其原因，一是乳腺癌篩查工作的開展，使早期病例的比例增加;二是乳腺癌綜合治療的開展，提高了療效[7]。乳腺癌已成為療效最佳的實體腫瘤之一，但是對于婦女的危害仍然不容忽視[8]。隨著現(xiàn)在各種診斷技術發(fā)展、生物及免疫學深入，目前乳腺癌治療主要以根治性手術治療為主，但是現(xiàn)在臨床出現(xiàn)生物治療措施，臨床研究治療效果較好[9]。免疫學中CD3T細胞的共受體是一種蛋白質(zhì)復合物，它由4個不同的鏈組成[10]。在哺乳動物中，該復合物含有1個CD3γ鏈、CD3δ鏈和2個CD3ε鏈[11]。這些鏈具有被稱為一個分子副T細胞受體（TCR）和ζ-鏈以產(chǎn)生激活信號的T淋巴細胞，TCR，ζ鏈和CD3分子一起構(gòu)成的T細胞受體復合物[5]，TCR/CD3復合物是T細胞信號傳導的重要結(jié)構(gòu)，TCR/CD3復合物中除了包含TCRα和TCRβ外，構(gòu)成了信號轉(zhuǎn)導序列[12]。這些信號傳導分子中，TCR-ζ鏈是最為重要的跨膜信號轉(zhuǎn)導分子，TCR-ζ鏈是一種跨膜信號蛋白，分子量為16 kD，呈高度保守的結(jié)構(gòu)[13]。

免疫T淋巴細胞與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，研究表明乳腺癌不同期患者CD3+細胞、CD4+細胞、CD4+/CD8+細胞比值明顯下降，而CD8+升高，并且隨著嚴重程度，免疫功能降低，說明T淋巴細胞功能可能受到全面的抑制，并且對于腫瘤的治療和免疫功能的調(diào)節(jié)起到嚴重的副作用，因此臨床對腫瘤患者免疫功能的調(diào)節(jié)，對于患者疾病治療至關重要。有研究發(fā)現(xiàn)，目前在多種實體腫瘤、自身免疫性疾病和白血病中都發(fā)現(xiàn)了TCR-ζ鏈表達下調(diào)或缺失，這種表達的下調(diào)或是缺失可導致機體免疫功能的進一步紊亂[14-15]。TCR-ζ鏈表達的增加又可以促進T細胞的凋亡，自身免疫性疾病中TCR-ζ鏈發(fā)揮重要的作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)TCR-ζ鏈在乳腺癌組織中表達高于正常和癌旁組織，本研究發(fā)現(xiàn)外周血和乳腺癌組織中TCRζ鏈表達水平都上升，但是外周血經(jīng)過與乳腺癌相關病理特點，與癌原發(fā)灶大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術前后及CA125水平有關，可以明顯發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶大、發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移、手術前及CA125>30 kU/L患者TCR-ζ鏈表達水平升高，但是對于癌組織組間表現(xiàn)的不是很明顯，此外對乳腺良性疾?。ㄈ橄倮w維腺瘤、乳腺囊性增生?。㏕CR-ζ鏈表達水平相對健康人升高，但是經(jīng)過統(tǒng)計學分析無意義，說明患者患有乳腺良性疾病患者，免疫系統(tǒng)功能有變化，但是仍然在正常范圍內(nèi)[17-18]。機體抗腫瘤免疫反應是以細胞免疫為主，在應用淋巴細胞免疫檢測方法評價，惡性腫瘤時，往往顯示出患者的免疫狀態(tài)低，但是實際情況是大部分患者可能就在早期出現(xiàn)了免疫功能紊亂等，癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個有機的、有序的過程，考慮到協(xié)T細胞能有效地溶解許多腫瘤細胞[19-20]，鼓舞人們在體內(nèi)模型中開展協(xié)T細胞為基礎的腫瘤免疫治療，但是對未來是一個很好的研究方向。

綜上所述，經(jīng)過檢測外周血TCR-ζ鏈對乳腺癌患者進行提前篩選、診斷及或了解患者病情狀況，但是與其他因子或者蛋白的相關性，還需要更加深層次或者多中心研究。

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