CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-1在血小板輸注無(wú)效患者中的表達(dá)和意義

陳小潔　苑召虎　陽(yáng)雪新　楊惠寬　羅淑蘭

[摘要] 目的 研究CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）在血小板輸注無(wú)效癥（PTR）患者中的表達(dá)和意義。 方法 選取2017年4月～2018年4月廣州市第一人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的重癥再生障礙性貧血（SAA）發(fā)生PTR患者34例作為為研究組。另取選取同期我院收治的SAA未發(fā)生PTR患者44例作為對(duì)照組。分別檢測(cè)并比較兩組患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及血漿TGF-β1表達(dá)水平，并采用受試者工作特征曲線（ROC）分析上述兩項(xiàng)指標(biāo)在PTR中的診斷效能。 結(jié)果 輸注前后研究組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平低于對(duì)照組（P < 0.05），且研究組血漿TGF-β1水平低于對(duì)照組（P < 0.05）。經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、TGF-β1聯(lián)合檢測(cè)診斷PTR的曲線下面積、敏感性、特異性高于上述兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)（P < 0.05）。 結(jié)論 PTR患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及TGF-β1水平均存在明顯低表達(dá)，臨床工作中可通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)上述兩項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)情況，為臨床PTR的防治提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 血小板輸注無(wú)效癥;CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;表達(dá)意義

[中圖分類號(hào)] R457.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）06（a）-0080-04

Expression and significance of CD4+CD25+ regulatory T cells and transforming growth factor-β1 in patients with platelet transfusion refractoriness

CHEN Xiaojie? ?YUAN Zhaohu? ?YANG Xuexin? ?YANG Huikuan? ?LUO Shulan

Department of Blood Transfusion， Guangzhou First People′s Hospital， Guangzhou Province， Guangdong? ?5100180， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of CD4+CD25+ regulatory T cells and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in patients with platelet transfusion refractoriness （PTR）. Methods Thirty-four patients with severe aplastic anemia （SAA） who had PTR from April 2017 to April 2018 in Guangzhou First People′s Hospital （"our hospital" for short） were selected as the study group. Another 44 SAA patients without PTR were selected as the control group. The expression levels of CD4+CD25+ regulatory T cells and plasma TGF-β1 were detected and compared in the two groups， and the diagnostic performance of the two indicators in PTR was analyzed by receiver operating curve （ROC）. Results The expression levels of CD4+CD25+ regulatory T cells in the study group before and after infusion were lower than those in the control group （P < 0.05）， and the plasma TGF-β1 level in the study group was lower than that in the control group （P < 0.05）. According to ROC curve analysis， the area， sensitivity and specificity of CDT+CD25+ regulatory T cells and TGF-β1 combined detection and diagnosis of PTR were higher than those of the above two indicators （P < 0.05）. Conclusion CD4+CD25+ regulatory T cells and TGF-β1 levels in PTR patients are significantly lower than those in control group. The expression of these two indicators can be detected in clinical work， which can provide reference for the prevention and treatment of PTR.

[Key words] Platelet transfusion refractory; CD4+CD25+ regulatory T cells; Transforming growth factor-β1; Significance of expression

血小板輸注可有效治療或預(yù)防由于血小板減少或血小板功能障礙所導(dǎo)致的出血，該治療方式最早于1910年被應(yīng)用于臨床中，目前已得到飛速發(fā)展，是血液系統(tǒng)疾病的重要支持治療手段[1]。然而，隨著近年來(lái)相關(guān)研究的不斷深入，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)多次反復(fù)地使用血小板輸注治療可能會(huì)增加血小板輸注無(wú)效癥（PTR）發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，不僅會(huì)延誤患者病情，加重患者家庭以及社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致血小板資源的浪費(fèi)[2]。迄今為止，導(dǎo)致血小板輸注無(wú)效的具體機(jī)制尚未完全明確，但有學(xué)者[3]認(rèn)為可能涉及遺傳、免疫以及環(huán)境等多種因素，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在維持外周免疫耐受中起著至關(guān)重要的作用，其表達(dá)變化以及免疫抑制功能下降均可能導(dǎo)致了機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的紊亂，進(jìn)一步促進(jìn)了PTR的發(fā)生。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是近年來(lái)所發(fā)現(xiàn)的一類新型的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化功能的TGF-β超家族成員之一，其可在免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮極其重要的作用[4]。本研究通過(guò)探討CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及TGF-β1在PTR患者中的表達(dá)和意義，旨在為臨床診治提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月～2018年4月廣州市第一人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）收治的重癥再生障礙性貧血（SAA）發(fā)生PRT患者34例作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)血象、活檢以及骨髓穿刺等檢查確診為重癥再生障礙性貧血（SAA）;②連續(xù)接受ABO同型血小板輸注2次無(wú)效，血小板計(jì)數(shù)未見(jiàn)明顯提高，臨床出血癥狀未見(jiàn)改善;③年齡≥18歲;④無(wú)臨床病歷資料缺失者;⑤輸注24 h后血小板校正增加值降低者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他血液系統(tǒng)疾病者;②伴有嚴(yán)重感染性疾病或免疫系統(tǒng)疾病者;③無(wú)法正常交流溝通或存在精神疾病者;④伴有惡性腫瘤疾病者;⑤正參與其他研究者。其中男20例，女14例;年齡18～67歲，平均（49.47±5.42）歲;病程2～55個(gè)月，平均（5.34±2.21）個(gè)月。另取同期我院收治的SAA非PTR患者44例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)血象、活檢以及骨髓穿刺等檢查確診為SAA;②年齡≥16歲;③無(wú)臨床病歷資料缺失者;④無(wú)發(fā)生連續(xù)血小板輸注無(wú)效。排除標(biāo)準(zhǔn)：與研究組相同。其中男25例，女19例;年齡23～68歲，平均（50.12±5.37）歲;病程1～58個(gè)月，平均（5.27±2.19）個(gè)月。輸注效果判斷標(biāo)準(zhǔn)：輸注24 h后以患者出血狀況得到明顯改善作為輸注有效，并采用血小板校正增加值（CCI）作為量化判斷依據(jù)，輸注24 h后CCI>7.0×109/L均為有效，否則為無(wú)效;所有輸注時(shí)患者均排除發(fā)熱、感染、脾腫大等影響血小板數(shù)量的因素。所有血小板制品均來(lái)源于廣州血液中心的機(jī)采血小板，每袋機(jī)采血小板容量約250 mL，含血小板數(shù) ≥2.5×1011/L。兩組上述各項(xiàng)指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。所有患者均已同意本研究，并簽署了知情同意書(shū)，且本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 血小板輸注? 所有SAA患者均依照2000年版《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》[5]輸注血小板，根據(jù)患者血小板計(jì)數(shù)（×109/L）和臨床出血癥狀決定是否申請(qǐng)輸注血小板：>50×109/L，一般不需輸注;>（10～50）×109/L，根據(jù)臨床出血情況決定是否輸注;<（5～10）×109/L，立即輸血小板防止出血。血小板輸注治療：所有患者均輸注ABO血型相匹配的單采血小板，每袋約為250～300 mL，每次輸注1 U血小板，輸注前靜脈予以地塞米松5 mg（福州海王福藥制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：20161022，規(guī)格：1 mg/片），預(yù)防輸血反應(yīng)。同時(shí)根據(jù)血小板計(jì)數(shù)以及病情選擇合理的輸注時(shí)機(jī)，避免發(fā)熱時(shí)輸注。

1.2.2 標(biāo)本收集? 對(duì)照組輸注前標(biāo)本來(lái)自患者血小板輸注前的配血標(biāo)本，輸注后標(biāo)本選自血小板輸注24 h后抗凝標(biāo)本;研究組輸注前標(biāo)本來(lái)自發(fā)生PRT當(dāng)次輸注前配血標(biāo)本，研究組輸注后標(biāo)本選自當(dāng)次輸注療效評(píng)估抗凝標(biāo)本。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血漿TGF-β1水平。相關(guān)操作均按照儀器（試劑盒）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 試劑與儀器? CytoFLEX型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman-Coulter公司;TGF-β1試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司（生產(chǎn)批號(hào)：180609）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)情況比較

兩組輸注前后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;但研究組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平低于對(duì)照組（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組血漿TGF-β1水平比較

兩組輸注前后血漿TGF-β1水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;但研究組血漿TGF-β1水平低于對(duì)照組（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、TGF-β1表達(dá)水平診斷PTR的ROC曲線分析

經(jīng)ROC曲線分析可知，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、TGF-β1聯(lián)合檢測(cè)診斷PTR的曲線下面積、敏感性、特異性高于上述兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)（均P < 0.05）。見(jiàn)表3、圖1。

3 討論

PTR主要是指患者在連續(xù)接受2次血小板輸注治療，血小板計(jì)數(shù)仍無(wú)提高[6-8]。隨著近年來(lái)血小板輸注的開(kāi)展日益廣泛，PTR已成為目前臨床亟待解決的難題之一。相關(guān)研究[9-10]表明，PTR的發(fā)生率為30%～70%，血小板表面含有復(fù)雜抗原、人類淋巴細(xì)胞抗原抗體等均是引發(fā)PTR的重要因素。其中反復(fù)多次輸血時(shí)，由于異體間抗原系統(tǒng)的差異，刺激機(jī)體產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)，對(duì)外源性血小板產(chǎn)生抗體，是導(dǎo)致PTR的最重要免疫性因素[11-12]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及TGF-β1均參與了機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)程[13-14]，對(duì)上述指標(biāo)與PTR的關(guān)系進(jìn)行研究，可為臨床PTR的防治提供參考依據(jù)。

TGF-β是一種分布廣泛的免疫調(diào)節(jié)因子，在下調(diào)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和控制自身免疫方面具有重要作用，尤其是在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮抑制效應(yīng)中的作用引起人們的關(guān)注，但結(jié)論不一。目前有關(guān)TGF-β在誘導(dǎo)和維持CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制作用中的觀點(diǎn)矛盾[15-17]：①有些實(shí)驗(yàn)支持TGF-β在誘導(dǎo)和維持CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞免疫抑制效應(yīng)中發(fā)揮不可或缺的作用。②另一些研究則表明CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制功能不依賴于TGF-β的存在。支持前者的依據(jù)是：活化的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)高水平的膜表面TGF-β，通過(guò)與相應(yīng)靶細(xì)胞的TGF-β以細(xì)胞間直接接觸的方式而發(fā)揮抑制效應(yīng);本研究對(duì)這兩個(gè)指標(biāo)實(shí)施監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明輸注前后對(duì)照組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平高于研究組（均P < 0.05），提示PTR患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞存在明顯低表達(dá)。外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的1%～2%，占CD4+T細(xì)胞的5%～10%，在維持機(jī)體外周免疫耐受過(guò)程中起著至關(guān)重要的免疫調(diào)節(jié)作用[18-19]。而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能是通過(guò)影響機(jī)體外周免疫耐受，從而降低血小板輸注的效果，促進(jìn)了PTR的發(fā)生。因此，可通過(guò)相關(guān)干預(yù)措施提高患者體內(nèi)的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平，從而達(dá)到提高血小板輸注治療效果的目的。此外，輸注前后對(duì)照組血漿TGF-β1水平高于研究組（P < 0.05），提示血漿TGF-β1在PTR患者中存在顯著低表達(dá)。TGF-β1可通過(guò)影響基質(zhì)細(xì)胞血小板生成素所誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，尤其是降低促分裂原活化蛋白激酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活化蛋白5以及胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1、2的活性，實(shí)現(xiàn)其抑制聚合細(xì)胞增殖的作用，并通過(guò)對(duì)T細(xì)胞以及單核細(xì)胞所具有的免疫調(diào)節(jié)作用產(chǎn)生不同程度的影響，進(jìn)一步發(fā)揮促進(jìn)機(jī)體免疫耐受恢復(fù)以及減輕血小板破壞的作用[20-22]。而隨著TGF-β1表達(dá)的降低，機(jī)體免疫耐受受損加重，且血小板破壞程度增加，繼而增加了PTR發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)ROC曲線分析可知，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、TGF-β1聯(lián)合檢測(cè)診斷PTR的曲線下面積、敏感性、特異性高于上述兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)。提示了在臨床工作中可聯(lián)合檢測(cè)上述兩項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)情況，從而有利于評(píng)估臨床血小板輸注治療效果，并為PTR的治療提供了新的靶點(diǎn)和思路。

綜上所述，PTR患者體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞以及TGF-β1水平均存在明顯低表達(dá)，聯(lián)合CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與TGF-β1表達(dá)情況，有助于PTR的診斷。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Barnett CL，Mladsi D，Vredenburg M，et al. Cost estimate of platelet transfusion in the United States for patients with chronic liver disease and associated thrombocytopenia undergoing elective procedures [J]. J Med Econ，2018， 21（8）：827-834.

[2]? 王謙明，張曉輝.造血干細(xì)胞移植術(shù)后血小板輸注無(wú)效的診治[J].中華內(nèi)科雜志，2015，54（3）：232-234.

[3]? 胡麗超，王獻(xiàn)春，彭小婉，等.影響患者血小板輸注效果的臨床研究[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)，2016，26（25）：72-73.

[4]? 趙高平，楊卯竹，李姝蓉，等.抗體誘導(dǎo)的移植免疫耐受依賴于B細(xì)胞來(lái)源的TGF-β的調(diào)節(jié)[J].器官移植，2016， 7（3）：171-175.

[5]? 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.臨床輸血技術(shù)規(guī)范[S]. 2000：10.

[6]? 馬艷茹，黃曉軍，莫曉冬，等.艾曲波帕治療異基因造血干細(xì)胞移植后難治性血小板減少的臨床研究[J].中華血液學(xué)雜志，2016，37（12）：1065-1069.

[7]? Tanoue S，Konuma T，Kato S，et al. Platelet Transfusion Refractoriness in Single-Unit Cord Blood Transplantation for Adults： Risk Factors and Clinical Outcomes [J]. Biol Blood Marrow Transplant，2018，24（9）：1873-1880.

[8]? 鄧姝，項(xiàng)靜靜，林圣云，等.利妥昔單抗治療血小板輸注無(wú)效血液病患者療效觀察[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，27（8）：672-674.

[9]? 周燕，李麗蘭，鐘周琳，等.造血干細(xì)胞移植術(shù)后抗-CD36抗體介導(dǎo)的血小板輸注無(wú)效癥和相關(guān)病例的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2018，26（2）：541-546.

[10]? 郭曉楠，朱曉爽，劉大看，等.大劑量單次輸注血小板在激素不敏感型卡梅現(xiàn)象患兒術(shù)前的應(yīng)用[J].中華整形外科雜志，2018，34（5）：356-359.

[11]? 馬光麗，方炳木，曲志剛，等.血液病患者血小板輸注臨床療效及相關(guān)因素分析[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2014，12（10）：1540-1542.

[12]? 彭濤，趙國(guó)華，劉敏，等.影響腫瘤患者血小板輸注效果的多因素分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2012，92（34）：2430-2432.

[13]? Tanaka Y，Matsumoto I，Saito D，et al. Utility of Partial Splenic Embolization Prior to Lung Resection in Patients Demonstrating Platelet Transfusion Refractoriness Due to Hypersplenism [J]. Kyobu Geka，2017，70（13）：1063-1067.

[14]? 劉永蓮，張愛(ài)華，王大朋，等.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞-17相關(guān)免疫因子在砷暴露大鼠外周血中的表達(dá)差異及意義[J].中華地方病學(xué)雜志，2017，36（1）：11-15.

[15]? 杜春紅，黃海濤，苑廣洋，等.血小板輸注無(wú)效患者T、B淋巴細(xì)胞抗原和血小板抗體表達(dá)的研究[J].中華血液學(xué)雜志，2016，37（3）：238-241.

[16]? Yin S，Chen X，Zhang J，et al. The effect of Echinococcus granulosus on spleen cells and TGF-beta expression in? the peripheral blood of BALB/c mice [J]. Parasite Immunol，2017，39（3）.

[17]? Yu HS，Park MK，Kang SA，et al. Culture supernatant of adipose stem cells can ameliorate allergic airway inflammation via recruitment of CD4+CD25+Foxp3 T cells [J]. Stem Cell Res Ther，2017，8（1）：8.

[18]? 周燕，李麗蘭，鐘周琳，等.造血干細(xì)胞移植術(shù)后抗-CD36抗體介導(dǎo)的血小板輸注無(wú)效癥和相關(guān)病例的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2018，26（2）：541-546.

[19]? 高萌，傅云峰，趙國(guó)勝，等.急性淋巴細(xì)胞白血病患兒血小板輸注療效及影響因素分析[J].中國(guó)循證兒科雜志，2017，12（1）：45-48.

[20]? 鄧銀芬，袁紅建，孫善芳，等.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤患者免疫表型的意義[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2017，4（96）：18945-18946.

[21]? 龍旺，石炳毅，肖漓，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞分化和增殖的作用[J].中華器官移植雜志，2017，38（2）：112-115.

[22]? 俞萬(wàn)鈞，姜昊，王華英，等.Th17細(xì)胞/Treg細(xì)胞免疫平衡在慢性氣道炎癥性疾病發(fā)展中的作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)慢性病預(yù)防與控制，2017，25（3）：234-237.

（收稿日期：2018-12-18? 本文編輯：王? ?蕾）