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    p53基因突變在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制及與預(yù)后的相關(guān)性研究

    2019-09-07 01:26:12
    實用癌癥雜志 2019年9期
    關(guān)鍵詞:濾紙生存期基因突變

    熊 輝

    乳腺癌的發(fā)病率和致死率較高,是最為常見的也是對女性健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。這兩年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,臨床上治療癌癥已經(jīng)深入到對于一些基因的的研究,一般情況下我們在臨床上常見的抗癌基因有許多,較為多見的是p53、p21、p27等等。p53基因目前在臨床上被研究的許多,也是與腫瘤最相關(guān)的基因之一,對于p35基因的研究可以進一步說明腫瘤的發(fā)生的機制,有利于臨床對于腫瘤的研究[2]。針對這種問題,本研究選取我院收治的乳腺癌患者120例,探討p53基因突變在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制及與預(yù)后的相關(guān)性。

    1 材料與方法

    1.1 一般資料

    選取2015年1月至2017年1月我院收治的乳腺癌患者120例,均通過病理切片和影像檢查手段予以確診。納入標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)過西醫(yī)和傳統(tǒng)的中醫(yī)診斷予以確診;年齡≥25歲;對本研究治療無相關(guān)禁忌;預(yù)計生存期>3個月;體檢結(jié)果顯示肝功能、腎功能、血糖等生化指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。

    排除標(biāo)準(zhǔn):心臟等臟器嚴(yán)重受損或者患有出血性相關(guān)病癥的病患;處于哺乳妊娠期的女性病患;治療過程中出現(xiàn)感染,尚未得到控制的病患;藥物性過敏體質(zhì)的病患。所選患者,年齡29~53歲之間,平均年齡(32.5±1.2)歲,病程2~5年,平均病程(3.23±0.21)年;按乳腺癌TNM分期,其中Ⅰ期患者35例,Ⅱ期患者30例,Ⅲ期患者27例,Ⅳ期患者28例。所選患者均知情同意本研究,并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.2 方法

    蛋白印跡法測定蛋白表達情況:首先是蛋白變性:向蛋白中按比例加入上樣緩沖液(不要全部蛋白都加),之后放入沸水中煮10 min,冷卻后分裝,放入冰箱保存。制膠:采用蒸餾水、丙烯酰胺、Tris-Hcl、SDS、過硫酸銨、TEMED等原料進行制膠。灌膠:將檢漏的水倒出,用濾紙吸干。倒入適量的分離膠,用水液封(加水時,緩慢地來回加,注意不要將膠沖壞)。靜置30 min左右(當(dāng)水和膠之間有一條折射線時,說明膠已凝了)待膠凝了之后,將上層水倒出,并用吸水紙將水吸干(用marker筆標(biāo)記一下分離膠和濃縮膠的分界)。將濃縮膠沿玻璃板流下以免產(chǎn)生氣泡,將梳子水平插入濃縮膠中,注意不要產(chǎn)生氣泡。將倒在槽里的膠吸出,靜置30 min左右,待膠凝固。再進行上樣:即對所采集的樣品進行分裝標(biāo)記后分別上樣。電泳:電壓為80 V,電流為120 A,跑到濃縮膠分離膠分界處。再繼續(xù)用電壓120 V,電流120 A跑完分離膠。開始進行轉(zhuǎn)膜:把2個海綿墊、6張濾紙泡在轉(zhuǎn)膜液中。將夾子打開,平放在桌面上,在夾子上先鋪1個海綿墊,再鋪3張濾紙,注意濾紙與濾紙之間不要有氣泡。將膠按需要切好,平放在濾紙上,注意不要有氣泡。將PVDF膜剪成和膠一樣大小,放在甲醇中活化。將PVDF膜覆蓋在膠上,不要產(chǎn)生氣泡,再在上面鋪3張濾紙,注意不要有氣泡產(chǎn)生,再鋪上1個海綿墊。將夾子加好,放到轉(zhuǎn)膜儀里,倒入適量的轉(zhuǎn)膜液,蓋上蓋子放到箱子里,在轉(zhuǎn)膜儀周圍加冰。轉(zhuǎn)膜(電壓:300 V,電流:200 mA),一般是2 h 10 min。最后一步是免疫反應(yīng)。脫脂奶粉封閉:5 ml TBST將0.25 g奶粉溶解,搖床1 h。從脫脂奶粉中將膜拿出,用1×TBST洗一下。一抗過夜:過夜后,拿出,用1×TBST搖床洗3次,一次10 min。二抗孵育:用二抗搖床1 h。用1×TBST搖床洗3次,一次10 min。

    PCR方法,具體步驟為:AMV合成cDNA的第一條鏈(康為),首先去除基因組DNA反應(yīng),其次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),第cDNA擴增(生工&康為)。①模板DNA準(zhǔn)備:基因組DNA,反應(yīng)體系中模板濃度推薦范圍1~10 μg/ml;質(zhì)?;蚴删wDNA濃度0.1~1 ng/ml。②引物準(zhǔn)備:引物濃度推薦范圍0.05~1 μmol/l。③在無菌潔凈的PCR管中依次加入溶液。最后PCR瓊脂糖凝膠電泳:取1~10 μl PCR 產(chǎn)物,微量移液器加入到2%的瓊脂糖凝膠樣品孔中,接通電極,使DNA在100 mA,110 V恒壓下向陽極泳動20 min。

    1.3 療效判斷標(biāo)準(zhǔn)

    根據(jù)PCR結(jié)果以及蛋白印跡法結(jié)果判斷p53的表達情況。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 p35基因在不同分期下的突變情況

    經(jīng)過統(tǒng)計分析,120例乳腺癌患者中p53突變80例,突變率為66.67%;p53基因在不同分期下的突變情況不同,在Ⅰ~Ⅱ期 的突變率明顯高于Ⅲ~Ⅳ期(P<0.05),見表1。

    表1 p53基因在不同分期下的突變情況對比(例,%)

    2.2 乳腺癌患者p53基因突變與術(shù)后生存期的關(guān)系

    經(jīng)過統(tǒng)計分析,在乳腺癌患者p53基因突變與術(shù)后生存期的關(guān)系分析中,患者p53基因突變情況與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰陽性有明顯的關(guān)系(χ2=5.332,P<0.05);見表2。

    表2 乳腺癌患者p53基因突變與術(shù)后生存期的關(guān)系/例

    2.3 不同腫塊大小與p53蛋白表達情況比較

    p53蛋白表達的陽性百分率在腫塊>2.5 cm乳腺癌組織中表達率明顯低于腫塊<2.5 cm的乳腺癌組織(P<0.05)。見表3。

    表3 不同腫塊大小與p53蛋白表達情況比較(例,%)

    3 討論

    乳腺癌是一種較為常見的惡性腫瘤,尤其在女性患者的患病率與發(fā)病極高[3]。臨床實踐中,乳腺癌的發(fā)病率和致死率較高,是最為常見的也是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[4]。乳腺癌有著比較明顯的特點,如病患人群的年齡逐漸年輕化;多數(shù)患者確診時已經(jīng)是中晚期,喪失了最佳診療時機。

    隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,目前對于癌癥的治療已經(jīng)從原來的細(xì)胞水平逐漸發(fā)展到分子水平[5],所以對乳腺癌進行分子水平分析是非常必要的。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn),p53基因在人類基因組中是一種抑癌基因,和原癌基因一起在體內(nèi)發(fā)揮著調(diào)控癌基因的表達。這種抑癌基因的主要作用是維持細(xì)胞正常的生長與分裂。當(dāng)細(xì)胞受到外來傷害時會發(fā)生DNA的斷裂,細(xì)胞具有自動修補的能力,在對基因進行修補時p53基因能使細(xì)胞分裂終止在G1/S期,進而對細(xì)胞的無限增殖起到一定的限制作用。如果在機體內(nèi),細(xì)胞的損傷不能夠自行修復(fù),那么則會發(fā)生細(xì)胞無限制的增殖,細(xì)胞會出現(xiàn)程序性死亡,進而使得癌細(xì)胞不能夠持續(xù)增殖,使得機體正常。而在一些情況中,p53基因會出現(xiàn)丟失的現(xiàn)象在增殖調(diào)控過程中,大多發(fā)生在腫瘤的早期。本文研究發(fā)現(xiàn),p53基因發(fā)生突變在第一期與第二期較多。p53基因進行轉(zhuǎn)路與翻譯后表達成為p53蛋白,這種蛋白參與細(xì)胞的分裂周期,其相對分質(zhì)量大約在53000,這也是p53蛋白進行命名的原因。在一般情況下,p53蛋白進行表達之后進行誘導(dǎo)癌基因mdm2表達,MDM2蛋白與p53基因結(jié)合后抑制p53基因表達[6]。所以在一般情況下,p53蛋白在一般人體細(xì)胞與組織中的半衰期都很短,一般表達水平較低。但是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激后或者體內(nèi)癌細(xì)胞發(fā)生活化后,p53蛋白會進行磷酸化,p53/MDM2蛋白間相互作用受影響,p53蛋白積聚,盡管在體內(nèi)發(fā)揮著生物學(xué)作用。p53蛋白阻止細(xì)胞分裂,使之出現(xiàn)G1期的阻滯。本文研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者p53基因突變與術(shù)后生存期的分析中,患者p53基因突變情況與腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰陽性有明顯的關(guān)系(P<0.05);p53蛋白表達的陽性百分率在腫塊>2.5 cm乳腺癌組織中表達率明顯大于腫塊<2.5 cm的乳腺癌組織(P<0.05)。

    在正常人體內(nèi),從出生到長大,體內(nèi)細(xì)胞無時無刻不再發(fā)生著細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡(cell apoptosis)也就是細(xì)胞程序性死亡,它是一種正常的生理現(xiàn)象。它與細(xì)胞壞死有著本質(zhì)的區(qū)別,細(xì)胞壞死是體內(nèi)不正常的病理現(xiàn)象。在形態(tài)學(xué)上進行觀察會發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡的細(xì)胞其染色質(zhì)會出現(xiàn)沉淀的現(xiàn)象,細(xì)胞的體積會縮小,形成凋亡小題后會被吞噬細(xì)胞吞噬。因為在細(xì)胞凋亡過程中不會出現(xiàn)溶酶體的破壞與釋放,所以一般不能出現(xiàn)周圍組織的炎癥反應(yīng)的破壞。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn),p53基因在誘發(fā)細(xì)胞凋亡中起重要作用,有誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞的功能??傮w來說,p53基因的作用主要有三個方面:一是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長周期,是細(xì)胞生長保留在G1期;二是可以對損傷的DNA損傷進行修復(fù);三是參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而p53基因突變后這些功能都不能發(fā)揮。

    綜上所述,p53基因突變發(fā)生在乳腺癌早期,另外p53基因突變可作為乳腺癌治療的預(yù)后指標(biāo),值得臨床上進行推廣與應(yīng)用。

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