Vimentin及E-鈣黏蛋白在早期乳腺癌診斷中的應(yīng)用價(jià)值

郝文濤 張海雁

乳腺癌是女性惡性腫瘤中發(fā)病率最高的1種，占30%[1]。近年來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，包括卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肝癌等[2]，這種表達(dá)性的轉(zhuǎn)化使腫瘤細(xì)胞擺脫了細(xì)胞間的粘附，易于離散，更具有侵襲力，上皮性標(biāo)志蛋白Vimentin和E-鈣黏蛋白被認(rèn)為是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志[3]。因此，本研究擬探討通過(guò)檢測(cè)Vimentin和E-鈣黏蛋白來(lái)早期檢測(cè)乳腺癌的可行性及應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 資料

收集2013年4月至2017年4月來(lái)我院就診的早期乳腺癌患者60例，均經(jīng)觸診、B超檢查及鉬靶檢查確診，并經(jīng)病例確診為早期乳腺癌。經(jīng)確診為TNMⅠ期乳腺癌35例，Ⅱa期乳腺癌25例，年齡26～65歲，平均年齡(48.32±12.42)歲；按部位：外上象限27例，外下象限15例，內(nèi)上象限10例，內(nèi)下象限8例；病理分型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌30例，粘液癌8例，導(dǎo)管內(nèi)癌18例，低分化癌2例，乳腺分泌型癌1例，髓樣癌1例；選擇同期門診就診的良性乳腺疾病患者60例，作為良性對(duì)照組；良性乳腺疾病包括：急性乳腺炎20例，乳腺囊腫14例，單純性乳腺增生12例，囊性乳腺增生10例，其他4例。所有患者均知情同意，并簽署知情同意書。本試驗(yàn)已通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①所有患者均為18～70歲；②均為首發(fā)乳腺癌患者，無(wú)其他惡性腫瘤；③均經(jīng)觸診、B超檢查及鉬靶檢查確診，并經(jīng)病例確診為早期乳腺癌；④無(wú)其他免疫系統(tǒng)疾?。虎轃o(wú)嚴(yán)重的心腦腎疾病及多器官衰竭。⑥均自愿參加本次研究，且簽署知情同意書。

1.3 檢測(cè)儀器及方法

1.3.1 樣本采集 各組患者均在入院時(shí)采集外周血5 ml，4 ℃、3 000 r/min離心5 min后取血清，保存在-80 ℃超低溫冰箱中，等待檢測(cè)。

1.3.2 主要試劑 鼠抗人E鈣黏蛋白單克隆抗體1.5 ml購(gòu)置于北京中衫生物工程公司；Vimentin鼠抗豬單克隆抗體1.5 ml購(gòu)置于福州邁新生物技術(shù)公司。二抗試劑：二步法兔/鼠通用免疫組化試劑盒(100 ml，Dako real EnVision，HRP rabbit/mouse)試劑均保存于4 ℃冰箱保存，使用前按抗體說(shuō)明書稀釋。

1.3.3 方法 免疫組織化學(xué)染色步驟：①將病理蠟塊連續(xù)切成4 μm均勻厚度的切片，置于60 ℃的烤箱中烤30 min后依次放入二甲苯及梯度乙醇中脫蠟；②將切片置于4 ℃冷藏后的枸櫞酸鹽緩沖液中，微波修復(fù)后自然冷卻；③滴加一抗，室溫孵育4 h；④滴加二抗，室溫孵育30 min；⑤滴加新鮮配置的DAB顯色劑于切片上，顯色1～3 min后自來(lái)水沖洗中指顯色；⑥蘇木精復(fù)染3 min，脫水后中性樹膠封片。

1.3.4 結(jié)果判定 采用雙盲法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定E鈣黏蛋白為細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞膜染色，在光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中均有陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，E鈣黏蛋白陽(yáng)性染色呈棕黃色連續(xù)線裝；Vimentin陽(yáng)性染色主要定位于胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。分別在5個(gè)不同高倍視野相同范圍下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞及免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：①陽(yáng)性細(xì)胞率<5%為(-)；②：陽(yáng)性細(xì)胞率在5%～50%之間為(+)；③陽(yáng)性細(xì)胞率在50%～75%為(++)，④陽(yáng)性細(xì)胞率>75%為(+++)。檢測(cè)結(jié)果為(+)、(++)、(+++)則為陽(yáng)性，(-)為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或率進(jìn)行描述，計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)。乳腺癌組織中Vimentin與E-鈣黏蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析采用McNemar分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Vimentin在組織中的表達(dá)

由表1可見(jiàn)，早期乳腺癌組患者Vimentin的表達(dá)陽(yáng)性率高于良性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=62.48，P=0.000)。

表1 兩組患者Vimentin表達(dá)情況(例，%)

2.2 E-鈣黏蛋白在組織中的表達(dá)

由表2可見(jiàn)，早期乳腺癌患者E-鈣黏蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率低于良性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.49，P=0.000)。

表2 兩組E-鈣黏蛋白表達(dá)情況(例，%)

2.3 乳腺癌組織中Vimentin與E-鈣黏蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分析

由表3可見(jiàn)，乳腺癌患者Vimentin檢測(cè)陽(yáng)性率較高，而E-鈣黏蛋白在乳腺癌患者中檢測(cè)陽(yáng)性率較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.55，P=0.000)。

表3 Vimentin與E-鈣黏蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果分析/例

3 討論

乳腺癌是當(dāng)今世界威脅女性健康的第一殺手，女性發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于男性。全球每年約有120萬(wàn)患者檢測(cè)出罹患乳腺癌，給女性的身體和心理造成了永久性的傷害，甚至危害女性的生命安全。但乳腺癌起病隱匿，缺乏早期的典型癥狀，很多患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)到了進(jìn)展期或晚期，65%的患者在查出乳腺癌的時(shí)候已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，即使做了根治性手術(shù)[4]，由于腫瘤組織增生能力強(qiáng)、無(wú)限增殖，并具有強(qiáng)大的侵襲力，也很難從根本上治愈，給預(yù)后帶來(lái)隱患。因此，我們需要找到一些特定的標(biāo)志物，能夠幫助臨床醫(yī)生準(zhǔn)確的判斷，識(shí)別乳腺癌，才能在臨床上真正做到“早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療”。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮通過(guò)一系列的變化獲得了間充質(zhì)細(xì)胞的表型。而在這一變化的過(guò)程中細(xì)胞發(fā)生了極大程度的變化，包括細(xì)胞極性消失，細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞粘附力下降，并且獲得了侵襲、抗凋亡等生物學(xué)特性[5]。整個(gè)Emt過(guò)程的發(fā)展由多種生長(zhǎng)因子及多條信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)共同調(diào)節(jié)。E-鈣黏蛋白便是Snai/E-cadherin信號(hào)通路上1種鈣依賴性細(xì)胞粘附分子[6]。該蛋白如果不能抑制下游調(diào)控分子，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞粘附力降低，使腫瘤細(xì)胞更容易轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)隔部位。目前已有研究表明，E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平下降與多種腫瘤相關(guān)，包括胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、賁門癌、卵巢癌等[7-9]。在本次研究中，我們同時(shí)檢測(cè)了良性乳腺疾病患者于早期乳腺癌患者組織中E-鈣黏蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌患者組織中E-鈣黏蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率低于良性乳腺疾病患者，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).這一研究結(jié)果與鄧淼等[10]的研究一致。馬怡暉等[11]也在研究中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者組織中E-鈣黏蛋白的表達(dá)水平低于正常組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.06)。這一結(jié)果提示我們E-鈣黏蛋白的產(chǎn)生可能是腫瘤發(fā)生和發(fā)展道路上必經(jīng)的一步，通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路使上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程，從而增加了腫瘤組織的侵襲力。

Vimentin也EMT過(guò)程中的1種上調(diào)標(biāo)志物蛋白，目前已經(jīng)有很多報(bào)道研究表明Vimentin的表達(dá)增高與前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、胃癌等有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)在早期乳腺癌患者中Vimentin檢測(cè)陽(yáng)性率高于良性乳腺癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。李裕明等[12]在一項(xiàng)原發(fā)性肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，猜測(cè)可能是Vimentin的表達(dá)增加了癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，而這是通過(guò)降低E-鈣黏蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。周杰等[13]在顱咽管瘤中也發(fā)現(xiàn)了E-鈣黏蛋白的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，Vimentin與E-鈣黏蛋白均與乳腺癌存在密切關(guān)系，對(duì)乳腺癌早期診斷具有一定指示作用。同時(shí)，應(yīng)該更加深入研究乳腺癌EMT發(fā)生機(jī)制，為乳腺癌的分子治療提供更有力的臨床依據(jù)。