RP-HPLC同時(shí)測(cè)定治胃丸中2種有效成分含量

汪 杰，黃祖光，陳煥擂

0 引言

治胃丸是我院院內(nèi)制劑，由陳皮、白芍、枳實(shí)、木香、砂仁、元胡、柴胡、郁金、甘草、木蝴蝶、黃芩、延胡索組成，臨床上主要用于治療各型胃炎、胃潰瘍及十二指腸潰瘍等癥，具有行氣解郁、和胃止痛的功效。方中陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，用于脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多，具有理氣健脾、燥濕化痰的功效[1]。白芍用于腹痛、血虛萎黃、頭暈?zāi)垦５劝Y，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、平抑肝陽的功效[2]。目前，治胃丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中缺少含量測(cè)定項(xiàng)，難以保障臨床用藥的有效性。研究表明，陳皮、白芍的主要活性成分橙皮苷、芍藥苷具有與該復(fù)方制劑功能相關(guān)的藥理活性[3-4]。因此，本研究建立反相高效液相色譜(Reversed-phase high performance liquid chromatogr，RP-HPLC)法同時(shí)檢測(cè)治胃丸中橙皮苷、芍藥苷的含量，旨在為提高其質(zhì)控水平提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 治胃丸(本院制劑，規(guī)格：42 g/瓶)，橙皮苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110721-201316)，芍藥苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110736-201337)，水為重蒸水。乙腈、甲醇、碳酸均來自德國merck公司，其中乙腈為色譜純，甲醇和碳酸為分析純。

1.2 儀器 日本島津LC-20A高效液相色譜儀(日本島津儀器有限公司，儀器配置：LC-20A高壓泵，CTO-20A柱溫箱，DGU-20A5脫氣機(jī)，SPD-M20A 二極管陣列紫外檢測(cè)器，LC-solution色譜工作站)，AEG-220型電子分析天平(日本島津儀器有限公司)，KQ-300型超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司，功率300 W，頻率40 kHz)，Synergi Hydro-RP C18色譜柱(廣州菲羅門科技儀器有限公司，250 mm×4.6 mm，4 μm)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 Synergi Hydro-RP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)，以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%碳酸溶液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序：0～40 min，15%→25%(A%)，85%→75%(B%)，流速：1.0 ml/min，檢測(cè)波長230 nm，進(jìn)樣量10 μl，柱溫35 ℃。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備 精密稱取適量橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成0.2 mg/ml的橙皮苷對(duì)照品溶液(每1 ml溶液含橙皮苷0.2 mg)；另精密稱取適量芍藥苷對(duì)照品，加甲醇制成0.1 mg/ml芍藥苷對(duì)照品溶液(每1 ml溶液含芍藥苷0.1 mg)。

2.3 供試品溶液的制備 取適量治胃丸，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 ml，并稱重。超聲處理30 min，室溫放冷后，再次稱重，用甲醇補(bǔ)重，濾過，去濾過液，過0.45 μm微孔濾膜，供試品溶液制備完成。按處方比例分別稱取除橙皮、芍藥以外的其余藥物，按照治胃丸制作方法分別制作不含橙皮與不含芍藥的丸劑，按照治胃丸供試品溶液制備方式制備出無橙皮對(duì)照品溶液與無芍藥對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取橙皮苷對(duì)照品溶液、芍藥苷對(duì)照品溶液、治胃丸供試品溶液、無橙皮對(duì)照品溶液及無芍藥對(duì)照品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。圖譜顯示，治胃丸供試品溶液色譜圖中橙皮苷、芍藥苷色譜峰保留時(shí)間與橙皮苷、芍藥苷對(duì)照品溶液中基本一致，且無橙皮對(duì)照品溶液與無芍藥對(duì)照品溶液無干擾。見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取上述配制好的橙皮苷對(duì)照品溶液1、3，5、8、10、12 ml分別置入25 ml容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻。稀釋后橙皮苷質(zhì)量濃度分別為：8、24、40、64、80、96 μg/ml；另精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液0.25、1、1.5、2.5、3.5、4 ml，分別置入25 ml容量瓶中，加甲醇稀釋。芍藥苷質(zhì)量濃度分別為：1、4、6、10、14、16 μg/ml。分別精密吸取各對(duì)照品稀釋后溶液10 μl，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定。分別以橙皮苷、芍藥苷峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(線性回歸法)，并計(jì)算回歸方程。結(jié)果橙皮苷質(zhì)量濃度在8.35～83.52 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，芍藥苷質(zhì)量濃度在1.51～15.1 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果(n=6)

圖1 反相高效液相色譜圖

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取橙皮苷對(duì)照品溶液和芍藥苷對(duì)照品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)中色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量10 μl，觀察并記錄橙皮苷、芍藥苷色譜峰的峰面積，并計(jì)算各峰面積的RSD。結(jié)果橙皮苷峰面積的RSD為0.86%，芍藥苷峰面積的RSD為1.8%，顯示儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取治胃丸供試品溶液，分別于0、4、10、12、24 h注入高效液相色譜儀，每次進(jìn)樣量10 μl，按“2.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別記錄橙皮苷、芍藥苷峰面積，并計(jì)算各峰面積的RSD。結(jié)果橙皮苷峰面積的RSD為1.2%，芍藥苷峰面積的RSD為1.5%，顯示治胃丸供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的治胃丸供試品(批號(hào)：170502)共6份，按“2.3”項(xiàng)中供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算治胃丸中橙皮苷、芍藥苷峰面積的RSD。結(jié)果治胃丸中橙皮苷峰面積的RSD為1.4%，芍藥苷峰面積的RSD為1.9%，顯示該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已提前測(cè)定橙皮苷、芍藥苷含量的治胃丸樣本6份，分別研細(xì)，精密稱定細(xì)粉約0.5 g，置具塞錐形瓶中。分別加入適量橙皮苷、芍藥苷對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)中方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)樣分析，分別記錄橙皮苷、芍藥苷色譜峰的峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，該方法準(zhǔn)確度高。見表2。

2.5 樣品測(cè)定 取6個(gè)不同批號(hào)治胃丸供試品，分別按“2.3”項(xiàng)中方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)中色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定各批號(hào)治胃丸供試品中橙皮苷、芍藥苷的含量，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算橙皮苷、芍藥苷的含量。結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)的選擇 橙皮苷是一種黃酮類化合物，有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、祛痰平喘、保護(hù)心血管系統(tǒng)等多種藥理活性[5-6]。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明，橙皮苷可通過促進(jìn)大鼠胃泌素分泌，抑制乙酰膽堿、血管活性腸肽等分泌，促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，是陳皮發(fā)揮促胃腸動(dòng)力的主要藥效成分之一[7]。芍藥苷具有鎮(zhèn)靜、解痙、抗炎、抗應(yīng)激性潰瘍、擴(kuò)張冠脈血管、對(duì)抗急性心肌缺血以及抑制血小板凝聚等多方面的作用，是白芍柔肝解郁功效的主要有效成分之一[8-9]。研究表明，在胃痛、咳嗽等病癥處方中常采用陳皮與白芍、枳殼等配伍發(fā)揮藥效協(xié)同作用[10-11]。因此，選取橙皮苷和芍藥苷作為治胃丸質(zhì)量控制的檢測(cè)指標(biāo)。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

3.2 供試品溶液制備條件考察 本研究在樣品提取過程中分別考察了甲醇、水、乙醇、50%乙醇和70%甲醇等溶劑對(duì)提取率的影響，結(jié)果甲醇提取率高，效果最好。同時(shí)比較了回流提取和超聲提取2種提取方法，結(jié)果超聲提取操作簡(jiǎn)便，提取效果最佳。因此最終確定以甲醇為提取溶劑進(jìn)行超聲處理30 min，提取完全且提取液易處理。

3.3 色譜條件考察 本研究在實(shí)驗(yàn)過程中參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道分別考察了甲醇-0.5%冰醋酸水溶液(64∶36)[12]、乙腈-水(20∶80)[13]、甲醇(A)-0.2%磷酸水溶液(B)[14]等流動(dòng)相系統(tǒng)的梯度洗脫效果，結(jié)果分離度均達(dá)不到要求。而采用乙腈-0.1%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫[15]，橙皮苷和芍藥苷的色譜峰拖尾因子(T)均符合要求，能明顯改善待測(cè)色譜峰的分離度。此外，本文還考察了多種型號(hào)的反相硅膠色譜柱，結(jié)果采用Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm)柱干擾峰少，取得了良好的分離效果。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果分析 本研究按照上述試驗(yàn)條件檢測(cè)了不同批號(hào)治胃丸樣品中橙皮苷、芍藥苷的含量，結(jié)果橙皮苷平均含量5.6 mg/g，芍藥苷平均含量1.6 mg/g，且各批號(hào)樣品之間差異不明顯。因此，筆者建議將橙皮苷、芍藥苷的含量測(cè)定限度規(guī)定為每1 g治胃丸中橙皮苷、芍藥苷的含量分別不低于4.5 mg/g、1.3 mg/g(下浮20%)。

綜上所述，本研究建立的RP-HPLC方法操作簡(jiǎn)便、快速，重復(fù)性好，可作為治胃丸的定量檢測(cè)方法?？紤]到治胃丸處方中藥味眾多，今后還應(yīng)建立其他成分含量測(cè)定的方法，以進(jìn)一步提高、完善治胃丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保藥品質(zhì)量穩(wěn)定可控。