釀造條件對釀酒酵母發(fā)酵香氣的影響

祝 霞，劉 琦，趙丹丹，王璐璐，韓舜愈，楊學山,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

葡萄酒釀造是以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主導的一系列復雜的微生物代謝和生物轉(zhuǎn)化過程，同時還伴隨有醇類、酯類、酸類等多種揮發(fā)性香氣化合物生成[1-3]，它們的種類、濃度、閾值以及相互作用共同決定著葡萄酒的風格與特色[2]。在發(fā)酵過程中，釀酒酵母菌株的種類及接種量[3]、浸漬過程[4]、釀造條件[5]、營養(yǎng)成分[6]等均可影響葡萄酒發(fā)酵香氣化合物的產(chǎn)生。研究表明，使用不同釀酒酵母釀造的葡萄酒，其香氣特點差異較大。李景明等[7]比較了3 種釀酒酵母發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒香氣成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D254酵母菌株產(chǎn)醇能力較強，CSM酵母菌株產(chǎn)酯能力較強，并且不同釀酒酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)生的香氣物質(zhì)種類大致相同，但含量差異較大。Carrau等[3]分析了釀酒酵母接種量對發(fā)酵香氣的影響情況，結(jié)果表明，當釀酒酵母接種量為105CFU/L時，酯類、單萜類含量增加，高級醇和中鏈脂肪酸含量減少。氮源作為微生物重要的營養(yǎng)成分，其含量高低直接影響細胞的代謝過程，進而影響釀酒酵母菌株的產(chǎn)香性能。側(cè)鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶[8]、醇?；D(zhuǎn)移酶[9]、醛脫氫酶[10]直接參與釀酒酵母發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)的合成，其中側(cè)鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶與醇類香氣物質(zhì)的形成有關(guān)，醇酰基轉(zhuǎn)移酶參與乙酯類物質(zhì)的合成調(diào)控，醛脫氫酶主要參與脂肪酸的合成，它們的酶活性都與氮源濃度密切相關(guān)。發(fā)酵溫度主要影響釀酒酵母生長與代謝產(chǎn)物的生成。Molina等[11]在研究發(fā)酵溫度對釀酒酵母產(chǎn)香影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，低溫有利于酯類香氣的產(chǎn)生，但發(fā)酵溫度對高級醇的影響較為復雜。葡萄酒釀造過程以及發(fā)酵結(jié)束后常以偏重亞硫酸鹽的形式添加SO2，其主要作用是抑制雜菌生長和抗氧化作用，現(xiàn)有研究指出，添加SO2也會對發(fā)酵香氣產(chǎn)生一定影響。Sun Yumei等[12]研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵過程中SO2添加量的增加，2-苯乙醇和異丁醇的濃度增加，正丙醇、乙酸異戊酯和乳酸乙酯的濃度減少。此外，SO2的存在還可以使葡萄酒發(fā)酵過程中氨基酸、VC以及其他營養(yǎng)物質(zhì)更多的保留，但過量的SO2會導致酵母產(chǎn)生雙乙酰等有害物質(zhì)產(chǎn)生，這會嚴重影響葡萄酒質(zhì)量[13]。目前關(guān)于不同發(fā)酵因素對葡萄酒香氣品質(zhì)研究的報道較多，但進行不同釀造條件對不同種類發(fā)酵香氣綜合變化規(guī)律的研究較少。

本實驗利用葡萄汁模擬體系，接種5 株國產(chǎn)本土釀酒酵母菌株CY3079、LA-FR、LA-RA、MST和OFC進行發(fā)酵實驗，通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對5 種釀酒酵母菌株產(chǎn)香特性進行比較，從而優(yōu)選得到1 株產(chǎn)香性能良好的酵母，并進一步研究氮源質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量4 個因素對該酵母菌株發(fā)酵香氣的影響，揭示不同條件下各類香氣組分的合成規(guī)律，以期為葡萄酒香氣風味調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌株CY3079、LA-FR、LA-RA、MST、OFC均由上海鼎唐國際貿(mào)易有限公司提供。

α-萜品醇、β-香茅醇、香葉醇、里那醇、(Z)-橙花叔醇、β-大馬士酮、乙酸異戊酯、乙酸乙酯、己酸甲酯、癸酸乙酯、戊醇、己醇、橙花醇、苯乙醇、金合歡醇（均為色譜純），2-辛醇（內(nèi)標物）標準品 美國Sigma公司；磷酸氫二銨、酒石酸氫鉀、檸檬酸、酒石酸，氫氧化鈉、偏重亞硫酸鈉、氯化鈉（均為分析純）天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150-II生化培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械有限公司；TRACE 1310-ISQ GC-MS儀、ISQ型單四極桿質(zhì)譜儀美國Thermo Scientific公司；SPME裝置、萃取頭美國Supelco公司；PHS-3C pH計 上海雷磁有限責任公司；PAL-2數(shù)顯手持糖度計 日本ATAGO公司。

1.3 方法

1.3.1 模擬汁配制

為排除葡萄果實中品種香氣等香氣前體物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響，本實驗利用模擬葡萄汁研究不同發(fā)酵因素對發(fā)酵香氣的影響規(guī)律。模擬汁配方[14]：葡萄糖200 g/L、纖維二糖0.2 g/L；氮源：磷酸氫二銨1.5 g/L；酸：酒石酸氫鉀2.5 g/L、L-蘋果酸3.0 g/L、檸檬酸0.2 g/L；礦物質(zhì)：磷酸氫二鉀1.14 g/L、硫酸鎂1.23 g/L。

1.3.2 釀酒酵母活化與模擬汁發(fā)酵

將釀酒酵母干粉溶于10 倍體積蒸餾水中，37 ℃靜置20 min，再加入等體積的模擬葡萄汁28 ℃活化25 min，按推薦用量（0.2 g/L）將活化好的釀酒酵母菌株接種到模擬葡萄汁中，最后轉(zhuǎn)移至28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進行發(fā)酵，待乙醇發(fā)酵結(jié)束后取樣檢測。

1.3.3 揮發(fā)性香氣成分萃取與分析檢測

參照魯榕榕等[15]的方法并略作修改，具體操作如下：

香氣成分的萃取：取8 mL待測酒樣于15 mL頂空瓶中，加入2.4 g氯化鈉和10 μL內(nèi)標物（質(zhì)量濃度7.25 mg/L），加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封并搖勻，再置于恒溫磁力攪拌器中，40 ℃水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。

G C-M S分析條件：D B-WA X毛細管色譜柱（60 m×2.5 mm，0.25 μm）；升溫程序：初溫50 ℃保持5 min，再以3.0 ℃/min升溫至200 ℃，保持15 min，高純氦氣（He）流速1 mL/min；進樣口溫度240 ℃，不分流進樣；MS接口溫度280 ℃；電子電離源；離子源能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z20～350。

定性與定量：在質(zhì)譜全離子掃描模式下，采用保留指數(shù)和NIST-11、Wiley及香精香料譜庫檢索比對進行定性分析。對已有標準品的化合物，利用標準曲線（R2＞0.995）定量，無標準品的化合物采用化學結(jié)構(gòu)、官能團相似、碳原子數(shù)相近的標準物質(zhì)進行半定量。

1.3.4 釀酒酵母菌株產(chǎn)香性能比較

將5 株釀酒酵母（CY3079、LA-FR、LA-RA、MST、OFC）按0.2 g/L接種量分別接種于不同三角瓶內(nèi)，28 ℃恒溫培養(yǎng)發(fā)酵，待乙醇發(fā)酵結(jié)束后進行香氣成分檢測，設(shè)置3 次重復實驗。

1.3.5 發(fā)酵條件對釀酒酵母菌株產(chǎn)香性能的影響

4 個發(fā)酵因素的研究采用控制變量法，即待研究因素按表1水平進行變化，其他因素均取表1中的中間水平，實驗設(shè)置3 次重復。其中1.0、1.5、2.0 g/L磷酸氫二銨相當于212.13、318.19、424.26 mg/L（以N計）。模擬汁的pH值用酒石酸與氫氧化鈉進行調(diào)節(jié)，SO2添加量用偏重亞硫酸鈉調(diào)節(jié)。

表1 發(fā)酵條件對釀酒酵母菌株產(chǎn)香性能的影響Table 1 Effects of different fermentation conditions on aromaproducing performance of S. cerevisiae strains

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

利用Microsoft Office Excel 2010對實驗所得數(shù)據(jù)進行基本處理和作圖，使用IBM SPSS Statistics 19.0進行Duncan法多因素方差分析（P＜0.05，差異顯著）、多元回歸分析，并對香氣數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA），香氣物質(zhì)含量結(jié)果均以 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同釀酒酵母菌株產(chǎn)香性能比較結(jié)果

利用SPME-GC-MS對5 種釀酒酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)生的香氣物質(zhì)進行分析，實驗共檢測到65 種香氣物質(zhì)，其中醇類16 種、酯類22 種、酸類13 種、萜烯類9 種以及其他類5 種。由圖1可知，CY3079酵母菌株共檢出45 種香氣成分，LA-FR酵母檢出47 種，LA-RA、MST和OFC酵母分別檢出43、40 種和42 種。CY3079、OFC、MST酵母產(chǎn)高級醇的種類相對較多，并且MST酵母菌株的高級醇產(chǎn)量最高為512.954 μg/L。LA-FR酵母菌株的高級酯產(chǎn)量為344.664 μg/L，是MST和OFC酵母菌株的6.65 倍和3.83 倍。LA-FR酵母產(chǎn)萜烯能力最強，萜烯類產(chǎn)量為83.453 μg/L，明顯高于其他4 株酵母。發(fā)酵液中的揮發(fā)酸和其他類香氣物質(zhì)含量相對較少，并且在5 種釀酒酵母間無顯著性差異。氣味活性值（odor activity value，OAV）是評價單一香氣化合物對整體香氣的貢獻程度[16]，因本實驗選用模擬葡萄汁進行發(fā)酵，不存在葡萄中的香氣前體物質(zhì)，最終發(fā)酵產(chǎn)生的香氣物質(zhì)含量遠低于正常葡萄酒，OAV大于1的香氣物質(zhì)較少，因而本實驗統(tǒng)計了OAV大于0.1的香氣物質(zhì)共9 種，LA-FR酵母產(chǎn)生的OAV大于0.1的香氣化合物最多，為8 種，LA-RA酵母5 種，CY3079酵母3 種。

圖1 釀酒酵母菌株產(chǎn)香特性比較Fig. 1 Comparison of aroma production characteristics of different S. cerevisiae strains

由于發(fā)酵香氣成分復雜，為直觀體現(xiàn)5 株釀酒酵母產(chǎn)香特點，故進行PCA，以特征值為1進行因子抽提，前2 個主成分累計方差貢獻率為96.895%，PC1和PC2貢獻率分別為82.544%和14.351%，基本能反映原數(shù)據(jù)的變異信息。如圖2所示，PC1主要反映了B7（棕櫚酸乙酯）、B5（癸酸乙酯）、D5（α-法尼烯）、D6（香葉醇）等花香、水果香味比較濃郁的香氣物質(zhì)信息，A7（苯乙醇）和B8（乙酸苯乙酯）則與PC1高度負相關(guān)。PC2主要反映A8（十六醇）、E3（2-壬酮）等帶有脂肪味的香氣物質(zhì)信息，D7（金合歡基乙醛）和A11（正庚醇）與PC2呈高度負相關(guān)。由圖3可知，根據(jù)這5 種酵母發(fā)酵特性可將其聚為3 類，其中LA-RA在PC1和PC2上的得分均較高，這主要代表葡萄酒中一些重要的酯類和萜烯類香氣物質(zhì)信息，如B5（癸酸乙酯）、B14（乙酸異戊酯）、B7（棕櫚酸乙酯）、D5（α-法尼烯）、D6（香葉醇）等。OFC和MST酵母在PC1和PC2上的得分均較低，說明這類酵母產(chǎn)香能力較差，不適合高品質(zhì)葡萄酒的釀造。LA-RA和CY3079酵母PC1得分較低，PC2得分較高，這一區(qū)域主要反映了一些醇類、酸類物質(zhì)的信息，如A11（正庚醇）、C13（異丁酸）、C11（月桂酸），因而使用這類酵母釀的酒可能存在香氣品質(zhì)單一、乙醇體積分數(shù)高等缺點。相比之下，LA-RA酵母產(chǎn)香性能優(yōu)于其他4 株酵母，并且產(chǎn)酯類、萜烯類物質(zhì)能力最強，因此選擇該菌株研究不同釀造條件下發(fā)酵香氣的變化規(guī)律。

圖2 香氣化合物PCA的因子載荷圖Fig. 2 Loading plot of PCA for aroma compounds

圖3 釀酒酵母菌株發(fā)酵香氣PCA分布圖Fig. 3 PCA score plot of PC1 versus PC2 for aroma distribution of different strains of S. cerevisiae

2.2 釀造條件對LA-FR酵母菌株產(chǎn)香性能的影響

2.2.1 不同釀造條件下LA-FR酵母菌株發(fā)酵香氣檢測結(jié)果

發(fā)酵香氣主要是乙醇發(fā)酵過程中由酵母代謝合成的香氣化合物，本實驗利用SPME-GC-MS檢測了氮源、發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量4 個發(fā)酵因素的不同水平下模擬汁中的香氣物質(zhì)，結(jié)果如表2所示。實驗共檢出65 種香氣化合物，其中醇類15 種，酯類23 種，酸類、萜烯及其他類分別為13、8、6 種。各發(fā)酵條件下香氣物質(zhì)種類變化不大，但各類香氣物質(zhì)含量存在顯著差異。葡萄酒發(fā)酵所需的最低氮含量為150 mg/L（相當于0.71 g/L磷酸氫二銨），氮含量過低會導致酵母生長緩慢，發(fā)酵遲緩或停滯，若氮含量超過500 mg/L（相當于2.36 g/L磷酸氫二銨）會導致危害健康的生物胺、氨基甲酸乙酯等產(chǎn)生[17]。由表2和圖4A可知，當?shù)促|(zhì)量濃度從1.0 g/L增加到2.0 g/L時，高級醇含量降低了31.46%，其中直鏈高級醇含量減少41.76%，但由Ehrlich途徑合成支鏈高級醇如異丁醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-2-丁醇含量均有明顯增加；酯類含量與氮源質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，當?shù)促|(zhì)量濃度為2.0 g/L時，酯類物質(zhì)質(zhì)量濃度為472.891 μg/L，相比1.0 g/L氮源時增加了72.92%，其中乙酸酯和乙基酯分別增加291.59%和62.49%。隨著氮源質(zhì)量濃度的升高，萜烯含量降低42.56%，其中芳樟醇和反式-橙花叔醇含量降低最明顯，分別降低85.00%和31.38%，因此較低的氮源質(zhì)量濃度發(fā)酵有利于高級酯等果香香氣物質(zhì)的積累。

通常認為，低溫發(fā)酵有利于香氣化合物的積累，能降低發(fā)酵速率，延長發(fā)酵時間，可產(chǎn)生更多復雜的香氣組分，但溫度過低，有可能導致發(fā)酵停滯等風險[18]。由表2和圖4B可知，當發(fā)酵溫度升高時，香氣總量逐漸下降，其中酯類、萜烯類含量下降明顯，酸類含量顯著增加。發(fā)酵溫度從18 ℃升高到28 ℃，醇類物質(zhì)總量先升高后降低，其中苯乙醇含量降低，1-己醇等六碳醇含量先增后降，其他直鏈高級醇和支鏈高級醇含量均有不同程度的增加；酯類物質(zhì)含量下降58.66%，其中乙基酯和其他酯分別下降68.44%和91.89%，但乙酸酯含量增加了43.13%，如異戊酸乙酯、2-甲基己酸乙酯等均顯著降低，而乙酸苯乙酯含量有明顯的上升趨勢。較低的發(fā)酵溫度有利于萜烯類物質(zhì)的積累，隨著發(fā)酵溫度的升高，萜烯化合物含量降低66.19%，其中芳樟醇與α-法尼烯含量下降明顯。當發(fā)酵溫度升高到28 ℃時，酸類物質(zhì)含量明顯升高，如癸酸、2-甲基丁酸、異丁酸含量分別增加8.72、2.19、1.17 倍，酸類物質(zhì)大量積累會破壞葡萄酒的平衡、降低酒的品質(zhì)，因此較低溫度發(fā)酵有助于提升脂類、萜烯類香氣物質(zhì)含量，但不利于醇類、酸類物質(zhì)的積累。

表2 不同發(fā)酵條件下?lián)]發(fā)性香氣化合物GC-MS分析Table 2 GC-MS analysis of volatile aroma compounds produced under different fermentation conditions

續(xù)表2

圖4 發(fā)酵條件對發(fā)酵香氣含量的影響Fig. 4 Effect of different fermentation conditions on aroma production

如表2和圖4C所示，模擬汁的pH值由3.2升高到3.8的過程中，高級醇和酸類含量降低，酯類和萜烯類香氣化合物含量升高，高級醇含量減少30.24%，其中直鏈高級醇、硫醇含量顯著下降，但實驗中還發(fā)現(xiàn)部分支鏈高級醇含量有小幅度的增加，如異丁醇、2-甲基-1-丙醇；酯類、萜烯類含量分別增加19.50%和67.43%，其中乙酸酯和其他酯含量顯著增加，分別增加56.76%和48.96%。此外當pH值為3.8時，發(fā)酵產(chǎn)生的酸類物質(zhì)減少34.16%。降低模擬汁的酸度不僅能增加帶有果香、花香味的高級酯和萜烯類香氣物質(zhì)的含量，還能減少酸類物質(zhì)積累所引起的異味，因此降低酸度對發(fā)酵香氣的改善意義重大。

SO2是葡萄酒中常用的抑菌劑，常以亞硫酸鹽的形式被添加[19]。由表2和圖4D可知，當SO2添加量從30 mg/L增加到70 mg/L時，高級醇含量升高5.82%，其中支鏈高級醇增加34.21%，但直鏈高級醇含量下降14.50%；隨著SO2添加量的增加，絕大部分酯類物質(zhì)含量均有不同程度的增加，其中乙酸酯含量顯著增加，乙基酯和其他酯含量增幅較?。凰犷惡洼葡╊惡糠謩e降低47.41%和55.75%。隨著SO2添加量升高，叔十六硫醇和3-甲硫基丙醇這類對葡萄酒香氣有負面影響的硫化物含量明顯增加。高濃度的SO2對酵母細胞具有毒害作用，抑制酵母生長，并且SO2對人體健康也有一定的影響，因此在葡萄酒釀造過程中應(yīng)合理減少SO2的用量，提高葡萄酒的安全性。

2.2.2 發(fā)酵條件對發(fā)酵香氣影響的多元回歸分析

由于不同發(fā)酵因素對各類香氣影響作用不同，并且各影響因素的量綱也不相同，因而不能直接比較各因素對香氣影響力的大小，故對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，再通過SPSS多元回歸分析求得標準回歸系數(shù)，其絕對值的大小直接反映了該因素對香氣的影響程度，正值表示該因素能增加香氣物質(zhì)積累，負值則表示不利于香氣物質(zhì)合成。

表3 各發(fā)酵因素的標準回歸系數(shù)Table 3 Standard regression coefficients for aroma compounds versusfermentation conditions

由表3可知，氮源質(zhì)量濃度對醇類和酯類香氣物質(zhì)含量影響最大，并且氮源質(zhì)量濃度越高，醇類物質(zhì)含量越低，酯類物質(zhì)含量越高，因此增加氮源質(zhì)量濃度可提高模擬汁中酯類香氣含量，但會降低醇類物質(zhì)含量；發(fā)酵溫度對酸類物質(zhì)影響最大，隨著發(fā)酵溫度升高，酸類物質(zhì)生成增多，因此發(fā)酵過程中可通過控制溫度來避免因酸類物質(zhì)大量積累而引起的香氣品質(zhì)降低；發(fā)酵過程中SO2添加量對萜烯類香氣含量影響最大，其表現(xiàn)為抑制萜烯類物質(zhì)的積累，因此控制好SO2添加量對發(fā)酵過程中萜烯類香氣物質(zhì)調(diào)控具有重要意義。

3 討 論

釀酒酵母菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣物質(zhì)種類繁雜，其中高級醇是發(fā)酵香氣中含量最高的組分，主要由Ehrlich途徑合成大量支鏈高級醇[20]，但Ehrlich途徑并非發(fā)酵過程中高級醇的唯一合成通路，少量直鏈高級醇是經(jīng)酵母體內(nèi)糖代謝途徑合成。酯類是除醇類外含量最高的呈香物質(zhì)，并且種類最多，對提升葡萄酒香氣復雜性至關(guān)重要[21]。發(fā)酵香氣中的酯類大部分是酵母等微生物活動產(chǎn)生的中性酯，具有類似水果香氣，如淡淡的菠蘿和香蕉味[22]。酯類主要分為乙酸酯和乙基酯，乙酸酯是由高級醇和乙酰CoA經(jīng)醇乙?；D(zhuǎn)移酶催化生成，其中高級醇主要來自氨基酸代謝，乙酰CoA由丙酮酸氧化脫羧生成；乙基酯合成的底物是乙醇和?；鵆oA，由?；D(zhuǎn)移酶催化生成，主要包括丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯等[23]。葡萄酒中的酸類物質(zhì)含量較少，其主要對葡萄酒的平衡起調(diào)節(jié)作用[24]。萜烯類化合物因其感官閾值較低，具有濃郁的花香味，對葡萄酒香氣貢獻尤為突出。早期研究認為酵母細胞內(nèi)不存在萜烯物質(zhì)合成途徑，不能自身合成萜烯類化合物，但近年來出現(xiàn)了一些有關(guān)釀酒酵母菌株產(chǎn)萜烯的報道[25-26]。本實驗結(jié)果顯示釀酒酵母菌株可以合成少量萜烯類化合物，進而證實了酵母體內(nèi)存在萜烯合成途徑這一假說，但關(guān)于酵母細胞合成萜烯的具體途徑至今仍不清楚。

本研究結(jié)果表明，不同發(fā)酵條件均對模擬汁中香氣物質(zhì)的組成、含量具有顯著影響。有文獻指出增加氮源濃度能提高側(cè)鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶活性，從而使經(jīng)Ehrlich途徑生成的支鏈高級醇含量增加[27-28]，本實驗也得到類似的結(jié)果，但實驗中還發(fā)現(xiàn)隨著氮源質(zhì)量濃度增加，部分直鏈高級醇含量減少，這可能是由于增加氮源質(zhì)量濃度改變了模擬汁中的碳氮比，導致酵母細胞生長受到抑制，從而使經(jīng)糖代謝生成的直鏈高級醇含量減少。Stijn等[9]發(fā)現(xiàn)氮源濃度增加會導致醛脫氫酶活性增加，從而提高了辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯等乙基酯類的含量，這與本實驗研究結(jié)果一致。本實驗還發(fā)現(xiàn)提高氮源質(zhì)量濃度不利于萜烯類物質(zhì)的合成，這可能是因為在乙醇發(fā)酵過程中，部分葡萄糖經(jīng)糖酵解等多步酶促反應(yīng)生成的乙酰CoA可參與多種物質(zhì)合成，如進入三羧酸循環(huán)參與高級醇的合成，或直接用于合成脂肪酸或高級酯，還有一部分乙酰CoA進入甲羥戊酸途徑，參與萜烯類物質(zhì)的合成，當大量的乙酰CoA進入酯類物質(zhì)合成途徑時，進入甲羥戊酸途徑的CoA通量減少，最終可能導致萜烯物質(zhì)合成減少[27]。

溫度是目前研究最多的影響發(fā)酵進行的因素，大量研究表明，低溫發(fā)酵有利于香氣品質(zhì)的提升，這主要歸因于萜烯類物質(zhì)的積累以及C6～C10中鏈高級酯含量的增加[18]。Beltran等[29]在釀酒酵母轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)，當發(fā)酵溫度從10 ℃升高到30 ℃時，酵母細胞內(nèi)與氨基酸代謝相關(guān)基因的表達量下調(diào)，這會造成α-酮酸大量積累，進而生成更多的高級醇，但本實驗發(fā)現(xiàn)高級醇含量并非始終與發(fā)酵溫度呈正相關(guān)，當發(fā)酵溫度超過23 ℃時，高級醇含量隨發(fā)酵溫度的升高而降低，這可能是因為隨著發(fā)酵溫度的持續(xù)升高，參與高級醇合成的部分酶偏離了其最適反應(yīng)溫度，從而使高級醇合成減少。Molina等[30]研究表明較高的發(fā)酵溫度會降低揮發(fā)性酯類化合物的穩(wěn)定性，增加蒸發(fā)損失，進而減少酯類香氣物質(zhì)的積累。但也有研究指出，高溫導致蒸發(fā)損失增加并非酯類物質(zhì)香氣減少的主要原因，而是因為在每個溫度條件下酯類物質(zhì)的代謝活性與基因表達的差異所致[31]。一般來說，溫度越高，酵母發(fā)酵速度越快，發(fā)酵所需時間減少，醇類、酸類物質(zhì)大量合成，酯類、萜烯類等復雜的香氣物質(zhì)合成減少，本實驗也得到了與此類似的結(jié)果。

釀酒酵母菌株在偏中性或微酸條件下發(fā)酵能力最強，低pH值條件下酵母菌株可代謝產(chǎn)生更多的揮發(fā)酸，并且高級酯降解速度也會加快[32]，因此低pH值條件下模擬汁中大量的高級醇和酸類物質(zhì)可能來自高級酯的降解作用；隨著pH值水平的升高，高級酯降解速度減緩，酯類、萜烯類物質(zhì)合成途徑的相關(guān)酶活性提高，可積累大量的酯類、萜烯類香氣物質(zhì)，本實驗結(jié)果與此一致。實驗中發(fā)現(xiàn)隨著SO2添加量增加，萜烯類物質(zhì)含量迅速減小，這可能是因為隨著SO2添加量的升高，其對酵母細胞的毒害作用增強，酵母細胞內(nèi)的部分代謝途徑發(fā)生明顯改變[12]，導致乙酰CoA在酵母細胞內(nèi)的分配方式發(fā)生變化，使進入甲羥戊酸途徑的乙酰CoA迅速減少，最終造成萜烯類物質(zhì)合成減少；再者SO2的添加能增加模擬汁的酸度，可間接對發(fā)酵香氣產(chǎn)生影響。適量濃度的SO2具有提高乙醇體積分數(shù)，保持果香味的功能[19]，這與本實驗中高級醇、高級酯香氣含量增加的結(jié)果相符。

本實驗發(fā)現(xiàn)氮源質(zhì)量濃度變化對乙酸酯和乙基酯的影響趨勢一致，而其他3 種發(fā)酵因素對乙酸酯和乙基酯影響趨勢相反；發(fā)酵溫度對直鏈高級醇與支鏈高級醇影響趨勢一致，而其他3 種發(fā)酵因素對直鏈高級醇與支鏈高級醇影響趨勢相反，并且隨著發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量4 種發(fā)酵因素的改變，支鏈高級醇和乙酸酯變化趨勢一致，這可能是因為經(jīng)Ehrlich途徑合成的支鏈高級醇充當了乙酸酯合成的底物，因而兩者變化趨勢一致[20,23]。目前關(guān)于發(fā)酵因素對各類發(fā)酵香氣物質(zhì)合成影響的機理性研究報道較少，尤其是直鏈高級醇與支鏈高級醇、乙酸酯與乙基酯對同一發(fā)酵因素顯現(xiàn)出不同變化趨勢的研究鮮見報道，因而有待進一步探究。

4 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明，釀酒酵母菌種與氮源質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量等因素對發(fā)酵香氣的影響差異較大。實驗所選的5 株釀酒酵母中LA-FR菌株產(chǎn)酯類、萜烯類物質(zhì)能力最強，產(chǎn)香性能優(yōu)于其他4 株酵母。此外，氮源質(zhì)量濃度、發(fā)酵溫度、pH值、SO2添加量對發(fā)酵香氣影響的結(jié)果顯示，較低的氮源條件下發(fā)酵有利于萜烯類和醇類物質(zhì)的生成，不利于酯類物質(zhì)的積累，并且氮源對醇類和酯類香氣含量影響較大；選擇較低的發(fā)酵溫度有利于酯類、萜烯類物質(zhì)積累，發(fā)酵溫度對酸類香氣物質(zhì)含量影響較大；在較高pH值條件下發(fā)酵的模擬汁中酯類、萜烯類物質(zhì)含量明顯增加，醇類、酸類物質(zhì)含量減少；SO2添加量與醇類、酯類合成量呈正相關(guān)，與酸類、萜烯類合成量呈負相關(guān)，且SO2的添加量對萜烯類香氣含量影響較大。

在發(fā)酵過程中，同一發(fā)酵因素對不同種類香氣物質(zhì)的影響不同，且不同發(fā)酵因素對同一種類香氣物質(zhì)的影響也不相同，所以在實際生產(chǎn)過程中，發(fā)酵香氣的調(diào)控應(yīng)考慮多個因素，并且不同因素間可能還會存在交互作用，因此，本實驗所得結(jié)果可為葡萄酒香氣風味調(diào)控以及深入研究復合因素作用對發(fā)酵香氣的影響提供理論支持。