高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定配方食品中的VB12

劉 杰，龔 蕾，朱曉玲*，彭青枝，張 莉，周陶鴻，江 豐，黃 茜，張小玲

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070）

VB12又稱(chēng)鈷胺素，是一種由含鈷的卟啉類(lèi)化合物組成的B族維生素，對(duì)維持人體基本機(jī)能具有重要的作用[1-2]。VB12無(wú)法在人體內(nèi)合成，且?guī)缀醪淮嬖谟谥参镄允称分衃3]，因此，人體只能從動(dòng)物性食物中獲得。由于人們的飲食結(jié)構(gòu)變化，素食主義者增多[4]，導(dǎo)致部分居民出現(xiàn)膳食營(yíng)養(yǎng)不平衡問(wèn)題，市面上由此大量涌現(xiàn)各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食品、保健食品等配方食品，在其中人為添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)VB12，以滿(mǎn)足部分人群補(bǔ)充VB12的需求。但目前許多保健食品B族維生素片所添加的VB12含量并不規(guī)范，VB12過(guò)量攝入會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的毒副作用[5]，必須規(guī)范控制這類(lèi)產(chǎn)品中VB12的使用量，并對(duì)其中的VB12含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

對(duì)于VB12的檢測(cè)，至今仍然是國(guó)際上食品分析的難題之一。原因主要有兩點(diǎn)：一是動(dòng)物性食品中的VB12存在氰鈷胺、羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲基鈷胺等多種結(jié)構(gòu)形式[6]，傳統(tǒng)的分析方法很難反映樣品中VB12的實(shí)際含量，通常需要采用氰化鉀或氰化鈉等劇毒試劑將鈷胺素異構(gòu)體（羥鈷胺素、甲鈷胺素和5-脫氧腺苷鈷胺素等）轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的氰鈷胺素后再進(jìn)行分析檢測(cè)，而目前尚未尋找到合適的劇毒試劑替代物，因此方法的適用性受限，難以推廣；二是VB12在食品中的含量極低，一般為10－9級(jí)，在強(qiáng)化食品中按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求也僅約0.6～70 μg/kg[7]，對(duì)分析方法的檢測(cè)靈敏度具有較高的要求。另外，VB12通常以VB12-內(nèi)因子復(fù)合物的形式存在，充分提取和分離難度很大，樣品中其他化合物以及與VB12相近的水溶性維生素也會(huì)對(duì)其分離檢測(cè)造成干擾。

目前，食品中VB12檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要有GB 5413.14—2010《嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測(cè)定》[8]和GB/T 5009.217—2008《保健食品中維生素B12的測(cè)定》[9]，所采用的方法為微生物法和液相色譜法，微生物法檢測(cè)VB12的優(yōu)勢(shì)在于具有較高的靈敏度，但缺點(diǎn)主要為其操作過(guò)程較繁瑣，對(duì)人員的技術(shù)要求較高，且檢測(cè)耗時(shí)，測(cè)定周期需要3 d；液相色譜法主要可用于VB12添加量較高的保健食品的檢測(cè)，對(duì)于低含量食品的檢測(cè)則受到儀器靈敏度的限制。另外，文獻(xiàn)報(bào)道的VB12的檢測(cè)方法還有原子吸收法[10]、毛細(xì)管電泳法[11-12]、酶聯(lián)免疫法[13-14]、電化學(xué)發(fā)光法[15]、電化學(xué)傳感器法[16]、液相色譜法[4,17-19]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[20-23]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[5,24]等，各個(gè)方法均存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)，且大多數(shù)方法主要針對(duì)部分基質(zhì)進(jìn)行方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。本研究主要考慮VB12作為一種在食品中應(yīng)用較普遍的強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)素，各種VB12強(qiáng)化配方食品及相關(guān)的保健食品均需檢測(cè)該指標(biāo)，不必將嬰幼兒食品、乳品、保健食品及其他配方食品等基質(zhì)分開(kāi)建立檢測(cè)方法。而建立適合各類(lèi)配方食品中VB12測(cè)定的通用分析方法，難點(diǎn)在于各類(lèi)食品中VB12的含量范圍差異較大。因此本研究借助高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry，HPLC-ICP-MS）聯(lián)用技術(shù)的高靈敏度與寬線(xiàn)性范圍優(yōu)勢(shì)，建立適用于各種配方食品中VB12測(cè)定方法。由于VB12的不同結(jié)構(gòu)形式的穩(wěn)定性各不同，其中氰鈷胺素相較于其他幾種形態(tài)（羥鈷胺、腺苷鈷胺和甲基鈷胺等）更為穩(wěn)定，配方食品中用于營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化的VB12幾乎均為氰鈷胺素，因此，直接測(cè)定氰鈷胺素的含量，就能反映營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化配方食品中VB12的添加水平，無(wú)需使用氰化鉀或氰化鈉等劇毒試劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。本方法基于VB12結(jié)構(gòu)中含有鈷元素，通過(guò)測(cè)定鈷的含量間接反映樣品中VB12（氰鈷胺素）的含量，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，本方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、線(xiàn)性范圍廣，適用于各種配方食品中VB12的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿(mǎn)意，在日常檢測(cè)方面存在一定的優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

強(qiáng)化VB12的果汁飲料、谷物制品、含乳飲料、保健品 市售。

VB12（氰鈷胺素） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙酸銨（色譜純） 上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純） 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；鹽酸、三氯乙酸（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所有用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

DIONEX UltiMate 3000液相色譜儀、iCAP Q ICP-MS儀及工作站 美國(guó)賽默飛世爾儀器公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器 美國(guó)Millipore公司；SB25-12DTS雙頻超聲波清洗器 廣州市鵬鑫科學(xué)儀器有限公司；ME204電子平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MS3 Digital渦旋儀德國(guó)IKA公司；Centrifuge 5810離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司；0.22 μm水相濾膜 天津津騰公司；Oasis HLB柱（6 mL，500 mg） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC條件

Thermo Fisher Hypersil GOLD C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流動(dòng)相：A為8 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇（81∶19，V/V）溶液，等度洗脫，流速為0.4 mL/min；柱溫24 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 ICP-MS條件

選擇Co-59作為定量元素，采用KED模式，經(jīng)調(diào)諧儀器主要參數(shù)如表1所示。

表1 ICP-MS條件Table 1 ICP-MS experimental conditions

1.3.3 樣品前處理

谷物制品：稱(chēng)取試樣5 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入25 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液，渦旋混勻1 min，超聲15 min，3 900 r/min離心15 min。取上清液置于50 mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，待凈化。

含乳飲料：稱(chēng)取試樣10 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入10 mL 40 g/L三氯乙酸溶液，渦旋混勻1 min，超聲15 min，3 900 r/min離心15 min。取上清液置于50 mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，待凈化。

保健品：稱(chēng)取試樣0.5 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入25 mL 0.01 mol/L鹽酸溶液，渦旋混勻1 min，超聲15 min，3 900 r/min離心15 min。取上清液置于50 mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，待凈化。

1.3.4 樣品凈化

將待凈化液通過(guò)已活化的固相萃取柱（分別用5 mL甲醇和5 mL水預(yù)淋洗活化），用5 mL 7%乙腈溶液將干擾物質(zhì)從固相萃取柱上淋洗下來(lái)，最后用3.0 mL 25%乙腈溶液將目標(biāo)化合物洗脫，收集全部洗脫液，根據(jù)含量稀釋洗脫液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，待檢測(cè)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Qtegra、MultiQuant 3.0.2軟件處理數(shù)據(jù)，采用Origin 8.0、Microsoft Excel 2010軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的可行性

HPLC-ICP-MS法測(cè)定樣品中VB12的含量，主要是基于VB12結(jié)構(gòu)中含有鈷元素，通過(guò)測(cè)定樣品中鈷的含量間接推算出VB12的含量。但樣品中的鈷除來(lái)源于VB12，也有可能來(lái)源于樣品中的含鈷雜質(zhì)以及游離鈷，原子吸收法以及ICP-MS法只能對(duì)樣品中的總鈷進(jìn)行測(cè)定，由于沒(méi)有進(jìn)行有效分離，檢測(cè)結(jié)果較容易受到樣品中無(wú)機(jī)鈷元素的影響而造成測(cè)定結(jié)果比實(shí)際值高。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ICP-MS法，首先對(duì)樣品進(jìn)行HPLC分離，色譜柱選用C18柱，樣品中的游離鈷離子在C18色譜柱中不保留，從柱中很快洗脫下來(lái)，然后通過(guò)選擇合適的流動(dòng)相，將樣品中的其他非VB12的含鈷雜質(zhì)與VB12目標(biāo)物有效分離，再進(jìn)行ICP-MS測(cè)定。如圖1所示，在45、98 s和270 s均有鈷離子響應(yīng)，根據(jù)VB12標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間進(jìn)行定性，270 s處的色譜峰即為目標(biāo)鈷離子色譜峰，樣品經(jīng)HPLC分離后可較好地去除樣品中的含鈷雜質(zhì)及游離鈷對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾，并保證檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，這與文獻(xiàn)[25]分析結(jié)果一致。

圖1 VB12標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖（10 μg/L）（A）與樣品溶液（B）譜圖Fig. 1 Chromatograms of VB12 standard solution (10 μg/L) (A) and sample solution (B)

2.2 HPLC條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)選用C18色譜柱進(jìn)行樣品分離，其流動(dòng)相中通常會(huì)加入一定比例的有機(jī)溶劑以保護(hù)色譜柱，防止柱填料變性。但在ICP-MS中，有機(jī)溶劑的使用可能會(huì)導(dǎo)致采樣錐錐口處產(chǎn)生碳積，影響儀器的信號(hào)穩(wěn)定性，高濃度的有機(jī)溶劑還會(huì)導(dǎo)致離子源熄火，影響實(shí)驗(yàn)效率并增加儀器的維護(hù)成本。雖然有相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明[26]，外加氧氣可以帶走碳，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致儀器靈敏度下降。因此，本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格控制流動(dòng)相中有機(jī)相的比例，比較流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)分別為15%、19%、23%時(shí)，對(duì)VB12的分離效果的影響，得到對(duì)比色譜圖見(jiàn)圖2A。當(dāng)流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)為19%時(shí)，VB12在270 s出峰，峰形對(duì)稱(chēng)且尖銳；當(dāng)流動(dòng)相甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)調(diào)整為15%時(shí)，VB12在色譜柱中的保留性明顯增強(qiáng)，保留時(shí)間延長(zhǎng)至750 s；增加流動(dòng)相中甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)至23%時(shí)，VB12在150 s出峰，峰形保持對(duì)稱(chēng)尖銳，且儀器的靈敏性沒(méi)有降低，碳滯留問(wèn)題沒(méi)有出現(xiàn)。因此，在保證儀器靈敏度以及信號(hào)穩(wěn)定性的前提下，應(yīng)盡量選擇低有機(jī)相比例的流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但綜合考慮分析效率，本實(shí)驗(yàn)最終選擇19%甲醇溶液作為流動(dòng)相中的有機(jī)相。

另外，比較水、8 mmol/L乙酸銨溶液、8 mmol/L乙酸銨溶液（pH 5.0）作為水相流動(dòng)相時(shí)，對(duì)VB12分離效果的影響，見(jiàn)圖2B。水相流動(dòng)相中引入8 mmol/L乙酸銨后VB12的峰形稍有改善，經(jīng)測(cè)定，8 mmol/L乙酸銨溶液的pH值約為6.2。有研究報(bào)導(dǎo)[27]，VB12在pH 4.5～5.0弱酸條件下最穩(wěn)定，流動(dòng)相pH值會(huì)改變VB12的色譜行為。但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將流動(dòng)相pH值調(diào)至5.0時(shí)，VB12的響應(yīng)和峰形幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，通過(guò)48 h穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值前后VB12在儀器上的響應(yīng)沒(méi)有明顯變化，表明流動(dòng)相pH值為6.2或5.0時(shí)，VB12的穩(wěn)定性沒(méi)有明顯改變，因此，最終選擇以8 mmol/L的乙酸銨作為流動(dòng)相的水相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同甲醇比例流動(dòng)相（A）和水相流動(dòng)相（B）對(duì)VB12分離效果的對(duì)比圖譜Fig. 2 Comparative separation of VB12 using different mobile phasesconsisting of methanol (A) and water phase (B)

2.3 樣品凈化的影響

由于食品基質(zhì)復(fù)雜，研究者通常采用樹(shù)脂吸附法、透析法、免疫親和柱、固相萃取柱法等手段進(jìn)行樣品凈化，其中固相萃取法以操作簡(jiǎn)單、高效、可靠、消耗試劑少等優(yōu)點(diǎn)備受青睞，在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本研究比較了實(shí)際樣品提取液經(jīng)HLB固相萃取柱處理和不經(jīng)HLB固相萃取柱處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表2，相應(yīng)的對(duì)比圖譜見(jiàn)圖3。

表2 凈化對(duì)HPLC-ICP-MS檢測(cè)結(jié)果的影響Table 2 Effect of puri fi cation on the results of HPLC-ICP-MS

圖3 樣品凈化前（A）、后（B）對(duì)比圖譜Fig. 3 Comparative chromatogram of sample before (A) and after (B) purification

由表2可知，樣品提取液是否過(guò)柱對(duì)HPLC-ICP-MS測(cè)定VB12的結(jié)果幾乎無(wú)影響。圖3顯示，樣品提取液不過(guò)固相萃取柱也能在HPLC-ICP-MS上有較好響應(yīng)，且與雜質(zhì)能完全分離。但考慮到提取液過(guò)固相萃取柱后，能夠有效降低樣品中其他雜質(zhì)的干擾，為減少雜質(zhì)對(duì)色譜柱的損害作用，本實(shí)驗(yàn)選擇采用HLB固相萃取小柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系和檢出限結(jié)果

配制一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.3節(jié)的儀器分析條件下進(jìn)行測(cè)定，得出VB12在0.1～500 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為y=13 549x＋2 782，相關(guān)系數(shù)為0.999。采用空白樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)確定檢出限，逐級(jí)稀釋至樣品溶液中目標(biāo)峰響應(yīng)為3 倍信噪比時(shí)確定VB12的檢出限為0.02 μg/kg。

2.4.2 回收率和精密度結(jié)果

選取不同基質(zhì)、混合均勻的VB12陽(yáng)性樣品，分別對(duì)樣品進(jìn)行3 個(gè)水平的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6 次，按照1.3.3節(jié)樣品前處理方法制備供試品溶液，按儀器條件進(jìn)行分析，測(cè)定VB12的含量，并計(jì)算相應(yīng)的回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。果汁飲料回收率為96.0%～103.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.4%～2.8%；谷物制品回收率為81.3%～93.2%，RSD為1.4%～3.0%；含乳飲料回收率為84.0%～94.0%，RSD為0.9%～2.7%；保健品回收率為90.7%～103.3%，RSD為3.2%～4.6%，表明方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性良好，能應(yīng)用于不同基質(zhì)的配方食品中VB12的檢測(cè)分析。

表3 食品中VB12的回收率和RSD（n= 6）Table 3 Recovery and repeatability (RSD) for VB12 from different spiked samples (n= 6)

2.4.3 儀器及標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按儀器條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，并計(jì)算RSD。得到標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積RSD小于0.10%，保留時(shí)間RSD小于1.0%，表明儀器精密度良好。

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在儀器條件下，分別在0、1、2、4、8、12、24、36、48 h進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積和保留時(shí)間為對(duì)象，計(jì)算RSD小于2.0%，表明標(biāo)準(zhǔn)溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 本方法與其他分析方法的比較

目前，已有檢測(cè)方法存在問(wèn)題如下：微生物法靈敏度高，但操作步驟繁瑣、分析時(shí)間長(zhǎng)，較為耗時(shí)；分光光度法、毛細(xì)管電泳法、HPLC法均不能用于食品中的微量或痕量VB12的測(cè)定分析；原子吸收光譜法，ICP-MS法測(cè)定VB12的原理也是通過(guò)測(cè)定鈷元素含量間接反映VB12含量，但這些方法容易受到樣品中無(wú)機(jī)鈷及其他含鈷雜質(zhì)的影響而造成測(cè)定結(jié)果比實(shí)際值高；酶聯(lián)免疫法選擇性好、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性通常需要儀器分析法進(jìn)一步驗(yàn)證。研究表明，HPLC-MS/MS法測(cè)定VB12，操作簡(jiǎn)單、靈敏度準(zhǔn)確度高，方法可靠，是目前較為主流的分析手段。因此，將本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-ICP-MS方法與HPLC-MS/MS法進(jìn)行比較，通過(guò)重復(fù)測(cè)試同一實(shí)驗(yàn)樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。

將2.3節(jié)中處理的未經(jīng)固相萃取小柱凈化和經(jīng)固相萃取小柱凈化的樣品溶液于HPLC-MS/MS上進(jìn)行檢測(cè)。從表4可以看出，樣品提取液是否凈化對(duì)HPLC-MS/MS的測(cè)定結(jié)果有較大影響，樣品1和樣品2不經(jīng)HLB小柱凈化所測(cè)結(jié)果明顯低于經(jīng)HLB小柱凈化后所測(cè)結(jié)果，表明樣品基質(zhì)對(duì)于HPLC-MS/MS的檢測(cè)結(jié)果具有一定的影響。將表2與表4進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)HLB小柱凈化處理后，2 種檢測(cè)方法的測(cè)定結(jié)果基本一致，表明HPLC-ICP-MS方法的抗基質(zhì)干擾能力要優(yōu)于HPLC-MS/MS法。由于大多數(shù)產(chǎn)品中VB12的含量均較低，且食品基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，對(duì)于此類(lèi)樣品的分析，選擇抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)的HPLC-ICP-MS方法進(jìn)行測(cè)定具有一定的優(yōu)勢(shì)，且目前HPLC與ICP-MS聯(lián)用技術(shù)已較為成熟，相關(guān)的應(yīng)用報(bào)道[28-31]也較多，此聯(lián)用儀器也逐漸普遍化，可以采用此方法進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品中VB12含量的分析檢測(cè)以及質(zhì)量控制。

表4 凈化對(duì)HPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果的影響Table 4 Effect of puri fi cation on the results of HPLC-MS/MS

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

應(yīng)用建立的方法對(duì)購(gòu)自超市的強(qiáng)化VB12的配方食品（果汁飲料、谷物制品、含乳飲料和保健品）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明不同果汁飲料中VB12的含量在0.52～1.14 μg/kg之間，部分標(biāo)示為功能性飲料中的VB12含量高達(dá)15.83 μg/kg；谷物制品中VB12的含量在10.85～12.24 μg/kg之間；含乳飲料中VB12的含量在0.68～0.94 μg/kg之間；保健品中VB12的含量較高，測(cè)定值為3 049.15 μg/kg，折算后保健品中VB12的含量為4.57 μg/片。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同基質(zhì)的配方食品中VB12含量的測(cè)定方法進(jìn)行研究，借助于HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術(shù)的高靈敏度與寬線(xiàn)性范圍優(yōu)勢(shì)，建立了適用于各種配方食品基質(zhì)中VB12含量測(cè)定的HPLC-ICP-MS法。通過(guò)方法優(yōu)化，得出VB12的方法檢出限為0.02 μg/kg，靈敏度高、峰形較好、分析時(shí)間短，可用于實(shí)際樣品的分析檢測(cè)。